胎肾上腺StAR基因在化学品发育毒性评价中的应用 【技术领域】
本发明涉及医用医药技术领域，更具体涉及一种胎肾上腺StAR基因在化学品发育毒性评价中的应用。
背景技术
发育毒性是指妊娠动物接触受试药物后，子代于出生前、围产期和出生后所表现的机体结构或功能障碍。这是经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No.421(1995年)《生殖/发育毒性筛选试验》(英文版)对发育毒性的定义，该指南亦被中华人名共和国国家标准-GBT 21766-2008化学品生殖/发育毒性筛选试验方法采用。
自上世纪60年代“反应停”事件后，孕期化学品的致畸性危害已受到人们高度的重视。然而，孕期化学品暴露所致功能发育障碍却往往为人们所忽视。事实上，孕期化学品的功能发育障碍危害更严重，这是因为危害的人群更多，它不仅影响了人口素质，而且可带来系列的家庭和社会问题。如宫内发育迟缓就是一类最常见的孕期化学品暴露所致的发育毒性，它不仅是围产儿发病和死亡的重要原因，还常伴有出生后体格、智力发育落后，成年后代谢综合征易感性增高，并可遗传至下一代。因此，建立一种准确客观的发育毒性评价方法，对于孕妇有效避免接触有害化学品，控制发育毒性发生率，提高世界人口综合素质，具有重要的现实指导意义。
近年来，随着科学技术和工业生产的迅猛发展，国内外医药领域的发展水平也出现了大幅度的提高。不断涌现的新药、特药给广大患者带来了福音，但同时药品作为一种特殊商品，与人们的身体健康、生命安全息息相关，其发育毒性评价显得尤为重要。特别是当今大量新生化合品的不断涌现，其所致的发育毒性发生率有上升趋势，新药的发育毒性评价更是重中之重，与人民的用药安全息息相关。然而，目前国内外普遍采用药物发育毒性评价方法，即上述提到的OECD化学品测试指南No.421(1995年)《生殖/发育毒性筛选试验》，主要通过出生体重来评价药物的发育毒性，它存在着动物用量大、实验时间长、实验操作复杂、检测指标不灵敏不特异等诸多弊病，大大限制了发育毒性评价工作的效率。因此，寻找新的、灵敏的、早期的发育毒性评价指标已是生殖毒性评价领域迫在眉睫的难题。
甾体激素是一类能影响内分泌系统功能的重要因子，对维持正常妊娠、促进胎儿发育有着重要意义。作为机体的重要内分泌器官，肾上腺负责了多种甾体激素的合成。从结构上看，胎肾上腺在孕4-5周已发育成形；从功能上看，早在孕6-8周肾上腺胚基细胞就有生成类固醇的能力，提示胎肾上腺的早期正常发育是决定胎儿成熟和命运的关键。StAR基因是肾上腺甾体激素合成的限速酶——甾体合成急性调节蛋白(StAR)基因。前期我们通过全面检测与外源物代谢相关的I相酶、II相酶和抗氧化酶系统水平，首次提出了发育中的肾上腺不仅是一个重要的内分泌器官，同时也具有重要的外源物代谢器官的性质；在整体和细胞水平证实胎肾上腺的甾体激素合成功能能为多种外源物所干扰，同时胎肾上腺StAR和P450SCC表达降低，进一步证实了胎儿宫内发育迟缓的发生与胎肾上腺StAR基因的表达降低存在着相关性(Chen M，et al.Adrenal-mediated cortisol disturbancein nicotine-induced rat intrauterine growth retardation.Exp Toxicol Pathol2007；59(3-4)：245；Wang H，et al.Fetal adrenal mediated steroidogenetic disturbancein xenobiotics-induced intrauterine growth retardation.Drug Metab Rev 2007；39；Wang H，et al.Influences of 3-methylcholanthrene，phenobarbital and dexamethasoneon xenobiotic metabolizing-related cytochrome P450 enzymes and steroidogenesis inhuman fetal adrenal cortical cells.Acta Pharmacol Sin 2006；27(8)：1093)。
基于上述，本发明涉及以胎肾上腺StAR为化学品毒性靶基因，建立基于胎肾上腺StAR基因表达变化的体外评价系统，早期、快速的评价化学品的发育毒性，可以满足新药研发和环境卫生评价的多领域需要。
【发明内容】
本发明的目的是在于提供了一种胎肾上腺StAR基因在化学品发育毒性评价中的应用。能早期、快速的评价化学品的发育毒性，以满足新药研发和环境卫生评价的多领域需要。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术构建了一种化学品发育毒性的体外评价系统，它包括：1)人胎肾上腺细胞体外培养方法；2)化学受试品处理细胞的方式；3)StAR基因表达的检测方法。应用该系统证实多种外源物(如咖啡因、乙醇和尼古丁等)存在发育毒性，从而在细胞水平证实了这些阳性化学品在整体动物水平已存在的胚胎发育毒性。
在本发明的一个优选方案中，具体采用了以下步骤：
1、基因地来源：本实验中所使用的人胎肾上腺NCI-H295A细胞系(HuangN，et al.Regulation of cytochrome b5 gene transcription by Sp3，GATA-6，andsteroidogenic factor 1 in human adrenal NCI-H295A cells.Molecular Endocrinology19(8)；2020-2034)中具有StAR基因。
2、建立人胎肾上腺NCI-H295A细胞系体外培养系统：利用人胎肾上腺NCI-H295A细胞系，以含2％胎牛血清，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转帖蛋白，5μg/ml亚硒酸盐的RPMI-1640培养基于37℃，5％CO2的孵箱内培养，传代。待细胞生长至接近融合时，用无血清的RPMI-1640培养基同步化12h。
3、化学受试品处理细胞方式；用咖啡因作用于人胎肾上腺NCI-H295A细胞的终浓度分别为100、400和600μM，作用时间均为48h。然后收集培养基，于低深温(-78℃--82℃)冰箱保存。
4、StAR基因表达的检测方法：从NCBI的Entrez核酸数据库(EntrezNucleotides database)中检索到人类StAR和P450scc的完整cDNA序列，应用引物设计软件Primer Premier 5.0(PREMIER Biosoft International)进行引物设计，然后将设计出的引物输入BLAST数据库中进行同源性比较，最终得到特异的引物序列。从所收获的细胞中，应用RNA抽提试剂盒(RNeasy Mini Kit)提取其总RNA，并进行逆转录，使其合成cDNA，并测其浓度。从NCBI的Entrez核酸数据库(Entrez Nucleotides database)中检索到人类StAR和P450scc的完整cDNA序列，应用引物设计软件Primer Premier 5.0(PREMIER BiosoftInternational)进行引物设计，然后将设计出的引物输入BLAST数据库中进行同源性比较，最终得到特异的引物序列，利用得到的引物进行实时定量PCR技术检测StAR和P450scc的表达变化。
5、Western Blot法检测StAR和P450scc的蛋白表达：抽提组织和细胞总蛋白。BCA法检测总蛋白浓度，制备SDS-PAGE胶，上样并电泳后用电转移仪(美国Bio-Rad)转移到硝酸纤维素膜上，封闭后加入兔抗StAR或羊抗P450scc抗体、室温(20℃-25℃)孵育2小时，二抗为HRP-羊抗兔或兔抗羊IgG、室温(20℃-25℃)孵育2h，ECL化学发光剂作用后在X光胶片上曝光、显影和定影。结果由计算机凝胶图像分析系统检测。
6、毒性判断标准：根据StAR表达变化的结果，得到各化学受试品能引起基因表达量50％变化的浓度，即半数有效浓度(EC50)，确定其发育毒性程度。
本发明的优点在于：
1、简便、快速：本发明利用人胎肾上腺NCI-H295A细胞系体外培养系统，通过化学受试品处理后，检测其StAR基因的表达，即可计算各化学受试品的半数有效浓度(EC50)，确定其发育毒性程度。其方法简单、方便、快速，为建立胎儿发育毒性评价系统提供了坚实的基础。
2、早期、特异：由于胎StAR基因是胎肾上腺甾体激素合成限速酶P450scc的急性调节蛋白，而甾体激素(如糖皮质激素)能促进胚胎组织发育和功能成熟，因此胎肾上腺早期的正常发育是决定胎儿成熟和命运的关键。利用人胎肾上腺NCI-H295A细胞系体外培养系统，通过化学受试品处理后，检测其StAR基因的表达，可以对化学品的发育毒性进行早期和特异性评价。
3、符合“3R(reduction，refinement，replacement)原则”：“3R原则”即实验动物的减少、优化和替代原则。本发明着重利用人胎肾上腺NCI-H295A细胞系体外培养系统，能减少实验动物数，指标特异，部分代替动物实验，所以符合“3R原则”。
4、应用领域广泛：本发明可广泛应用于如生物代谢、新药研发、卫生毒理学研究、疾病预防和诊断等领域。
【附图说明】
图1：尼古丁(1-100μM)对人胎肾上腺细胞StAR和P450scc基因表达的影响
图2：尼古丁(1-100μM)对人胎肾上腺细胞StAR和P450scc蛋白表达的影响
图3：可替宁(1-100μM)对人胎肾上腺皮质细胞StAR和P450scc蛋白表达的影响
图4：尼古丁(100μM)、咖啡因(400μM)和乙醇(100μM)对NCI-H295A细胞StAR和P450scc基因mRNA水平的影响
图5：尼古丁(100μM)、咖啡因(400μM)和乙醇(100μM)对NCI-H295A细胞StAR蛋白表达水平的影响。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例子，进一步阐述本发明。
实施例1尼古丁和可替林对人胎肾上腺StAR和P450scc表达的影响
一、试剂来源
尼古丁和可替宁购自美国Sigma公司；Trizol Reagent和HiBindTM PCR产物回收试剂盒为美国Omega公司生产；实验所用引物由上海生工生物工程技术有限公司合成；逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；实时定量RT-PCR试剂盒为日本Takara公司产品；Sybr Green I染料购自上海捷瑞生物工程有限公司；DMEM/F-12培养基为美国Gibico公司产品；I型胶原酶为美国Invitrogen公司生产；DNA酶I(DNase I)购自北京华美生物工程公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；StAR及P450scc多克隆抗体为美国Santa Cruz Biotechnology产品；羊抗兔及兔抗羊二抗和ECL试剂盒为美国Pierce Biotechnology产品；HRP标记的GAPDH抗体购自上海康成生物工程公司。
二、实验方法
(1)基因的来源：本实验中利用人胎肾上腺NCI-H295A细胞系(HuangN，etal.Regulation of cytochrome b5 gene transcription by Sp3，GATA-6，andsteroidogenic factor 1 in human adrenal NCI-H295A cells.Mol Endocrinol.2005；19(8)：2020-34)，细胞中具有StAR基因。
(2)建立人胎肾上腺NCI-H295A细胞系体外培养系统：利用人胎肾上腺NCI-H295A细胞系，以含2％胎牛血清、5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml亚硒酸盐的RPMI-1640培养基于37℃，5％CO2孵箱内培养，传代。待细胞生长至接近融合时，用无血清的RPMI-1640培养基同步化12h。
(3)总RNA提取和cDNA合成：6孔板的每孔细胞加入1mL RNA-SolvReagent，按试剂说明书中操作步骤提取RNA，要求OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间。取总RNA 1μg按操作说明书合成cDNA，反应体系20μl，包括5×缓冲液4μl，dNTP 1μl，Oligo dT Primer 1μl，M-MLV逆转录酶0.5μl，Rnase抑制剂0.5μl，用二乙基焦碳酸酯(DEPC)水补足。42℃15min，95℃2min进行逆转录，合成好的cDNA置于低深温(-78℃～-82℃)冰箱保存备用。
(4)引物设计：从NCBI的Entrez核酸数据库(Entrez Nucleotides database)中检索到人类StAR、P450scc及对照人类β-actin的完整cDNA序列，应用引物设计软件Primer Premier 5.0(PREMIER Biosoft International)进行引物设计，然后将设计出的引物输入BLAST数据库中进行同源性比较，最终得到特异的引物序列。引物序列、目的片段长度和反应条件见表1。
表1.引物序列和PCR条件
Genes Forward primer Reverse primer Product(bp) Annealing β-actin CCTATGGCATCCAC GAAA GATGGAGCCATCG AAACA 224 60℃，20s StAR GATTTTGCCAACC ACCTGC GGATTCTCCTGATG AGCGTGT 127 60℃，20s
Genes Forward primer Reverse primer Product(bp) Annealing P450scc GACAATGGCTGGC TAAACT GGCTGCCGACTTC TTCAA 273 58℃，20s
(5)实时定量PCR标准品的制备：将待测基因的PCR产物用胶回收试剂盒进行纯化，然后按10倍梯度稀释即可得到标准品，用于做实时定量PCR的标准曲线。
(6)荧光定量分析：采用RG-3000实时定量PCR仪(澳大利亚Corbett公司)进行检测。反应体系25μl，包括PCR反应液混合物(Premix Ex TaqTM)12.5μl，cDNA 2μl，Forward primer和Reverse primer各0.5μl，20×SYBR Green I 0.5μl，用二乙基焦碳酸酯(DEPC)水补足。
(7)数据计算：本实验采用标准曲线相对定量法对待测基因的mRNA表达水平进行计算。应用Rotor-Gene 6.0软件(Corbett Research公司)通过标准曲线计算出样品的mRNA表达相对量V值，将待测基因的V值与同一样本外参基因GAPDH的V值相比(Rv＝V待测/VGAPDH)，所得比值Rv代表样本待测基因mRNA的相对表达量。
(8)Western blot法检测StAR和P450scc的蛋白表达：常规用RI-PA+PMSF抽提组织和细胞总蛋白。BCA法检测总蛋白浓度，制备SDS-PAGE胶(包括12％浓度分离胶和4％浓度浓缩胶)，上样并电泳后用电转移仪(美国Bio-Rad)转移到硝酸纤维素膜上，封闭后加入兔抗StAR或羊抗P450scc抗体(工作浓度为1∶100)、室温(20℃～25℃)孵育2h，二抗为HRP-羊抗兔或兔抗羊IgG(工作浓度为1∶5000)、室温(20℃～25℃)孵育2h，ECL化学发光剂作用后在X光胶片上曝光、显影和定影。结果由计算机凝胶图像分析系统检测。
(9)数据处理与统计方法：实验数据多以Mean±SD表示，均数的组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，率的组间比较采用x2检验，P＜0.05表示差异具有显著性。
三、实验结果
(1)尼古丁对人胎肾上腺细胞StAR和P450scc基因和蛋白表达的影响：如图1和图2所示，不同浓度尼古丁处理原代分离培养孕中末期人胎肾上腺细胞24h后，其细胞中StAR和P450scc的mRNA和蛋白表达量均明显降低，并呈现一定的浓度依赖性，其中100μM尼古丁组的mRNA表达量分别下降至正常对照组的30.4％(P＜0.05)和39.2％。
(2)可替宁对人胎肾上腺皮质细胞StAR和P450scc表达的影响：从图3发现，不同浓度可替宁(1、10和100μM)处理胎肾上腺细胞24h后，其细胞中StAR和P450scc的蛋白表达量均呈现浓度依赖性降低。
实施例2尼古丁、咖啡因和乙醇对人胎肾上腺NCI-H295A细胞StAR和P450scc表达影响
一、试剂来源
尼古丁、咖啡因购自美国Sigma公司；实验所用引物由Integrated DNATechnologies公司合成；RNA抽提试剂盒(RNeasy Mini Kit)购自Qiagen公司；逆转录试剂盒(SuperScriptTM II RNase H Reverse Transcriptase Kit)和PCR试剂盒购自Invitrogen公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购自Invitrogen公司；胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸盐(IST)购自sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Biorad公司；鼠抗StAR抗体购自abcam公司；β-tubulin抗体为Santa Cruz Biotechnology产品；Alexa Fluor 680山羊抗鼠荧光二抗购自Rockland Immunochemicals公司。
一、实验方法
(1)基因的来源：本实验中建立的人胎肾上腺NCI-H295A细胞系(Huang N，et al.Regulation of cytochrome b5 gene transcription by Sp3，GATA-6，andsteroidogenic factor 1 in human adrenal NCI-H295A cells.Mol Endocrinol.2005；19(8)：2020-34)中具有StAR基因。
(2)人胎肾上腺NCI-H295A细胞的培养：NCI-H295A细胞系以含2％胎牛血清、5μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml亚硒酸盐的RPMI-1640培养基于37℃，5％CO2的孵箱内培养，传代。待细胞生长至接近融合时，用无血清的RPMI-1640培养基同步化12h。尼古丁、咖啡因和乙醇作用于细胞的终浓度分别为100、400和100μM，作用时间均为48h。然后收集培养基，于低深温(-78℃～-82℃)冰箱保存。
(3)总RNA提取和cDNA合成：按照RNeasy Mini Kit说明书中操作步骤提取RNA，并测RNA浓度。取总RNA 1μg按SuperScriptTM II RNase H ReverseTranscriptase Kit操作说明书合成cDNA，并测其浓度，置于低深温(-78℃～-82℃)冰箱保存备用。
(4)引物设计及PCR分析：从NCBI的Entrez核酸数据库(Entrez Nucleotidesdatabase)中检索到人类StAR和P450scc的完整cDNA序列，应用引物设计软件Primer Premier 5.0(PREMIER Biosoft International)进行引物设计，然后将设计出的引物输入BLAST数据库中进行同源性比较，最终得到特异的引物序列。并采用PCRx Enhancer System进行分析。引物序列、目的片段长度和反应条件见表2。
表2.引物序列和PCR条件
Genes Forward primer Reverse primer Product(bp) Annealing StAR TGAGCAGAAGG GTGTCATCAGG CGCAGGTGGTTG GCAAAATC 186 59℃，30s P450scc ATGCTGGAGGAA GTAGTGAACCC GCGTGCCATCTC ATACAAGTGC 372 59℃，30s
(5)Western blot法检测StAR蛋白的表达：常规用RIPA buffer抽提细胞总蛋白，BCA法检测总蛋白浓度，制备SDS-PAGE胶(包括10％浓度分离胶和4％浓度浓缩胶)，上样并电泳后用电转移仪(美国Bio-Rad)转移到PVDF膜上，封闭后加入鼠抗StAR抗体(1∶1000)4℃过夜，TBST漂洗三次后，加入二抗(1∶5000)室温(20℃～25℃)避光孵育1h。漂洗3次后由Odyssey infraredimaging system(LI-COR，Biosciences，NE，USA)扫描得到图像。
三、实验结果
(1)尼古丁、咖啡因和乙醇对NCI-H295A细胞StAR和P450scc基因mRNA水平的影响：如图4所示，尼古丁、咖啡因和乙醇处理NCI-H295A细胞48h后，细胞中StAR和P450scc的mRNA表达量均降低。
(2)尼古丁、咖啡因和乙醇对NCI-H295A细胞StAR蛋白表达水平的影响：如图5所示，尼古丁、咖啡因和乙醇处理NCI-H295A细胞48h后，其细胞StAR蛋白的表达量均降低。