一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102304571 A (43)申请公布日 2012.01.04 CN 102304571 A *CN102304571A* (21)申请号 201110237715.5 (22)申请日 2011.08.18 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/14(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) G01N 15/14(2006.01) (71)申请人新疆生产建设兵团医院地址 830002 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市青年路 232 号新疆生产建设兵团医院 (72)发明人张新马集云吴良苗书魁唐金路陈旭鹿新红 (74)专利代理机。

2、构乌鲁木齐新科联专利代理事务所 ( 有限公司 ) 65107 代理人欧咏 (54) 发明名称一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法 (57) 摘要本发明提供的一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法， 1）针对金黄色葡萄球菌 ATCC25923 的 16SrRNA 的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针 MB，其碱基组成为： 5 -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3 ，其中 5端用 FAM 标记， 3端用 DABCYL 标记，荧光基团激发波长 495nm，检测波长 520nm ；并设计出与分子信标。

3、完全互补的寡核苷酸（P ： 5 -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3 ）； 2）通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为 50，计算分子信标 S/B 值； 3）用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定去离子甲酰胺的浓度为 10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为 20x105cfu/l，分子信标的浓度为 10ng/l。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 4 页序列表 2 页附图 1 页 CN 102304577 A1/1 页 2 1. 一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其。

4、特征在于： 1）针对金黄色葡萄球菌 ATCC25923 的 16SrRNA 的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针 MB，其碱基组成为： 5 -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT -DABCYL-3 ，其中 5端用 FAM 标记， 3端用 DABCYL 标记，荧光基团激发波长 495nm，检测波长 520nm ；并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（P ： 5 -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3 ）； 2）通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为 50，计算分子信标 S/B 值； 3）用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定去离子甲。

5、酰胺的浓度为 10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为 20x105cfu/l，分子信标的浓度为 10 ng/l ；其中将金黄色葡萄球菌 ATCC25923 接种于哥伦比亚血琼脂平板培养，挑取对数生长期的菌落，用无菌的 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液调至 20x105cfu/l 浓度；其 1 菌体制备：吸取 20x105cfu/l 的金黄色葡萄球菌 2ml， 10000 rpm 离心 5 min，收集菌体；加入 6ml 固定液，固定液为 4% 多聚甲醛 +96% 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 ； 4 固定 1h ；离心 1000。

6、0 rpm， 5 min，除去残留的多聚甲醛；用 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液洗涤 1 次，得菌体沉淀物；其 2 酶处理：向上述的菌体沉淀物中加入 1mg/ml 溶葡萄球菌酶 100 l， 37， 15 min ；收集菌体 10000 rpm， 5 min ；分别用 50%、 80%、 95% 乙醇脱水 3min ；用 20 l 20 mM Tris-HCl 缓冲液重悬菌体，平均加入 2 个管中备用；其 3 配制杂交缓冲液：在 EP 管中加入 10l100 ng/l 的 MB 和 10l100% 的去离子甲酰胺后，用 20 mM Tr。

7、is-HCl 补足至 100l ；对照缓冲液：在 EP 管中加入 10l100% 的去离子甲酰胺后，用 20 mM Tris-HCl 缓冲液补足至 100l，备用；其 4 杂交：经酶处理的产物一管作为阳性，加入 100l 杂交缓冲液；另一管作为阴性对照，加入 100l 阴性对照缓冲液； 2 个管置于 50 ，避光杂交 2h， 2 个管分别收集菌体 10000 rpm， 5 min ； 2个管分别加入不含探针的100 l缓冲液，于48 洗涤15min ； 2个管分别重悬于 500l 缓冲液中，置于冰上， 3h 内取样，过滤后测定。 2. 根据权利要求 1。

8、所述的方法，其特征在于：分子信标的浓度为 1 OD 的分子信标质量数为 32.68ug，在管中加入 327 l 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液溶解，则配成浓度为 100 ng/l 的母液贮存。 3. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：分子信标 S/B 值的计算： S/B =F open-F buffer/F closed-F buffer。 4. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所用的分子信标及寡核苷酸序列，由上海生工生物工程有限公司合成；多聚甲醛、 20 mM Tris-HCl、去离子甲酰胺和溶葡萄球菌酶 lyso。

9、staphin 7386 均购自 Sigma ；哥伦比亚血琼脂平板购自郑州安图绿科生物工程有限公司。权利要求书 CN 102304571 A CN 102304577 A1/4 页 3 一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法技术领域 0001 本发明涉及分子信标，即荧光原位杂交信号经流式细胞仪高灵敏识别，直接定量检测到病人分泌物标本中低含量的金黄色葡萄球菌，同时也适用于阳性血培养物中金黄色葡萄球菌的快速定量检测。背景技术 0002 目前国内外金黄色葡萄球菌的检测多采用传统的培养法以及分子生物学技术 1。然而，培养法耗时长，需 1-4 天，不利于感染性疾病。

10、的早期诊断以及医院或社区获得性感染的预防与控制。尽管 PCR 方法能够快速、特异性检测金黄色葡萄球菌，但实验室扩增产物污染以及病人标本中可能存在有未知的酶抑制剂等问题难以克服，及时采用荧光原位杂交检测方法也不能直接用于分泌物标本中金黄色葡萄球菌的检测，因此，分子生物学的方法在临床试验室的应用受到一定程度的限制。分子信标（Molecular beacon， MB）由于其特异性强、灵敏度高并可在均相溶液中与靶核酸分子进行杂交等特点而在荧光原位杂交技术中得到应用 3。 0003 文献检索披露： PCR和FISH技术用于金黄色葡萄球菌的检测已有多篇报道 1-6，这些技。

11、术方法的建立能够对病人分泌物标本以及阳性血培养物中的金黄色葡萄球菌进行快速检测。但是 PCR 方法容易造成扩增产物污染，这使得金黄色葡萄球菌在临床实验室的检测受到了一定程度的限制。目前，在已报道的多种用于检测金黄色葡萄球菌的 FISH 技术均是采用线形探针进行杂交检测，并且所检测的标本均来源于血培养瓶中的阳性培养物。这种情况存在 2 个缺点：一是线形探针不能用于均相溶液中靶分子的检测，因此，在杂交检测时必须进行标本的固定或者对探针进行固定，杂交反应完成后必须进行严格的冲洗以去除未杂交的探针，否则荧光背景信号高；二是病人分泌物标本中的金黄色葡萄球菌的含量低，不。

12、能对这样的标本进行直接检测，因此， FISH的应用受到了限制。本发明将分子信标可在均相溶液中对靶分子进行杂交检测的特点与流式细胞仪高分辨、高灵敏度识别荧光染色细胞的特点相结合快速对病人分泌物标本及阳性血培养物中金黄色葡萄球菌进行荧光原位杂交检测。分子信标荧光原位杂交反应体系的建立首先简化了 FISH 的操作步骤，无需对标本或探针进行固定，也不用对未杂交的探针进行冲洗去除，杂交检测可一步完成，最大限度地降低了干扰因素对实验的影响；其次流式细胞分析仪可以高灵敏度定量识别荧光染色的细胞，不但能直接定量检测病人分泌物标本中低含量细菌，而且能够对阳性血培养物中完整的活。

13、细胞进行定量检测，克服了目前 FISH 不能用于分泌物标本中低含量细菌检测的局限。 0004 本发明针对金黄色葡萄球菌特异性的 16SrRNA 片断，设计、合成分子信标探针，建立稳定的分子信标荧光原位杂交反应体系，克服了培养法耗时长以及目前分子生物学技术检测的诸多问题，为金黄色葡萄球菌感染性疾病的早期诊断以及医院或社区获得性感染的预防、控制提供新的快速检测方法。发明内容说明书 CN 102304571 A CN 102304577 A2/4 页 4 0005 本发明的目的在于：利用荧光原位杂交 - 流式细胞术法，建立一种快速、灵敏、特异检测病人分泌物标本。

14、以及阳性血培养物中低含量金黄色葡萄球菌的方法。 0006 本发明的目的是这样实现的：一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤： 1）针对金黄色葡萄球菌 ATCC25923 的 16SrRNA 的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针 MB，其碱基组成为： 5 -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3 ；荧光基团激发波长 495nm，检测波长 520nm ；同时设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（P ： 5 -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3 ）； 2）通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为 50，计算分。

15、子信标 S/B 值； 3）用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定的反应体系，即去离子甲酰胺的浓度为 10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为 20x105cfu/l，分子信标的浓度为 10 ng/l。 0007 本发明的技术要点或原理：荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）技术是一种应用非放射性荧光物质标记的核酸探针根据杂交原理检测细胞或组织内特定 DNA 或 RNA 的方法， 1996 年 Tyagi 和 Kramer1首次报道了一种可以实时监测 PCR 反应产物扩增过程的新型荧光标记探针。

16、，即分子信标，与众多用于荧光原位杂交技术的核酸探针不同的是分子信标具有独特的空间 “发夹” 结构，在未结合靶分子时，分子信标呈 “发夹” 结构，有一个环序列（loop）与一茎序列（stem），其中环是与靶分子互补的核酸碱基序列，茎为两列与靶分子杂交无关的互补碱基序列，在探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，当探针处于完整的 “发夹” 结构时，荧光基团和淬灭基团由于茎序列的互补结合而彼此紧密相邻，从而产生荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer， FRET）效应，导致荧光信号被有效淬灭而不能释放。

17、出来，当探针与互补的靶分子结合时，分子信标的 “发夹” 结构被打开，荧光基团和淬灭基团彼此分离，荧光信号不能被淬灭而得以释放，本发明中流式细胞仪能够检测到杂交后的荧光信号，从而检测到金黄色葡萄球菌，彰显技术进步。附图说明 0008 本发明对照附图作进一步的阐明附图为分子信标热变性曲线图；如图所示：上曲线为分子信标与完全互补的寡核苷酸杂交曲线，对应荧光强度值即 F open ；中间曲线为分子信标随温度变化的曲线，对应荧光强度值即 F closed ；下曲线为缓冲液随温度变化的曲线，对应荧光强度值即 F buffer。 0009 具体实施方式实施例 0。

18、010 (1) 分子信标及寡核苷酸序列的设计与合成针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16S rRNA序列，设计出能特异地检测金黄色葡萄球菌的分子信标（5 -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3 ）及与其完全互补的寡核苷酸（P ： 5 -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3 ）。说明书 CN 102304571 A CN 102304577 A3/4 页 5 0011 (2) 通过对分子信标做热变性曲线实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为 50，计算分子信标 S/B（Signal-to-background ratio， S/B。

19、）值： S/B =(F open-F buffer)/(F closed-F buffer) ；（3）选择出能特异性地检测金黄色葡萄球菌的靶序列，在该段靶序列上用 beacon designer2.1软件设计与其完全互补的分子信标探针（5 -FAM-cgctgaAGAAGCAAGCTTCTCGTC CGTtcagcg-DABCYL-3 ），该分子信标是由碱基组成的颈环结构的特异序列，其中5 端用FAM 标记， 3 端用 DABCYL 标记，荧光基团要求激发波长 495nm，检测波长 520nm ；人工设计合成分子信标及与其完全互补的寡核苷酸。 0012 （4） 3 种溶。

20、液在 PCR 反应管中配制后置于荧光定量 PCR 仪中，温度从 80下降到说明书 CN 102304571 A CN 102304577 A4/4 页 6 30，温度每降低 1采集一次荧光 ; 将 3 种溶液从 80下降到 30的荧光强度做散点图即为 MB 的热变性曲线 ; 从热变性曲线图看出，温度在 45-55内时， MB 与完全互补的寡核苷酸杂交稳定，荧光强度较高； MB 随温度降低，曲线较平缓，说明荧光强度较稳定 ; 当温度在 50时， MB 与完全互补的寡核苷酸杂交的荧光强度最高，因此可确定最佳的杂交温度为 50 ；并计算出 S/B 值，由表 1 可见实。

21、验 6 中 S/B 值最高，说明该组为最佳反应体系。 0013 （5）按照表 2 配制杂交溶液，用流式细胞仪进行荧光原位杂交，比较实验结果 ( 阳性标本的荧光值减去阴性对照的荧光值 ), 可确定最佳反应体系是第 2 组 , 即去离子甲酰胺的浓度为 10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为 20x105cfu/l，分子信标的浓度为 10 ng/ l ；（6）获取金黄色葡萄球菌的菌液：将金黄色葡萄球菌 ATCC25923 接种于哥伦比亚血琼脂平板培养，挑取对数生长期的菌落，用无菌的 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液调至 20x105cfu/l 浓度；。

22、其 1 菌体制备：吸取 20x105cfu/l 的金黄色葡萄球菌 2ml， 10000 rpm 离心 5 min，收集菌体；加入 6ml 固定液，固定液为 4% 多聚甲醛 +96% 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 ； 4 固定 1h ；离心 10000 rpm， 5 min，除去残留的多聚甲醛；用 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液洗涤 1 次，得菌体沉淀物；其 2 酶处理：向上述的菌体沉淀物中加入 1mg/ml 溶葡萄球菌酶 100 l， 37， 15 min ；收集菌体 10000 rpm， 5 min ；分别用 50%、。

23、 80%、 95% 乙醇脱水 3min ；用 20 l 20 mM Tris-HCl 缓冲液重悬菌体，平均加入 2 个管中备用；其 3 配制杂交缓冲液：在 EP 管中加入 10l 100 ng/l 的 MB 和 10l100% 的去离子甲酰胺后，用 20 mM Tris-HCl 补足至 100l ；对照缓冲液：在 EP 管中加入 10l100% 的去离子甲酰胺后，用 20 mM Tris-HCl 缓冲液补足至 100l，备用；其 4 杂交：经酶处理的产物一管作为阳性，加入 100l 杂交缓冲液；另一管作为阴性对照，加入 100l 阴性对照缓冲液；。

24、 2 个管置于 50 ，避光杂交 2h， 2 个管分别收集菌体 10000 rpm， 5 min ； 2个管分别加入不含探针的100 l缓冲液，于48 洗涤15min ； 2个管分别重悬于 500l 缓冲液中，置于冰上， 3h 内取样，过滤后测定。 0014 （7）分子信标的浓度为 1 OD 的分子信标质量数为 32.68ug，在管中加入 327 l 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液溶解，则配成浓度为 100 ng/l 的母液贮存。 0015 （8）上述的分子信标及寡核苷酸序列，由上海生工生物工程有限公司合成；多聚甲醛、 20 mM Tris-HC。

25、l、去离子甲酰胺和溶葡萄球菌酶 lysostaphin 7386 均购自 Sigma ；哥伦比亚血琼脂平板购自郑州安图绿科生物工程有限公司。说明书 CN 102304571 A CN 102304577 A1/2 页 7 针对金黄色葡萄球菌的 16SrRNA 片断，在 GeneBank 中，金黄色葡萄球菌 EU807758 的 16SrRNA 序列如下： LOCUS EU807758 1430 bp DNA linear BCT 06-JUL-2008 DEFINITION Staphylococcus aureus strain X13 16S ribosomal RNA 。

26、gene, partial sequence. ACCESSION EU807758 VERSION EU807758.1 GI:193299694 KEYWORDS . SOURCE Staphylococcus aureus ORGANISM Staphylococcus aureus Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Staphylococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 1430) AUTHORS Zhao,L. and Chen,C. TITLE Molecular taxonomic study on Staphylococ。

27、cus aureus JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1430) AUTHORS Zhao,L. and Chen,C. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (07-JUN-2008) Chemical and Enviomental Engineering, Beijing Technology and Business University, Fucheng Road 11, Haidian District, Beijing 100037, China FEATURES Locatio。

28、n/Qualifiers source 11430 /organism=“Staphylococcus aureus“ /mol_type=“genomic DNA“ /strain=“X13“ /isolation_source=“sausage“ /db_xref=“taxon:1280“ rRNA 1430 /product=“16S ribosomal RNA“ 1 acatgcaagt cgagcgaacg gacgagaagc ttgcttctct gatgttagcg gcggacgggt 61 gagtaacacg tggataacct acctataaga ctgggataa。

29、c ttcgggaaac cggagctaat 121 accggataat attttgaacc gcatggttca aaagtgaaag acggtcttgc tgtcacttat 181 agatggatcc gcgctgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaacgatgc 241 atagcccacc tgagagggtg atcggccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac 301 gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat gggcgaaagc ctgacggagc aacgccg。

30、cgt 361 gagtgatgaa ggtcttcgga tcgtaaaact ctgttattag ggaagaacat atgtgtaagt 序列表 CN 102304571 A CN 102304577 A2/2 页 8 421 aactgtgcac atcttgacgg tacctaatca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc 481 cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgtagg 541 cggtttttta agtctgatgt gaaagcccac ggctca。

31、accg tggagggtca ttggaaactg 601 gaaaacttga gtgcagaaga ggaaagtgga attccatgtg tagcggtgaa atgcgcagag 661 atatggagga acaccagtgg cgaasgcgac tttctggtct gtaactgacg ctgatgtgcg 721 aaagcgtggg gatcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg 781 ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cact。

32、ccgcct 841 ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg 901 gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caaatcttga catcctttga 961 caactctaga gatagagctt tccccttcgg gggacaaagt gacaggtggt gcatggttgt 1021 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttaagctt 1081 agttgcc。

33、atc attaagttgg gcactctaag ttgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1141 ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgatttgggc tacacacgtg ctacaatgga 1201 caatacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtc aagcaaatcc cataaagttg ttctcagttc 1261 ggattgtagt ctgcaactcg actacatgaa gctggaatcg ctagtaatcg tagatcagca 1321 tgctacggtg aatacgttcc c。

34、gggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg 1381 taacacccga agccggtgga gtaaccttta ggagctagcc gtcgaagttg 本发明以金黄色葡萄球菌 ATCC25923 的 16SrRNA 的片断为靶序列，人工设计分子信标探针 MB，其碱基组成为： 5 -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT -DABCYL-3 并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（P ： 5 -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3 ）。序列表 CN 102304571 A CN 102304577 A1/1 页 9 图 1 说明书附图 CN 102304571 A 。

摘要
申请专利号：	CN201110237715.5	申请日：	2011.08.18
公开号：	CN102304571A	公开日：	2012.01.04
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20120104\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20110818\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68; C12Q1/14; C12Q1/06; G01N15/14	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	新疆生产建设兵团医院
发明人：	张新; 马集云; 吴良; 苗书魁; 唐金路; 陈旭; 鹿新红
地址：	830002 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市青年路232号新疆生产建设兵团医院
优先权：
专利代理机构：	乌鲁木齐新科联专利代理事务所(有限公司) 65107	代理人：	欧咏
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内容摘要

本发明提供的一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，1）针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针MB，其碱基组成为：5’-FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3’，其中5’端用FAM标记，3’端用DABCYL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm；并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（P：5’-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’）；2）通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为50℃，计算分子信标S/B值；3）用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定去离子甲酰胺的浓度为10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为20x105cfu/μl，分子信标的浓度为10ng/μl。

权利要求书

1：一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于： 1）针对金黄色葡萄球菌 ATCC25923 的 16SrRNA 的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针 MB，其碱基组成为： 5’ -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT -DABCYL-3’ ，其中 5’端用 FAM 标记， 3’端用 DABCYL 标记，荧光基团激发波长 495nm，检测波长 520nm ；并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（P ： 5’ -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’ ）； 2）通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为 50℃，计算分子信标 S/B 值； 3）用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定去离子甲酰胺的浓度 5 为 10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为 20x10 cfu/μl，分子信标的浓度为 10 ng/μl ；其中将金黄色葡萄球菌 ATCC25923 接种于哥伦比亚血琼脂平板培养，挑取对数生长期 5 的菌落，用无菌的 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液调至 20x10 cfu/μl 浓度； 5 其 1 菌体制备：吸取 20x10 cfu/μl 的金黄色葡萄球菌 2ml， 10000 rpm 离心 5 min，收集菌体；加入 6ml 固定液，固定液为 4% 多聚甲醛 +96% 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 ； 4 ℃固定 1h ；离心 10000 rpm， 5 min，除去残留的多聚甲醛；用 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液洗涤 1 次，得菌体沉淀物；其 2 酶处理：向上述的菌体沉淀物中加入 1mg/ml 溶葡萄球菌酶 100 μl， 37 ℃， 15 min ；收集菌体 10000 rpm， 5 min ；分别用 50%、 80%、 95% 乙醇脱水 3min ；用 20 μl 20 mM Tris-HCl 缓冲液重悬菌体，平均加入 2 个管中备用；其 3 配制杂交缓冲液：在 EP 管中加入 10μl100 ng/μl 的 MB 和 10μl100% 的去离子甲酰胺后，用 20 mM Tris-HCl 补足至 100μl ；对照缓冲液：在 EP 管中加入 10μl100% 的去离子甲酰胺后，用 20 mM Tris-HCl 缓冲液补足至 100μl，备用；其 4 杂交：经酶处理的产物一管作为阳性，加入 100μl 杂交缓冲液；另一管作为阴性对照，加入 100μl 阴性对照缓冲液； 2 个管置于 50 ℃，避光杂交 2h， 2 个管分别收集菌体 10000 rpm， 5 min ； 2 个管分别加入不含探针的 100 μl 缓冲液，于 48 ℃洗涤 15min ； 2 个管分别重悬于 500μl 缓冲液中，置于冰上， 3h 内取样，过滤后测定。
2：根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：分子信标的浓度为 1 OD 的分子信标质量数为 32.68ug，在管中加入 327 μl 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液溶解，则配成浓度为 100 ng/μl 的母液贮存。
3：根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：分子信标 S/B 值的计算： S/B =F open-F buffer/F closed-F buffer。
4：根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所用的分子信标及寡核苷酸序列，由上海生工生物工程有限公司合成；多聚甲醛、 20 mM Tris-HCl、去离子甲酰胺和溶葡萄球菌酶 lysostaphin 7386 均购自 Sigma ；哥伦比亚血琼脂平板购自郑州安图绿科生物工程有限公司。

说明书

一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法
    技术领域本发明涉及分子信标，即荧光原位杂交信号经流式细胞仪高灵敏识别，直接定量检测到病人分泌物标本中低含量的金黄色葡萄球菌，同时也适用于阳性血培养物中金黄色葡萄球菌的快速定量检测。
     背景技术目前国内外金黄色葡萄球菌的检测多采用传统的培养法以及分子生物学技术 [1]。然而，培养法耗时长，需 1-4 天，不利于感染性疾病的早期诊断以及医院或社区获得性感染的预防与控制。尽管 PCR 方法能够快速、特异性检测金黄色葡萄球菌，但实验室扩增产物污染以及病人标本中可能存在有未知的酶抑制剂等问题难以克服，及时采用荧光原位杂交检测方法也不能直接用于分泌物标本中金黄色葡萄球菌的检测，因此，分子生物学的方法在临床试验室的应用受到一定程度的限制。分子信标（Molecular beacon， MB）由于其特异性强、灵敏度高并可在均相溶液中与靶核酸分子进行杂交等特点而在荧光原位杂交技术中得到应用 [3]。
     文献检索披露： PCR 和 FISH 技术用于金黄色葡萄球菌的检测已有多篇报道 [1-6]，这些技术方法的建立能够对病人分泌物标本以及阳性血培养物中的金黄色葡萄球菌进行快速检测。但是 PCR 方法容易造成扩增产物污染，这使得金黄色葡萄球菌在临床实验室的检测受到了一定程度的限制。目前，在已报道的多种用于检测金黄色葡萄球菌的 FISH 技术均是采用线形探针进行杂交检测，并且所检测的标本均来源于血培养瓶中的阳性培养物。这种情况存在 2 个缺点：一是线形探针不能用于均相溶液中靶分子的检测，因此，在杂交检测时必须进行标本的固定或者对探针进行固定，杂交反应完成后必须进行严格的冲洗以去除未杂交的探针，否则荧光背景信号高；二是病人分泌物标本中的金黄色葡萄球菌的含量低，不能对这样的标本进行直接检测，因此， FISH 的应用受到了限制。本发明将分子信标可在均相溶液中对靶分子进行杂交检测的特点与流式细胞仪高分辨、高灵敏度识别荧光染色细胞的特点相结合快速对病人分泌物标本及阳性血培养物中金黄色葡萄球菌进行荧光原位杂交检测。分子信标荧光原位杂交反应体系的建立首先简化了 FISH 的操作步骤，无需对标本或探针进行固定，也不用对未杂交的探针进行冲洗去除，杂交检测可一步完成，最大限度地降低了干扰因素对实验的影响；其次流式细胞分析仪可以高灵敏度定量识别荧光染色的细胞，不但能直接定量检测病人分泌物标本中低含量细菌，而且能够对阳性血培养物中完整的活细胞进行定量检测，克服了目前 FISH 不能用于分泌物标本中低含量细菌检测的局限。
     本发明针对金黄色葡萄球菌特异性的 16SrRNA 片断，设计、合成分子信标探针，建立稳定的分子信标荧光原位杂交反应体系，克服了培养法耗时长以及目前分子生物学技术检测的诸多问题，为金黄色葡萄球菌感染性疾病的早期诊断以及医院或社区获得性感染的预防、控制提供新的快速检测方法。
     发明内容本发明的目的在于：利用荧光原位杂交 - 流式细胞术法，建立一种快速、灵敏、特异检测病人分泌物标本以及阳性血培养物中低含量金黄色葡萄球菌的方法。
     本发明的目的是这样实现的：一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤： 1）针对金黄色葡萄球菌 ATCC25923 的 16SrRNA 的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针 MB，其碱基组成为： 5’ -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3’ ；荧光基团激发波长 495nm，检测波长 520nm ；同时设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（P ： 5’ -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’ ）； 2）通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为 50℃，计算分子信标 S/B 值； 3）用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定的反应体系，即去离 5 子甲酰胺的浓度为 10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为 20x10 cfu/μl，分子信标的浓度为 10 ng/μl。
     本发明的技术要点或原理：荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）技术是一种应用非放射性荧光物质标记的核酸探针根据杂交原理检测细胞或组织内特定 DNA 或 RNA 的方法， 1996 年 Tyagi 和 Kramer[1] 首次报道了一种可以实时监测 PCR 反应产物扩增过程的新型荧光标记探针，即分子信标，与众多用于荧光原位杂交技术的核酸探针不同的是分子信标具有独特的空间 “发夹” 结构，在未结合靶分子时，分子信标呈 “发夹” 结构，有一个环序列（loop）与一茎序列（stem），其中环是与靶分子互补的核酸碱基序列，茎为两列与靶分子杂交无关的互补碱基序列，在探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，当探针处于完整的 “发夹” 结构时，荧光基团和淬灭基团由于茎序列的互补结合而彼此紧密相邻，从而产生荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer， FRET）效应，导致荧光信号被有效淬灭而不能释放出来，当探针与互补的靶分子结合时，分子信标的 “发夹” 结构被打开，荧光基团和淬灭基团彼此分离，荧光信号不能被淬灭而得以释放，本发明中流式细胞仪能够检测到杂交后的荧光信号，从而检测到金黄色葡萄球菌，彰显技术进步。附图说明
     本发明对照附图作进一步的阐明附图为分子信标热变性曲线图；如图所示：上曲线为分子信标与完全互补的寡核苷酸杂交曲线，对应荧光强度值即 F open ；中间曲线为分子信标随温度变化的曲线，对应荧光强度值即 F closed ；下曲线为缓冲液随温度变化的曲线，对应荧光强度值即 F buffer。
     具体实施方式实施例 (1) 分子信标及寡核苷酸序列的设计与合成针对金黄色葡萄球菌 ATCC25923 的 16S rRNA 序列，设计出能特异地检测金黄色葡萄球菌的分子信标（5’ -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3’ ）及与其完全互补的寡核苷酸（P ： 5’ -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’ ）。
     (2) 通过对分子信标做热变性曲线实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为 50℃，计算分子信标 S/B（Signal-to-background ratio， S/B）值： S/B =(F open-F buffer)/(F closed-F buffer) ；（3）选择出能特异性地检测金黄色葡萄球菌的靶序列，在该段靶序列上用 beacon designer2.1 软件设计与其完全互补的分子信标探针（5’ -FAM-cgctgaAGAAGCAAGCTTCTCGTC CGTtcagcg-DABCYL-3’ ），该分子信标是由碱基组成的颈环结构的特异序列，其中 5’ 端用 FAM 标记， 3’ 端用 DABCYL 标记，荧光基团要求激发波长 495nm，检测波长 520nm ；人工设计合成分子信标及与其完全互补的寡核苷酸。
     （4） 3 种溶液在 PCR 反应管中配制后置于荧光定量 PCR 仪中，温度从 80℃下降到30℃，温度每降低 1℃采集一次荧光 ; 将 3 种溶液从 80℃下降到 30℃的荧光强度做散点图即为 MB 的热变性曲线 ; 从热变性曲线图看出，温度在 45-55℃内时， MB 与完全互补的寡核苷酸杂交稳定，荧光强度较高； MB 随温度降低，曲线较平缓，说明荧光强度较稳定 ; 当温度在 50℃时， MB 与完全互补的寡核苷酸杂交的荧光强度最高，因此可确定最佳的杂交温度为 50℃ ；并计算出 S/B 值，由表 1 可见实验 6 中 S/B 值最高，说明该组为最佳反应体系。
     （5）按照表 2 配制杂交溶液，用流式细胞仪进行荧光原位杂交，比较实验结果 ( 阳性标本的荧光值减去阴性对照的荧光值 ), 可确定最佳反应体系是第 2 组 , 即去离子甲酰胺的浓度为 10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为 20x105cfu/μl，分子信标的浓度为 10 ng/ μl ；（6）获取金黄色葡萄球菌的菌液：将金黄色葡萄球菌 ATCC25923 接种于哥伦比亚血琼脂平板培养，挑取对数生长期的菌落，用无菌的 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液调至 5 20x10 cfu/μl 浓度；其 1 菌体制备：吸取 20x105cfu/μl 的金黄色葡萄球菌 2ml， 10000 rpm 离心 5 min，收集菌体；加入 6ml 固定液，固定液为 4% 多聚甲醛 +96% 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 ； 4 ℃固定 1h ；离心 10000 rpm， 5 min，除去残留的多聚甲醛；用 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液洗涤 1 次，得菌体沉淀物；其 2 酶处理：向上述的菌体沉淀物中加入 1mg/ml 溶葡萄球菌酶 100 μl， 37 ℃， 15 min ；收集菌体 10000 rpm， 5 min ；分别用 50%、 80%、 95% 乙醇脱水 3min ；用 20 μl 20 mM Tris-HCl 缓冲液重悬菌体，平均加入 2 个管中备用；其 3 配制杂交缓冲液：在 EP 管中加入 10μl 100 ng/μl 的 MB 和 10μl100% 的去离子甲酰胺后，用 20 mM Tris-HCl 补足至 100μl ；对照缓冲液：在 EP 管中加入 10μl100% 的去离子甲酰胺后，用 20 mM Tris-HCl 缓冲液补足至 100μl，备用；其 4 杂交：经酶处理的产物一管作为阳性，加入 100μl 杂交缓冲液；另一管作为阴性对照，加入 100μl 阴性对照缓冲液； 2 个管置于 50 ℃，避光杂交 2h， 2 个管分别收集菌体 10000 rpm， 5 min ； 2 个管分别加入不含探针的 100 μl 缓冲液，于 48 ℃洗涤 15min ； 2 个管分别重悬于 500μl 缓冲液中，置于冰上， 3h 内取样，过滤后测定。
     （7）分子信标的浓度为 1 OD 的分子信标质量数为 32.68ug，在管中加入 327 μl 20 mM Tris-HCl， pH 7.2 缓冲液溶解，则配成浓度为 100 ng/μl 的母液贮存。
     （8）上述的分子信标及寡核苷酸序列，由上海生工生物工程有限公司合成；多聚甲醛、 20 mM Tris-HCl、去离子甲酰胺和溶葡萄球菌酶 lysostaphin 7386 均购自 Sigma ；哥伦比亚血琼脂平板购自郑州安图绿科生物工程有限公司。6102304571 A CN 102304577序列表1/2 页针对金黄色葡萄球菌的 16SrRNA 片断，在 GeneBank 中，金黄色葡萄球菌 EU807758 的 16SrRNA 序列如下： LOCUS EU807758 1430 bp DNA linear BCT 06-JUL-2008 DEFINITION Staphylococcus aureus strain X13 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. ACCESSION EU807758 VERSION EU807758.1 GI:193299694 KEYWORDS . SOURCE Staphylococcus aureus ORGANISM Staphylococcus aureus Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Staphylococcus. REFERENCE 1 (bases 1 to 1430) AUTHORS Zhao,L. and Chen,C. TITLE Molecular taxonomic study on Staphylococcus aureus JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1430) AUTHORS Zhao,L. and Chen,C. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (07-JUN-2008) Chemical and Enviomental Engineering, Beijing Technology and Business University, Fucheng Road 11, Haidian District, Beijing 100037, China FEATURES Location/Qualifiers source 1..1430 /organism="Staphylococcus aureus" /mol_type="genomic DNA" /strain="X13" /isolation_source="sausage" /db_xref="taxon:1280" rRNA <1..>1430 /product="16S ribosomal RNA" 1 acatgcaagt cgagcgaacg gacgagaagc ttgcttctct gatgttagcg gcggacgggt 61 gagtaacacg tggataacct acctataaga ctgggataac ttcgggaaac cggagctaat 121 accggataat attttgaacc gcatggttca aaagtgaaag acggtcttgc tgtcacttat 181 agatggatcc gcgctgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaacgatgc 241 atagcccacc tgagagggtg atcggccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac 301 gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat gggcgaaagc ctgacggagc aacgccgcgt 361 gagtgatgaa ggtcttcgga tcgtaaaact ctgttattag ggaagaacat atgtgtaagt7102304571 A CN 102304577序列表2/2 页421 aactgtgcac atcttgacgg tacctaatca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc 481 cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgtagg 541 cggtttttta agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg tggagggtca ttggaaactg 601 gaaaacttga gtgcagaaga ggaaagtgga attccatgtg tagcggtgaa atgcgcagag 661 atatggagga acaccagtgg cgaasgcgac tttctggtct gtaactgacg ctgatgtgcg 721 aaagcgtggg gatcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg 781 ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct 841 ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg 901 gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caaatcttga catcctttga 961 caactctaga gatagagctt tccccttcgg gggacaaagt gacaggtggt gcatggttgt 1021 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttaagctt 1081 agttgccatc attaagttgg gcactctaag ttgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1141 ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgatttgggc tacacacgtg ctacaatgga 1201 caatacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtc aagcaaatcc cataaagttg ttctcagttc 1261 ggattgtagt ctgcaactcg actacatgaa gctggaatcg ctagtaatcg tagatcagca 1321 tgctacggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg 1381 taacacccga agccggtgga gtaaccttta ggagctagcc gtcgaagttg 本发明以金黄色葡萄球菌 ATCC25923 的 16SrRNA 的片断为靶序列，人工设计分子信标探针 MB，其碱基组成为： 5’ -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT -DABCYL-3’ 并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸（P ： 5’ -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’ ）。