一种基于激光共聚焦扫描显微镜系统的外周神经系统氯成像方法 技术领域：
本发明属于激光共聚焦成像领域，涉及一种基于激光共聚焦扫描显微镜系统的外周神经系统氯成像方法。
背景技术：
氯离子是机体内最丰富的阴离子。调控细胞内外氯离子浓度的氯通道广泛存在于机体的细胞膜和细胞器膜。氯通道在细胞多种活动和调节过程如细胞增殖、凋亡、细胞兴奋性调节、pH调节、容量调节和免疫应答中均发挥重要作用。因此，氯离子稳态是维持细胞各项代谢活动的必要条件，一旦氯离子稳态被破坏，细胞就会受到功能性或器质性损害甚至死亡。
激光共聚焦扫描显微镜系统是近年推出的集激光技术、电子技术、光学设计及计算机于一体的影像检测仪。其特点是照明点和探测点共轭，具有高分辨率和深度识别能力，可对生物样品(脑组织切片、活细胞等)进行无损伤光切，并可通过三维重建，得到样品的三维立体结构。它的另一个重要的特点是可实时观察活组织切片及细胞内各种离子的动态变化。利用激光共聚焦扫描显微镜系统观察脑片或者单个神经元内氯离子浓度的变化是新的细胞内氯离子浓度检测方法，能够可视化检测不同区域、不同细胞的氯离子浓度水平。
在过去的二、三十年中，氯测定一直局限于电生理学方法，无法进行可视化检测。现在，由于指示剂选择和监测系统方面都获得了快速的发展，细胞内氯成像探针(缩写MQAE，全称为N-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide)的研发成功使得氯离子测定成为可能。但是，如何针对外周神经系统内特定细胞(即神经节细胞)进行氯离子浓度测定、如何可视化细胞内氯离子浓度、如何实时、动态地监测氯离子浓度变化情况，国内尚未见报道。本技术的建立将为揭开氯离子生理和病理作用的奥秘提供支持，并为人类认识和最终战胜由氯离子稳态失衡造成的临床疾病提供线索。
发明内容：
本发明为一种基于激光共聚焦扫描显微镜系统的外周神经系统氯成像方法。
本发明的目的在于实现3个可能：使针对单个外周神经系统内细胞(主要是神经节细胞)进行氯离子浓度测定成为可能、使细胞内氯离子浓度可视化成为可能、使实时动态地监测氯离子浓度变化情况成为可能。
针对以上问题，本发明要解决的技术难题主要是两个：第一，如何向外周神经系统单个神经节细胞导入氯成像探针MQAE，并保证该探针工作正常；第二，如何利用激光共聚焦显微镜记录细胞内氯离子浓度信号，并保证该结果真实有效。
为此，本发明提供了一种基于激光共聚焦扫描显微镜系统的外周神经系统氯成像方法，按照如下步骤：
(1)单个神经节细胞与氯离子荧光探针MQAE共孵育；
(2)激光共聚焦显微镜成像、记录；
(3)校正单个神经节细胞内氯离子荧光探针MQAE荧光值。
所述步骤(1)是指：将分离得到的外周神经系统单个神经元(即神经节细胞)滴加到细胞培养用24孔板内预先放置的圆形盖玻片上。圆形盖玻片在使用前经浓度为1毫克每毫升的多聚酪氨酸溶液包被，使之易于细胞贴附。加入终浓度为5毫摩尔的氯成像探针(缩写MQAE，全称为N-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide)少许(100-200微升)。在温度设置为37℃的恒温培养箱(最好使用专用细胞培养箱)中培养20分钟左右。在此期间，将氧气和二氧化碳气同时注入另外的新鲜配制的中性缓冲液(Krebs-HEPES缓冲液)中。待培养结束后，用此缓冲液置换神经节细胞探针液，以除去细胞外残余的氯成像探针(MQAE)(要求洗1次，5分钟)。之后，在激光共聚焦显微镜下观察。
所述步骤(2)是指：首先在激光共聚焦显微镜成像前，准备中性缓冲液(Krebs-HEPES缓冲液)，要预先通入浓度为95％的氧气和浓度为5％的二氧化碳气。然后将缓冲液经实验用输液管匀速输入灌流槽中，灌流速度不能超过0.5到1.0毫升每分钟。再将此灌流槽放置于激光共聚焦显微镜的载物台上。这时，将步骤(2)所得贴附有神经节细胞的盖玻片浸入灌流槽内。用显微镜的目镜选定所需要的部位。开启共聚焦显微镜紫色半导体激光器，经过显微镜上分光镜过滤得到波长为405纳米的紫外光。该束紫外光经显微镜的物镜聚焦后，能够激发神经节细胞内的氯成像探针MQAE。氯成像探针MQAE被激发后发出波长为440纳米的发射光，此发射光沿同一光路进入物镜，穿过分光镜后在探测针孔处成像，后经光电倍增管接收、放大后迅速在计算机显示屏上形成荧光图像。共聚焦显微镜以电信号的形式记录图像后，通过自带软件进行图像处理，最后获得氯成像图片。
所述步骤(3)是指：此时需要对以上获得的氯成像结果进行校准。首先将孵育液更换，换为里面不含氯离子的中性缓冲液，即校正人工脑脊液。正常人工脑脊液内含有氯化钠，所以带有氯离子，而我们使用的改良后校正人工脑脊液，是用等摩尔的硫酸钾盐替换氯化钠，从而去除正常人工脑脊液的氯离子，达到我们需要的标准。在这种校正人工脑脊液中加入氯离子转运体抑制剂以平衡神经节细胞内外氯离子浓度，同时加入氢离子转运体抑制剂以保证测定过程中细胞内酸碱值保持不变。经过抑制剂处理20分钟后，理论上，这时神经节细胞内外的氯离子浓度相平衡，就设此时细胞内氯离子浓度为零，即基准值。此时，氯离子成像探针所发出的荧光强度是最小，我们记之为F0值。然后，我们将酸碱度为中性的校正人工脑脊液内，依次加入浓度为20毫摩尔、40毫摩尔、60毫摩尔和125毫摩尔的氯化钠，这样获得已知氯离子浓度的校正人工脑脊液。需要注意的是，需要在校正缓冲液中同时加入三丁基锡和尼日利亚菌素，以抑制其它阴离子在细胞膜内外运动。神经节细胞在不同校正人工脑脊液的孵育下，将产生不同的荧光强度，我们记之为F0值。然后，我们将酸碱度为中性地校正人工脑脊液内，依次加入浓度为20毫摩尔、40毫摩尔、60毫摩尔和125毫摩尔的氯化钠，这样获得已知氯离子浓度的校正人工脑脊液。需要注意的是，需要在校正缓冲液中同时加入三丁基锡和尼日利亚菌素，以抑制其它阴离子在细胞膜内外运动。脑片在不同校正人工脑脊液的孵育下，将产生不同的荧光强度，记之为FCl-。荧光强度FCl-均对应已知的氯离子浓度，这样即可得到氯离子浓度与荧光信号之间的二维相关系数。最后，缓冲液内加入150毫摩尔的硫氰酸钾，以完全淬灭胞内染料，使此时荧光强度归零，记为FSCN。最后，根据Stern-Volmer公式，F0/FCl-＝K·[Cl-]i。其中，[Cl-]i代表细胞内氯离子浓度；F0＝FCl--FSCN。K为Stern-Volmer淬灭常数，代表荧光淬灭率达到50％时的细胞内氯离子浓度[Cl-]i。根据以上获得的数据做出标准曲线，计算出常数K。
实施过程中主要考虑了以下因素：(1)采用的MQAE染料为可见光激发，自发荧光小，对细胞的损害较小，易于通过扩散进入细胞，不易发生渗漏和区室化；(2)实验体系的构建适用于激光共聚焦显微镜系统，保证该体系的构建更适合于目前实验室装备；(3)实验中所用试剂的浓度、温度和时间都经过反复测试，能够有效避免染料高浓度聚集；(4)本流程中在指示剂负载前记录待测细胞的背景荧光，而后从实际测量结果中减去此背景值，保证自发荧光对结果的影响；(5)激光共聚焦显微镜采用激光束作光源，激光束通过照明针孔和物镜以聚焦的方式对标本进行层层扫描而收集氯信号，在此过程中，焦平面以外的散射光线不能通过探测针孔而使测得的氯信号具有很强的空间分辨率。
综上所述，本发明的优点明确，主要是3点：第一，可定量检测单个外周神经系统特定细胞(即神经节细胞)内氯离子浓度及其变化情况；第二，对所检测神经节细胞内氯离子浓度以荧光形式可视化展示出来；第三，由于采用的氯成像探针MQAE在可见光下被激发，故自发荧光小，因此保证该种检测手段对细胞的损害最小，结果更为可靠。
具体实施方式：
基于激光共聚焦扫描显微镜系统的外周神经系统氯成像方法，按照如下步骤：(1)单个神经节细胞与氯离子荧光探针MQAE共孵育；(2)激光共聚焦显微镜成像、记录；(3)校正单个神经节细胞内氯离子荧光探针MQAE荧光值。
1.单个神经节细胞与氯离子荧光探针MQAE共孵育：
(1)将得到的神经节细胞滴加到细胞培养用24孔板内预先放置的圆形盖玻片上。圆形盖玻片在使用前经浓度为1毫克每毫升的多聚酪氨酸溶液包被，使之易于细胞贴附。
(2)将终浓度为5毫摩尔的氯成像探针(缩写MQAE，全称为N-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide)少许(100-200微升)加入每个孔中，然后在温度设置为37℃的恒温培养箱(最好使用专用细胞培养箱)中培养20分钟。
(3)在此期间，将氧气和二氧化碳气同时注入另外的新鲜配制的中性缓冲液(Krebs-HEPES缓冲液)中。待培养结束后，用此缓冲液置换神经节细胞探针培养液，以除去细胞外残余的氯成像探针(MQAE)。之后，在激光共聚焦显微镜下观察。
2.激光共聚焦显微镜成像、记录；
(4)在激光共聚焦显微镜成像前，准备中性缓冲液(Krebs-HEPES缓冲液)，要预先通入浓度为95％的氧气和浓度为5％的二氧化碳气。然后将缓冲液经实验用输液管匀速输入灌流槽中，灌流速度不能超过1.5到2.0毫升每分钟。
(5)再将此灌流槽放置于激光共聚焦显微镜的载物台上。这时，将所得到的贴附有神经节细胞的盖玻片浸入灌流槽内。用显微镜的目镜选定所需要的部位。
(6)开启共聚焦显微镜紫色半导体激光器，经过显微镜上分光镜过滤得到波长为405纳米的紫外光。该束紫外光经显微镜的物镜聚焦后，能够激发神经节细胞内的氯成像探针MQAE。氯成像探针MQAE被激发后发出波长为440纳米的发射光，此发射光沿同一光路进入物镜，穿过分光镜后在探测针孔处成像，后经光电倍增管接收、放大后迅速在计算机显示屏上形成荧光图像。
(7)共聚焦显微镜以电信号的形式记录图像后，通过自带软件进行图像处理，最后获得氯成像图片。
3.校正神经节细胞内氯离子荧光探针MQAE荧光值。
(8)将孵育液更换，更换为里面不含氯离子的中性缓冲液，即校正人工脑脊液。正常人工脑脊液内含有氯化钠，所以带有氯离子，而我们使用的改良后校正人工脑脊液，是用等摩尔的硫酸钾盐替换氯化钠，从而去除正常人工脑脊液的氯离子，达到我们需要的标准。在这种校正人工脑脊液中加入氯离子转运体抑制剂以平衡细胞细胞内外氯离子浓度，同时加入氢离子转运体抑制剂以保证测定过程中细胞内酸碱值保持不变。经过抑制剂处理20分钟后，理论上，这时神经节细胞内外的氯离子浓度相平衡，就设此时神经节细胞内氯离子浓度为零，即基准值。此时，氯离子成像探针所发出的荧光强度是最小，我们记之为F0值。
(9)将酸碱度为中性的校正人工脑脊液内，依次加入浓度为20毫摩尔、40毫摩尔、60毫摩尔和125毫摩尔的氯化钠，这样获得已知氯离子浓度的校正人工脑脊液。需要注意的是，需要在校正缓冲液中同时加入三丁基锡和尼日利亚菌素，以抑制其它阴离子在细胞膜内外运动。神经节细胞在不同校正人工脑脊液的孵育下，将产生不同的荧光强度，记之为FCl-。荧光强度FCl-均对应已知的氯离子浓度，这样即可得到氯离子浓度与荧光信号之间的二维相关系数。
(10)最后，缓冲液内加入150毫摩尔的硫氰酸钾，以完全淬灭胞内染料，使此时荧光强度归零，记为FSCN。
(11)根据Stern-Volmer公式，F0/FCl-＝K·[Cl-]i。其中，[Cl-]i代表细胞内氯离子浓度；F0＝FCl--FSCN。K为Stern-Volmer淬灭常数，代表荧光淬灭率达到50％时的细胞内氯离子浓度[Cl-]i。根据以上获得的数据做出标准曲线，计算出常数K。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。