LTBP-2在制备检测心力衰竭试剂盒中的应用及含有该蛋白的试剂盒 【技术领域】
本发明涉及一种辅助性转化生长因子结合蛋白2(LTBP-2)的新用途，具体地说是一种利用辅助性转化生长因子结合蛋白2在制备检测心力衰竭试剂盒中的应用。
背景技术
TGF-β最初由鼠类肉瘤中分离出来，可以增强表皮生长因子(EGF)对非肿瘤成纤维细胞的转化和增殖活性。人体几乎每种细胞都可以产生TGF-β，生理情况下TGF-β可以调节细胞的增殖、分化、参与胚胎发育、免疫调节等过程，在许多疾病状态下，TGF-β产生增多，如肿瘤、纤维化疾病及遗传性出血性毛细血管扩张。研究表明肿瘤细胞及其基质细胞产生大量TGF-β，增加新生血管形成，抑制免疫，促进肿瘤转移侵犯其他器官。TGF-β与心血管疾病也有密切联系。
成熟的TGF-β是由两个结构相同或相近的、分子量12.5kDa的亚单位通过二硫键形成的二聚体，但从细胞中分泌出来时，是以无活性的复合体L-TGF-β形式存在的。这种无活性的复合体又有两种形式：由成熟TGF-β通过其N-末端与LAP非共价结合，LAP又与辅助性转化生长因子结合蛋白(LTBPs)共价结合，形成LTBPs-LAP-TGF-β复合物，称为LL-TGF-β；另一种形式仅由成熟TGF-β通过其N-末端与LAP非共价结合形成，称为SL-TGF-β。
L-TGF-β复合体通过LTBP结合到细胞外基质(ECM)中，以无活性的形式贮存下来。而L-TGF-β的激活是蛋白酶依赖性的，血小板反应蛋白1和纤溶酶可以切断LAP与成熟TGF-β间的非共价结合，使成熟TGF-β从L-TGF-β复合体中释放出来，与其受体结合，发挥生物学作用。
辅助性转化生长因子结合蛋白(LTBPs)是一类细胞外基质糖蛋白，主要包括4个亚型LTBP-1、LTBP-2、LTBP-3、LTBP-4，属于LTBPs/fibrillins超家族，蛋白质结构中含有2种不同的富含半胱氨酸的重复序列，EGF样6-半胱氨酸重复序列和8-半胱氨酸重复序列，大部分LTBP可与SL-TGF-β结合，辅助L-TGF-β的分泌和在ECM中贮存。EGF样序列介导了多种非共价结合作用，而8-半胱氨酸重复序列介导了蛋白与蛋白间的共价结合作用。
LTBP-2基因定位于14q24，分子量240KDa。肺部是LTBP-2表达最多的部位，其他如肝、脾、骨骼肌、胚胎和心脏中也有少量表达。LTBP-2含有20个EGF样序列(其中16个可与Ca2+结合)和4个8-半胱氨酸重复序列(N-端第1个为杂交序列)。LTBP-2氨基末端的2个EGF样序列与其他EGF样序列不同，氨基末端的第1个8-半胱氨酸重复序列缺少1个半胱氨酸残基，与另外3个8-半胱氨酸重复序列有差别。与其他LTBPs不同，LTBP-2的第3个8-半胱氨酸重复序列中缺少能与LAP结合所必需的共同序列，以致不能与L-TGF-β共价结合。与TGF-β结合的8-半胱氨酸重复序列内有特殊的基序，LTBP-2和fibrillins与其无结合能力，但将此特殊基序插入LTBP-2的第3个8-半胱氨酸序列中，将使LTBP-2获得与SL-TGF-β的结合能力。LTBP2可与LTBP1竞争与fibrillins的结合从而负性调节LTBP1与微纤维的结合。另外，在LTBP2的N末端有整联蛋白识别的序列RGD，证实它参与了细胞粘附作用。
LTBP-2的功能包括参与TGF-β的组装、分泌和活化；促进TGF-β在ECM中贮存；参与细胞粘附作用等。
心力衰竭是由于初始的心肌损害和应力作用：包括收缩期或舒张期心室负荷过重和(或)心肌细胞数量和质量的变化，引起心室和(或)心房肥大和扩大继以心室舒缩功能低下，逐渐发展而成。是一种世界范围内的严重疾病，它不是一个独立的疾病，是由多种因素导致，其分子机制并不清楚，可能与相关的基因和蛋白质等表达异常有关。基因是决定心血管疾病表型的重要物质，基因芯片技术普遍用于检测心衰中基因表达的改变，为研究心衰内在的分子机制提供了一个很好的技术平台。(Global gene expression in the failingmyocardium.Circulation，2009，73(9)：1568-76.)
基因芯片技术在1991年的Science杂志上被首次提出，其高通量，并行检测的特点适应了分析人类基因组计划提供的海量的基因序列信息的需要，可以说，人类基因组计划是基因芯片技术发展的原因，而对深入研究基因突变和基因表达的有效方法的需要又是促进基因芯片技术发展的动力。最近发展起来的技术利用检测基因序列来识别基因相对应的蛋白质并阐述其功能，这也是功能基因组学的目的所在。DNA芯片与其他技术相比，因其相对容易操作和应用以及实用性而发挥主导作用，它可在基因水平及转录水平同时分析来源于病理或正常组织的上千个基因，识别特定疾病的新的标记物，包括用于早期诊断和预防的生物标记物。(DNA arrays：technological aspects and applications.BullCancer，2001；88(3)：243-52)。根据固定在芯片载体上的核酸分子不同，基因芯片可以分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片等。
基因芯片技术的基本原理：基因芯片系统由基因芯片、芯片处理器、芯片阅读器和芯片分析软件4部分组成。其基本原理是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内地千万个核酸分子(靶)所组成的微点阵阵列在一定条件下与来自样品的序列互补的核酸片段(探针)杂交，样品中的核酸片段进行不同的荧光标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号，芯片分析软件进行分析。(Gene expression profiling by DNA microarray technology.Crit.Rev.OralBiol.Med.2002，13；35)
基因芯片技术的主要特点：基因芯片技术上的特点是具有高度可行性、多样性、微型化和自动化四大特点。高度并行性有利于基因芯片所示图谱的快速对照和阅读，工作效率大大提高；多样性提供了样品的多指标测定；微型化能大大节约所需样品和试剂用量，降低成本；自动化既减少了人力投入又保证了质量。同时，基因芯片还具有操作方便、信息综合处理能力强、结果可靠和仪器配套齐全等优势。
目前，我们还没有单一的一个标记或多个标记的组合来解决心衰相关的诸多问题。即使文献中常报道的心衰BNP标记也未能满足一个理想标记的要求，另一方面，一些现有的生物标记在心衰中的作用被忽视了。(Genetic Markers，Progress and Potential for Cardiovascular Disease.Gary H.Gibbons，MD，etc，Circulation.2004；109[suppl IV]：IV-47-IV-58.)
【发明内容】
本发明的目的在于提出一种辅助性转化生长因子结合蛋白2(LTBP-2)的新用途，并且提出一种含有该蛋白的可以高效准确的检测心力衰竭疾病的试剂盒。
本发明的发明思路为：本发明发明人使用基因芯片的方法找到新型心衰生物标记。LTBP-2含有20个EGF样序列(其中16个可与Ca2+结合)和4个8-半胱氨酸重复序列(N-端第1个为杂交序列)。LTBP-2氨基末端的2个EGF样序列与其他EGF样序列不同，氨基末端的第1个8-半胱氨酸重复序列缺少1个半胱氨酸残基，与另外3个8-半胱氨酸重复序列有差别。LTBP2的功能包括参与TGF-β的组装、分泌和活化；促进TGF-β在ECM中贮存；参与细胞粘附作用等。
根据本发明的发明思路，发明人提出了LTBP-2在制备检测心力衰竭试剂盒中的应用，以及含有LTBP-2特异性结合抗体的试剂盒。其中LTBP-2基因为本领域技术人员公知的基因。(genbank编号：NM_000428)。
根据上述发明内容，本发明提出一种用于检测心力衰竭的试剂盒，其包含有所述的辅助性转化生长因子结合蛋白(LTBP-2)特异性结合的抗体，抗体的制备方法为本领域公知方法，在此不赘述。
上述用于检测心力衰竭的试剂盒，还包含有：抗原包被的微孔板，酶标抗人IgG及其它试剂制成，应用双抗体夹心法ELISA原理检测辅助性转化生长因子结合蛋白2。
具体组分如下：
1)酶联板：一块(96孔)12×8可拆分的微孔板包被有经过纯化的抗LTBP2抗体，密封在装有干燥剂的包装袋内。
2)标准品：冻干的标准品按照标签说明，用酶免分析用EIA级别的纯水溶解。含胎牛血清、重组LTBP2、10mmol/L磷酸缓冲液(pH值7.4±0.1)、0.02％硫酸庆大霉素和0.1％kathonGC防腐剂。
3)样品稀释液：1×20ml/瓶
4)检测稀释液A：1×10ml/瓶生物素标记抗体稀释液
5)检测稀释液B：1×10ml/瓶辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液
6)检测溶液A：1×120ul/瓶生物素标记抗体(1∶100)
7)检测溶液B：1×120ul/瓶辣根过氧化物酶标记亲和素(1∶100)
8)底物溶液：1×10ml/瓶含有50mmol/L枸橼酸盐，磷酸盐缓冲液(pH值3.5～3.8)、4％二甲基亚砜(DMSO)、0.03％3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)和0.02％H202)。
9)浓洗涤液：1×30ml/瓶20×浓缩液。稀释后的洗涤液中含有10mmol/L磷酸缓冲液(pH值7.4±0.2)、0.05％吐温20和0.1％kathonGC防腐剂。
10)终止液：1×10ml/瓶0.3mmol/L硫酸溶液。
本发明的优点和有益效果：
本发明提出了一种LTBP2的新用途。本发明经实验验证LTBP2可以用于检测各种心肌病导致的心力衰竭，并且纵向和横向比较LTBP2在心衰中的生物标记物的地位，本发明的这种用血清快速准确检测LTBP-2来评估终末期心脏病的方法具有极大的临床意义和推广意义。在ARVC所致心衰组LTBP2表达差异显著，上调7.7倍。本发明LTBP2制备的检测心力衰竭的试剂盒优势：有敏感度和特异性高，血清稀释比例高，现有技术也有用血清学检测的，但是敏感性等不甚理想，与现有检测心衰的方法相比较，成本低、效率高、使用方便等。
【附图说明】
图1基因芯片和实时RT-PCR检测心衰和非心衰心肌组织LTBP2表达变化；
图2苏木素伊红(HE)染色ARVC心肌组织光镜所见；
图3ROC曲线分析进行LTBP2和NT-proBNP敏感性和特异性的比较；
图4LTBP2试剂盒进行终末期心衰组和正常组血清LTBP2表达比较。
【具体实施方式】
本发明所用实验样本和设备来源：
1.心脏标本来源：5例患致右室心律失常型心脏病(ARVC)心衰终末期接受心脏移植的心脏标本和5例非心衰的对照心脏标本。所有终末期心衰的患者大都达到心衰纽约分级(NYHA)的III-IV，平均射血分数(EF)25.4±7.9％，无合并其他重要脏器疾病。心衰和非心衰患者的临床和血流动力学资料见表1。非心衰对照组是5例由于意外事故死亡的捐赠心脏，均为健康个体。所有病人和对照组对这个研究均签有书面的知情同意书，并且经中国医学科学院阜外心血管病医院伦理学术委员会的同意。
表1心衰和非心衰患者的临床和血流动力学资料
ARVC：致右室心律失常性心肌病，NF：正常心脏，NYHAclass：纽约心力衰竭分级，CI：心脏指数，PAP：肺动脉压力，PVR：肺血管阻力，CVP：中心静脉压，PAWP：肺毛细血管契压，LVEF：左室射血分数。
2、主要仪器来源：Scanarray Express扫描仪(ParckardBio公司)、GenePix Pro4.0图像分析软件(Axon Instruments公司)、PCR扩增仪等。
实施例1：LTBP-2与心力衰竭关系实验
致右室心律失常型心脏病(ARVC)目前病因尚不明确，主要特点是由于右心室心肌被纤维脂肪组织取代引起反复的室性心律失常。我们的5例ARVC的心衰患者主要表现为左心室功能不全，并且病理证实左室游离壁被纤维脂肪组织取代。每个标本取自心脏移植后心衰心脏的左室游离壁和非心衰捐献心脏。部分标本立即冷冻保存于液氮中，供基因芯片、实时PCR用，其余标本固定于10％福尔马林供病理检查。
具体步骤：
1)基因芯片：使用CapitalBio公司的70-mer寡核苷酸芯片检测ARVC心衰患者和健康对照组的心肌组织的多种基因，购于QIANGEN的人类35000个基因印迹于氨基硅烷玻片上，微阵列由OmniGrid微阵列机制备，提取心衰组和对照组的心肌样本5μg总RNA，荧光染料标记的DNA通过Eberwine线性RNA扩增方法及后续的酶促反应得到。芯片于42摄氏度杂交过夜，根据说明书分析多个基因，然后用ScanArray Express scanner扫描仪获取图片，使用GenePix pro4.0软件分析，把图像信号转化为数字信号，LOWESS程序用来标准化空间及信号强度。
2)Real-time PCR：为了进一步证实基因芯片结果，进行Real-time PCR分析。GAPDH做内参，设计引物，提取10个心脏样本(基因芯片筛选实验中5个非心衰样本和5个心衰样本)的总RNA 5μg，纯化得到500ng，在200U M-MLV逆转录酶作用下逆转录。依照说明书操作，使用SYBR green I试剂盒和LightCycler(购于Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)进行实时检测和定量扩增。结果由LightCycler3.5软件分析，扩增产物进行溶解曲线分析和1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，比较心衰组与非心衰组产物量的改变。
3)实验结果：
本发明第一次涉及LTBP-2在终末期心脏病中的表达情况，并且从纵向和横向比较LTBP-2在心衰中的生物标记物的地位，我们发明的这种用血清快速准确检测LTBP2来评估终末期心脏病的方法具有极大的临床意义和推广意义。
(1)相比于非心衰组，在ARVC所致心衰组有77个基因普遍和持续的表达改变至少1.5倍以上，其中有35个基因表达上调、42个基因表达下调。LTBP-2表达差异显著，上调7.7倍。见表2。
表2.ARVC所致心衰组与正常组的基因表达差异：ARVC Failing hearts：致右室心律失常性心肌病所致心力衰竭，Non-failing hearts：非心力衰竭心脏，FoldIncrease：增加倍数
(2)通过实时RT-PCR证实，LTBP2的mRNA在ARVC所致的心衰患者心肌中的含量是非心衰心肌中含量的9.24倍，基因芯片的结果则显示心衰心肌组织中的含量是非心衰心肌中的7.7倍，均为表达上调，改变趋势一致，结果见图1，图1为基因芯片和实时RT-PCR检测心衰和非心衰心肌组织LTBP-2表达变化。基因芯片和实时PCR检测心衰组比非心衰组LTBP-2表达上调分别为7.7倍和9.24倍，表达改变趋势一致。LTBP-2：辅助性转化生长因子结合蛋白2；ARVC-HF：致右室心律失常性心肌病所致心衰组；NF：正常非心衰对照组。
(3)光镜检查可见ARVC心肌组织不同程度的被纤维脂肪组织取代，这是诊断ARVC的特异性表现之一。ARVC-HF：致右室心律失常性心肌病所致心衰组；NF：正常非心衰对照组。结果见图2，图2为苏木素伊红(HE)染色光镜所见。可见ARVC心肌组织不同程度的被纤维脂肪组织取代，这是诊断ARVC的特异性表现之一。A：正常非心衰对照组；B：致右室心律失常性心肌病所致心衰组。
(4)ROC曲线分析进行NT-proBNP和LTBP-2敏感性和特异性的比较SPSS软件中ROC曲线分析可对不同的检验方法进行科学评价，把方法的敏感性与特异性结合起来分析，而不仅侧重于其敏感性或特异性，又能表示为该法“曲线下的面积越大其诊断试验效果越好”，既全面又直观。通过改变诊断界点，获得多对TPR与FPR值，以1-特异性为横坐标，敏感性为纵坐标，绘制ROC曲线，计算与比较ROC曲线下面积，以此反映诊断试验的诊断价值。NT-proBNP试剂盒广泛用于现有临床上诊断心衰，对NT-proBNP和LTBP2的敏感性和特异性进行ROC分析，LTBP-2的敏感性和特异性高于NT-proBNP，结果见图3，图3为ROC曲线分析NT-proBNP和LTBP-2诊断评价的比较。ROC曲线下面积越大，说明诊断试验的诊断价值越高，即诊断的敏感性和特异性越高。横坐标为1-特异性，纵坐标为敏感性。由图可见，LTBP-2的敏感性和特异性高于NT-proBNP。
实施例2用LTBP-2试剂盒检测终末期心衰组和正常组的血清LTBP-2的表达
终末期心衰96例，健康对照100例，在终末期心衰组中血清LTBP-2的表达明显高于对照组，P＜0.01，有显著统计学差异。
ELISA具体步骤：LTBP-2用酶联免疫吸附试验评估。根据LTBP-2的ELISA试剂盒(产品目录N0.ESBL2196，Ever systems Biology Laboratory Inc.)说明书进行。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验使用新的标准品溶液。弃去液体，甩干，每孔加检测溶液A工作液100μl(在使用前一小时内配制)，酶标板加上覆膜，37℃反应60分钟。弃去孔内液体，甩干，PBS洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μl/每孔，甩干，每孔加检测溶液B工作液100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟后弃去孔内液体，甩干，PBS洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色，30分钟后每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。用酶联仪在450nm处，以空白对照孔调零后测各孔光密度(OD)值。
结果见图4，图4为终末期心衰组和正常组血清LTBP2表达比较，结果在终末期心衰组中血清LTBP2的表达明显高于对照组。LTBP2：辅助性转化因子结合蛋白2，NF：非心衰组，HF：心衰组。
综上所述，由以上实施例及附图可清楚的得知，本发明所述LTBP-2蛋白在制备诊断心力衰竭疾病试剂盒的应用具有很好的效果，血清学检测具有非常高的敏感性、特异性。具有很好的应用价值和市场前景。