一种百菌清抗原、抗体制备方法及其残留ELISA检测方法.pdf

一种百菌清抗原、抗体制备方法及其残留ELISA检测方法，是以百菌清作为起始反应物，以氨基取代4位氯原子；并采用1’1-羰基咪唑法制备其人工抗原，通过免疫新西兰大白兔获得兔抗百菌清多克隆抗体，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定其抗血清效价可达1∶5.12×104，并以此建立百菌清残留检测的ELISA方法，方法最低检测浓度0.383ng/mL。

权利要求书
1.  一种杀菌剂百菌清的人工抗原制备新方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将百菌清充分溶解于二氯甲烷，再向其中加入与百菌清和乙二胺的摩尔比为1∶0.5-1的乙二胺-水混合液，20-25℃下缓慢搅拌22-24h；
(2)反应结束后，分离二氯甲烷层，水洗二氯甲烷层3-5次，蒸发去除二氯甲烷后，得黄绿色晶体，为目标半抗原；
(3)将(2)获得的半抗原用DMF溶解，再向其中加入同样用DMF溶解的等摩尔的1’1-羰基咪唑，20-25℃下搅拌2-3h，将混合体系缓慢滴加到用碳酸盐缓冲液(CBS)溶解的牛血清蛋白(BSA)/卵清蛋白(OVA)溶液中，搅拌4-6h；离心20-30min(6000r/min)弃沉淀，上清采用8000-14000MW透析膜/袋进行透析，冻干后，即得人工免疫抗原/人工包被抗原。

2.  一种百菌清多克隆抗体，其特征在于，是将根据权利要求1所述的方法制备的百菌清人工免疫抗原免疫动物得到百菌清多克隆抗体。

3.  一种ELISA检测百菌清农药残留的方法，其特征在于采用如权利要求2所述的多克隆抗体作为一抗。

4.  如权利要求3所述的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)酶标板以权利要求1包被抗原进行包被；
(2)用封闭液进行封闭；
(3)加入权利要求2的多克隆抗体作为一抗；
(4)加入酶标羊抗兔二抗，进行孵育；
(5)加入新鲜配制的OPD(邻苯二胺)底物溶液；
(6)加入终止反应液终止反应；
(7)结果判定：以系列百菌清标准溶液不同浓度对数值(logC)为横坐标，以抑制率(％)为纵坐标绘制标准曲线，根据待测样品的抑制率计算百菌清在待测样品中含量。

5.  如权利要求4所述的方法，其特征在于：第(7)步结果判定：是用酶标仪于490nm测其吸光值(A)，以胎牛血清为空白(A空白)，百菌清浓度为0孔为对照，测A490为A0，其他浓度测得A分别为An，样品测得A490为As，按下式计算抑制率(％)
抑制率(％)＝1-(B0-Bn(Bx))/B0；其中B0(Bn，Bx)＝A0(An，As)-A空白。

6.  权利要求3所述方法中所有试剂包括：PBST的洗涤缓冲液(含0.05％Tween-200.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液)、百菌清标准液、权利要求2的抗百菌清的多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体、包被缓冲液(0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液)、底物溶液(0.40mg/mLOPD)、底物缓冲液(pH5.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)、反应终止液(2mol/L H2SO4)、H2O2。

说明书一种百菌清抗原、抗体制备方法及其残留ELISA检测方法
技术领域
本发明涉及一种新的杀菌剂百菌清抗原抗体制备方法及其残留ELISA检测方法。该方法能够快速、高效地检测果蔬中百菌清的农药残留，而且成本廉价。属于农药残留酶免疫分析领域。
背景技术
百菌清(chlorothalonil，TCPN)，化学名2，4，5，6-四氯-1，3-二氰基苯，是一种广谱保护性杀菌剂，农业生产中主要用于防治果蔬类真菌病害。由于百菌清对植物体具有良好的黏着性和使用的广泛性，因此百菌清及其代谢产物在果蔬、土壤及水中均有较大的残留，甚至在北极地区也能检测到(Gillian L.Daly，YingD.Lei，Camilla Teixeira，et al.Pesticides in Western Canadian Mountain Air and Soil[J].Environ.Sci.Technol，2007，41，6020-6025.)。美国国家环境保护总署(U.S.EPA)已经把百菌清列为可能使人类致癌的物质之一，其对环境和食品安全具有潜在威胁(Timothy S.Lawruk，Adrian M.Gueco，Scott W.Jourdan，et al.Determinationof chlorothalonil in water and agricultural products by a magnetic particle-basedenzyme immunoassay[J].Agric.Food Chem，1995，43(5)：1413-1419.)。目前，国内百菌清的检测方法主要为气相色谱法(GC)和液相色谱法(HPLC)等仪器分析方法(周晓龙，孙涛.气相色谱法检测蔬菜中百菌清及拟除虫菊酯类农药残留[J].仪器仪表学报，2005，26(8)：150-152.李晓岚.高效液相色谱法测定百菌清有效成分的含量[J].中国农学通报，2005，21(12)：352-353)。这些方法均存在样品前处理复杂、耗时、成本高等问题，不适合大量样品的快速检测，因此建立一种操作简便、快速和检测通量大的方法具有重要意义。ELISA是目前用于农药残留分析较为常用的快速检测法，其原理是利用酶标记物同抗原或抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的灵敏性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度，其方法建立的关键则是制备出一种或几种人工抗原，以获得高效价的抗血清，因为抗原的质量对最终的抗血清质量起着决定性的作用，进而影响到所建立的ELISA检测方法的灵敏度和检测限等。
公开号为CN101412756A的中国专利申请公开了一种检测百菌清农药残留的方法及其检测试剂盒。一次检测96个样品可在4h内完成，检测的最低限为0.016mg·kg-1。然而仍然存在检测时间稍长，灵敏度不高的不足。
发明内容
为了获得更高效价和质量的抗百菌清血清，本发明首要目的在于提供一种新的杀菌剂百菌清抗原及其制备方法。本发明还提供了一种高效价抗百菌清血清制备方法。还提供了该抗百菌清血清用于检测果蔬中百菌清残留的ELISA方法。
在本发明中，以百菌清作为起始反应物，以乙二胺取代百菌清4位碳原子上的氯原子制备半抗原。并采用1’1-羰基咪唑法制备其人工抗原。通过免疫新西兰大白兔获得了兔抗百菌清的血清具有特异性好、效价高等特点，并以此建立了果蔬中百菌清残留检测的间接ELISA方法。
本发明的具体方案如下：
一种杀菌剂百菌清的人工抗原制备新方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将百菌清充分溶解于二氯甲烷，再向其中加入与百菌清和乙二胺的摩尔比为1∶0.5-1的乙二胺-水混合液，20-25℃下缓慢搅拌22-24h；
(2)反应结束后，分离二氯甲烷层，水洗二氯甲烷层3-5次，蒸发去除二氯甲烷后，得黄绿色晶体，为目标半抗原；
(3)将(2)获得的半抗原用DMF(N’N-二甲基甲酰胺)溶解，再向其中加入同样用DMF溶解的等摩尔的1’1-羰基咪唑，20-25℃下搅拌2-3h，将混合体系缓慢滴加到用碳酸盐缓冲液(CBS)溶解的牛血清蛋白(BSA)/卵清蛋白(OVA)溶液中，搅拌4-6h；离心20-30min(6000r/min)弃沉淀，上清采用8000-14000MW透析膜/袋进行透析，冻干后，即得人工免疫抗原/人工包被抗原。抗原于-20℃保藏。
本发明还提供了特异性抗体的制备新方法：
特异性抗体是将百菌清人工免疫抗原免疫动物得到。
具体方法优选以下步骤：将人工抗原用生理盐水稀释，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化，于新西兰大白兔背部皮下多点免疫；其后以弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂加强免疫4次后，颈主动脉放血，分离抗血清，采用饱和硫酸铵法对抗血清进行纯化，得到兔抗百菌清多克隆抗体，-20℃保存备用。
但本发明不局限于上述优选步骤，任何本领域技术人员能够获知的方法均适用于本发明中特异性抗体的制备。
本发明还提供了一种ELISA检测百菌清农药残留的方法，是采用上述的百菌清多克隆抗体作为一抗。
所述的ELISA检测百菌清农药残留的方法，包括如下步骤
(1)包被：使用包被抗原对酶标板进行包被，100μL/孔，冰箱中过夜。洗板，洗涤液洗板，150μL/孔，3次，3min/次。
(2)封闭：用封闭液进行封闭；洗板同步骤(1)；
(3)加一抗和待测样品(等体积)：加入权利要求1的多克隆抗体(1∶2.56×104)和等体积待测样品溶液；进行孵育；
(4)洗板，加入辣根过氧化酶标羊抗兔二抗，进行孵育；
(5)洗板，加新鲜配制的OPD底物液显色；
(6)终止反应：加入终止反应液终止；
(7)结果测定：将测定其A值并扣除阴性对照A对照。
上述第(7)步的结果测定方式是：用酶标仪于490nm波长处进行扫描，测得各孔A值，减去阴性血清的空白对照值，即为测定真实A值。计算抑制百分率。
上述第(3)步中待测样品为水果或蔬菜提取液。
标准曲线绘制，是以系列浓度的百菌清标准样品替代待测样品，按上述方法实施。计算抑制百分率，同时以抑制百分率为纵坐标，浓度对数值(logC)为横坐标绘制标准曲线。
其中，方法中所使用试剂包括：
包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液；封闭液：1％OVA磷酸缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)；底物液：含10.0μLH2O2浓度为0.4mg/mL邻苯二胺磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.4)；终止液：2.0mol/L H2SO4；样品提取液：含0.15mol/LNaCl、10％甲醇的0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液。
本发明具有以下有益效果
本发明利用乙二胺取代百菌清分子4位碳原子上的氯原子合成半抗原，再采用1’1-羰基咪唑法将半抗原连接到载体牛血清白蛋白(卵清蛋白)分子上形成人工完全抗原(免疫抗原和包被抗原)，用该免疫抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，抗原/抗体特异性反应原理建立了间接ELISA法检测百菌清农药残留。本发明制备的百菌清抗体具有效价高(效价可达1∶5.12×104)、特异性好(见表2)的特点，所建立的ELISA方法具有简单、快捷、灵敏度高和检测通量大的优点，如酶标板采用预先包被和封闭后采用真空包装，0-4℃贮藏，可使样品检测在2.5h内完成，线性范围为0.001～1000μg/mL，最低检测限为0.383n g/mL(图8，以抑制率I20＝20％确定其检测限)，回收率为85.47％-91.27％。所述的半抗原制备过程是在常温下反应完成，具有反应条件易控，能耗低，反应时间短等特点。
附图说明
图1百菌清半抗原、人工完全抗原的合成路线图；
图2百菌清半抗原分子的红外光谱图；
图3百菌清半抗原分子的质谱图；
图4百菌清半抗原分子的核磁共振波谱图(氢谱)；
图5百菌清半抗原分子的核磁共振波谱图(碳谱)；
图6百菌清人工抗原，半抗原，BSA的紫外光谱图；
图7百菌清多克隆抗体效价测定曲线；
图8百菌清浓度对数对抑制率曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅作示例说明。
1.半抗原的分子设计及合成：百菌清半抗原及人工完全抗原的合成路线见图1。精密称取干燥的百菌清100.0mg(0.37mmol)溶解于20.0mL二氯甲烷中，在向其中加入乙二胺-水混合液(4.0mL-20.0mL)，反应体系形成两相，缓慢搅拌24h后，取二氯甲烷层，水洗10mL×3，旋转蒸发仪除去溶剂，得黄绿色粉末。以丙酮进行重结晶，得到纯净物质，具有如图2所示红外光谱图，如图3所示的质谱图，如图4所示的1H-NMR，如图5所示的13C-NMR，故鉴定为2，4，5-三氯-6-(2-氨基乙亚氨基)-间苯二氰，为百菌清半抗原。
2.人工完全抗原的合成：称取0.15mmol百菌清半抗原溶解于1.0mLDMF中，于室温条件下溶解，再加入用1.0mLDMF溶解的等摩尔1’1-羰基咪唑，于室温缓慢搅拌3h。将所得的反应体系缓慢滴加到用pH9.6的碳酸缓冲液(0.2mol/L，CBS)溶解的牛血清蛋白(BSA)/卵清蛋白(OVA)中(20.0mg/mL)，4℃搅拌6h，离心20min(6000r/min)弃沉淀，上清用8000-14000MW透析袋进行透析，3d，中间更换透析液，产物经冻干后，所得的乳白色固体即为百菌清人工抗原百菌清人工抗原(图7)。
3.特异性抗体的制备：将人工抗原用生理盐水稀释，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化，于新西兰大白兔背部皮下多点免疫，初次免疫剂量为0.5mg/kg。3周后加强免疫(弗氏不完全佐剂)，免疫剂量为初次免疫20％-30％，1次/2周，共4次。从第3次加强免疫开始，免疫后7d-10d耳缘静脉取血，采用直接竞争ELISA法测定抗血清的效价。免疫4次后，当效价符合测定方法要求时，颈主动脉放血，分离抗血清，采用饱和硫酸铵法纯化抗体，于-20℃保存备用。
4.ELISA法测定抗体效价：
(1)包被：包被抗原浓度为为10.0μg/mL(以包被缓冲液配制)，包被酶标板，每孔加入100μL，包被过夜。
(2)洗板：用PBST(含有0.05％Tween-20的0.01mol/L pH7.4PBS缓冲液)洗板3次，每孔加入150μL洗液，静置3min，甩掉洗液后，在吸水纸上将酶标板拍干。
(3)封闭：1％卵清蛋白溶液，每孔150μL，37℃温育1.0h。重复步骤(2)。
(4)抗原抗体反应：向各孔中加入不同稀释度抗体(以阴性血清为空白)，每孔100μL，取5组平行，37℃温育1h。抗血清稀释度为：将上述方法制备得到的多克隆抗体，以稀释50倍为起始值，进行倍比稀释。重复(2)。
(5)抗体与酶标二抗反应：向各孔中加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶1500)，37℃温育1h。重复(2)。
(6)显色：向各孔中加入以邻苯二胺(OPD)为底物的显色液，每孔100μL，37℃显色15min。此时，加入各浓度梯度抗体的孔内为黄色由深到浅的变化梯度。
(7)终止：加入终止液(2.0mol/L H2SO4)，每孔50μL，此时各孔颜色加深，由黄色到橘黄色的变化梯度。(8)测定：采用酶标仪在490nm测定其A值。A≈1.0时所对应的抗体稀释度即为其工作效价。
5.ELISA法检测蔬菜中百菌清的残留方法及回收率测定
(1)样品溶液的制备：准确称取蔬菜(叶菜类)可食部分20.0g，加入样品提取液20.0mL，以研钵充分研磨后，过滤，滤液即为待测样品溶液。
(2)取一块预先包被和封闭的酶标板1块，加入上述方法制备一抗和等体积样品溶液，总体积为100.0μL，37℃，孵育1h。
(3)以洗涤液洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(1∶1500，二抗)100.0μL，37℃，孵育1h。
(4)以洗涤液洗板3次，加入显色液100.0μL，37℃，孵育10min。
(5)加入终止液终止反应。
(6)于酶标仪490nm测定A值。计算其抑制百分率。
同时，以系列浓度的百菌清标准溶液替代样品溶液，重复上述步骤，计算抑制百分率。以抑制百分率为纵坐标，百菌清浓度对数值(logC)为横坐标，绘制标准曲线(图8)，根据表曲线计算样品中百菌清含量。
由图8可见，若以80％结合率为最低检出量，即抑制率为20％(I20)，则方法的检出限为0.383ng/mL。
表1 ELISA方法测定果蔬中百菌清含量回收率实验结果(n＝3，样品：小白菜)

表2 本发明制备的百菌清抗体对羟基百菌清和百菌清结构类似物的特异性(交叉反应率)