一种检测奶牛隐性乳房炎的诊断试剂及制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种兽医检验技术，确切讲是一种用于检测牛、羊、猪等哺乳动物隐性乳房炎的诊断试剂，本发明特别适用于检测奶牛隐性乳房炎。
背景技术
奶牛乳房炎是奶牛常见多发病之一，根据临床有无症状可分为临床型乳房炎和隐性乳房炎，其中大多数为隐性乳房炎。患隐性乳房炎的奶牛生产力降低，其损失约占每年总生产能力的10％左右；并且乳汁中的氨基酸总量降低21％，缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等6种必需氨基酸显著降低；乳汁中的乳糖、酪蛋白、脂肪、Ca2+、P3-、K+等有益成分的含量亦降低；而乳汁中的炎性因子、致病菌及其毒素含量则明显增加，影响消费者身体健康。隐性乳房炎发病率极高，同时易于传播并转化为临床型乳房炎，由于不显临床症状，肉眼很难判断，很容易被人们忽视，因此给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失。
当奶牛感染了隐性乳房炎，其乳汁成分及理化性质会发生改变，尤其是乳汁体细胞数异常升高，这是乳房炎一个明显的病理学特征。目前国内外公认的最准确的隐性乳房炎诊断方法就是乳汁体细胞计数(SCC)，直接计数的国家标准方法有传统的显微镜镜检法，该法工作量大，耗时多，还有专门的乳汁体细胞计数仪，由于检测成本高，很难普及使用。直接计数法最大的缺点就是不能进行现场诊断。美国加州乳房炎试验(CMT)，是国外研究工作者在上世纪50年代研制出的全球第一个隐性乳房炎诊断液，也是一种间接检测乳汁体细胞数的方法，它最大的特点就是实现了现场诊断，并且经济实用，至今仍在全世界广泛使用。但使用这种检测试剂需要进口，存在着成本高、购买不便等不足。目前国内已有同类的国产诊断试剂出现。
中国发明专利200510041616.4公开了一种奶牛隐性乳房炎诊断试剂，该试剂含有重量比的十二烷基苯磺酸钠73％～79％、一乙醇胺13％～17％、月桂酸-乙醇酰胺5％～9％、次氯酸钠1％～3％、硫酸钠2％～5％、其原料的总和为100％。由于该专利未使用指示剂，会影响肉眼对结果的判断，从而降低诊断准确性。
中国发明专利200510049389.X公开了一种奶牛隐性乳房炎诊断试剂。它将50～70份硼砂、47～49份硼酸、1份溴钾酚和190～210份十二烷基硫酸钠混合均匀，获得淡黄色固体粉末。取该粉末15.45g溶解于500mL水中，形成一种紫红色的液体，可用于诊断奶牛隐性乳房炎。该专利产品虽便于携带运输，但它是一种固体混合物，各种成份，尤其含量低的成份难以完全混匀，难免影响诊断结果的稳定性。
中国发明专利申请200710022802.2公开的奶牛隐性乳房炎的诊断试剂盒，定名为“双N-奶牛隐性乳房炎快速诊断试剂盒”，专用于奶牛隐性乳房炎诊断，其主要成分为硝酸银、铬酸钾。该专利的诊断机理是基于乳汁氯化物检测，而目前乳汁细胞计数被公认为诊断隐性乳房炎最准确。
中国发明专利200510045149.2公开的牛、羊、猪快速诊断试剂，其组方及重量百分比为：十二烷基苯磺酸钠2.5～30％、氢氧化钠1～15.5％、迭氮化钠0.05～0.5％、溴甲酚紫1～10％、水45～95％。该专利中使用了毒性较大的迭氮化钠。
【发明内容】
本发明提供一种可克服现有技术不足，用于检测奶牛隐性乳房炎检测试剂；同时本发明提供这种试剂的制备方法。
本发明的检测试剂是由质量百分比为8.8～9.2％的十二烷基硫酸钠、4.8～5.2％的直链烷基苯磺酸、0.5～0.6％的硼酸、0.04～0.08％的溴甲酚紫、0.6～0.8％的氢氧化钠及余量的水构成。
本发明检测奶牛隐性乳房炎的诊断试剂的制备方法是：
a.先将十二烷基硫酸钠、直链烷基苯磺酸、硼酸混合后，加适量水搅拌使其充分溶解；
b.再由a得到的溶液中加入溴甲酚紫水溶液并充分搅拌均匀；
c.再由b得到的溶液中加入氢氧化钠水溶液，调整混合液的颜色至绛紫色；
d.再由c得到的溶液中加蒸馏水至100％，并搅拌均匀得到所需要的试剂。
本发明诊断试剂的使用方法，其特征是试剂使用前先用水稀释3倍，从奶牛四个乳室分别采集约2mL乳样在诊断盘的四个检验杯内，然后在每个检验杯内分别加入约2mL的稀释诊断试剂，诊断盘做水平同心圆旋转摇动5～15秒钟，使奶样与诊断试剂充分混合，根据样品产生的凝集物性状及颜色判定诊断结果。
使用本发明进行检测时建立了一个隐性乳房炎判断标准：
表1本发明诊断奶牛隐性乳房炎的判定标准
乳房炎等级 乳汁体细胞数 (万/mL) 判定依据
阴性(-) 0～20 混合物呈液状，倾斜检验杯时，液体移动流畅， 杯底无沉淀物。
可疑(±) 15～50 混合物呈液状，旋转检验杯时，杯底出现微量沉 淀物，继续稍加摇动，沉淀物旋即消失。一般情 况作为阴性处理。
弱阳性(+) 40～150 杯底出现少量稀薄粘性沉淀，但不成胶状，倾斜 检验杯时，沉淀物散布于杯底，有一定粘附性。
乳房炎等级 乳汁体细胞数 (万/mL) 判定依据
阳性(++) 80～500 杯底沉淀物较多，也较粘稠，并有少量胶状物， 倾斜检验杯时，沉淀物有明显粘附于杯底而难以 流动现象，旋转摇动时，沉淀物有聚中心倾向。
强阳性(+++) 350以上 杯内混合物的大部分或全部形成明显胶状凝集 物，几乎完全粘附于杯底，旋转检验杯时，凝集 物居中呈团块难以散开。
本发明可完全克服现有技术的不足，并且有较高的诊断敏感性。本发明具有如下优点：
1)产品未使用毒性大的化合物，使用中不会对环境造成大的危害。
2)产品稳定，不仅诊断结果可靠，而且在室温密闭下可长期存放。
3)本产品是浓缩产品，使用时用水稀释3倍左右既可(稀释2～6倍不影响诊断结果)，稀释液很稳定(可存放两年以上)，非常实用和方便。
4)应用本发明进行检测是基于乳汁细胞计数，具有较高的诊断准确性。
5)本发明的诊断试剂具有生产工艺简单、诊断快速及价格低廉的优势。
【具体实施方式】
本发明诊断试剂由以下组份质量百分比组成：
8.8～9.2％的十二烷基硫酸钠，4.8～5.2％的直链烷基苯磺酸，0.5～0.6％的硼酸，0.04～0.08％的溴甲酚紫，0.6～0.8％的氢氧化钠，蒸馏水加至100％。
具体做法是称取以上组方配比的原材料，首先将十二烷基硫酸钠、直链烷基苯磺酸和硼酸预先混合，加入适量蒸馏水搅拌使其充分溶解，再加入溴甲酚紫水溶液搅拌均匀，然后用氢氧化钠水溶液调节混合物的颜色至绛紫色，最后加蒸馏水至100％，搅拌均匀后分装，在密闭、干燥、阴凉处可长期存放。
具体的应用时，是将上述制备的试剂先用水稀释3倍，作为具体使用的诊断液。受检样品是被检泌乳奶牛的奶样，采集时先弃去奶牛的前两把奶，再将四个乳区的奶样分别挤在诊断盘的四个检验杯内，倾斜使检测杯中多余的奶样外溢至使每个检验杯内仅存大约2mL左右，然后再在每个检验杯内分别加入已稀释的诊断液约2mL，水平同心圆旋转摇动诊断盘5～15秒钟，使奶样与诊断液充分混合，根据凝集物出现及颜色变化判定诊断结果。
实验例
本发明诊断符合率试验
1试验材料
诊断液(按前述方法制备并稀释)，CMT诊断液(进口英国COX产品)，乳汁细胞计数仪(美国Bently)，双目生物显微镜(国产XSZ-107型)，载玻片，Loefflers美蓝染液，二甲苯，95％乙醇。
2试验方法
2.1奶样采集：
乳样采自兰州、成都、哈尔滨、郑州、济南和南昌等城市的部分奶牛场。先用含有消毒剂的温水将奶牛乳房、乳头擦洗干净，弃去头两把奶，再用本发明法诊断奶牛隐性乳房炎，然后将需要采集的奶样挤入灭菌容器内，用于CMT、传统显微镜镜检、乳汁细胞计数仪等其它对照方法进行隐性乳房炎检测。
2.2奶牛隐性乳房炎诊断：
共采集乳样206份，在24小时内用本发明和CMT进行诊断，并将乳样涂片保存，用于传统显微镜检测(Little和Plastrdge法)，然后在乳样中加入重铬酸钾防腐剂，在一周内送往有乳汁细胞计数仪的单位进行乳汁细胞计数。通过比较本发明与CMT、显微镜、乳汁细胞计数仪等的隐性乳房炎诊断(乳汁体细胞检测)结果，计算本发明的诊断符合率。
3结果
试验结果见表2，本发明的诊断结果与CMT、显微镜、细胞计数仪的诊断结果都有很高的符合率，其中阳性诊断符合率高达98％以上，阴性诊断符合率也在94％以上。前面已经提到，CMT(加利福尼亚乳房炎试验)是目前世界普遍认可的一种间接测定乳汁细胞的方法，本发明与其有相同的诊断机理。而显微镜法和细胞计数仪则是直接测定乳汁细胞的国家标准方法。本发明与以上3种诊断法比较，诊断符合率高达95％以上，说明本发明诊断方法完全能够达到奶牛隐性乳房炎的诊断要求。目前国内已有不少本发明的同类产品，如BMT、HMT、YMT等，与这些同类国产诊断方法比较，本发明表现出更高的诊断敏感性，这是因为间接乳汁细胞计数法属于半定量的诊断方法，需要通过肉眼判断检测结果，本发明反应更便于肉眼观察及判断。
表2本发明诊断符合率测定结果
诊断方法 本发明 CMT 显微镜镜检 细胞计数仪
乳房炎阴性检出乳样(份) (乳汁体细胞50万/mL以下) 50 48 47 52
本发明阴性诊断符合率 96.0％ 94.0％ 96.2％
乳房炎阳性检出乳样(份) (乳汁体细胞50万/mL以上) 156 158 159 154
本发明阳性诊断符合率 98.7％ 98.1％ 98.7％