说明书组合产品
发明领域
本发明涉及药物活性化合物的新组合。
背景和现有技术
肾素-血管紧张素系统在维持和控制血压中起重要作用。在这些系统中，重要的步骤是：
(a)蛋白酶肾素的释放，其将α-2球蛋白血管紧张素源转化为血管紧张素I(AI)；
(b)血管紧张素转化酶(ACE)作用于AI以产生八肽激素血管紧张素II(AII)；
(c)特定受体介导的AII的下游作用，导致血管收缩。
1-型(AT1)受体的AII作用产生多种导致血管收缩的作用。例如，AII与AT1受体的结合已知引起活性氧物质(ROS)的释放。然后，ROS释放所致的增加的氧化压力降低一氧化氮的水平，其为强效血管扩张剂，其被分解代谢成例如过氧亚硝酸盐的物质(参见Hypertension 37，1047-1052(2001)和同上45，1-6(2005))。
因此由于其或者抑制生物合成或者作为AII，已经发现肾素或ACE的抑制剂以及AII受体的拮抗剂可用于治疗高血压。
例如，化合物例如坎地沙坦(对AT1受体具有选择性的AII受体拮抗剂)已经表明为特别有效的抗高血压药(参见Blood Pressure 11，293(2002))。
在控制与高血压有关的不同疾病状态时，已知有益的是通过给药例如ACE抑制剂或AT1受体拮抗剂来实现血压的降低。例如，已知ACE抑制剂或AT1受体拮抗剂可延缓或预防微血管疾病例如糖尿病性肾病或糖尿病性视网膜病的发展(例如参见WO02/10182、EP0622077、EP0914158、WO2004/096211和J.Renin-Angiotensin-Aldosterone System 2(增刊1)，Sl91-Sl95(2001))。
四氢生物蝶呤(BH4)为涉及多种生物活性分子的生物合成的各种酶的主要辅助因素。例如，BH4为一氧化氮合酶全部三种同种型和几种羟化酶(苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸-3-羟化酶和色氨酸-5-羟化酶)的辅助因子。
已知不同范围的疾病出现在BH4缺乏的个体中，疾病的特性取决于在这些个体中所缺乏的生物合成途径中到BH4的酶(参见The Metabolicand Molecular Bases of Inherited Diseases，第1725-76页(″Disorders oftetrahydrobiopterin and related biogenic amines″)，Scriver，C.R.；Beaudet，A.L.；Sly，W.S.；Valle，D.；Childs B.；和Vogelstein B.，编辑，New York，McGraw-Hill(2001))。
通过其在一氧化氮(血管动态平衡中的关键信号分子)生物合成中的作用，最近已经确定BH4是在血管病内皮一氧化氮合酶功能的调节中的潜在治疗靶向(参见Nephron Physiol.94，6(2003)；Nephrol.Dial.Transplant.19，2223(2004)；和Atheroscler.Thromb.Vase.Biol.24，1(2004))。
BH4的生物合成已知通过6-丙酮酰四氢生物蝶呤或墨蝶呤的墨蝶呤还原酶-催化还原进行。前一化合物的还原直接提供BH4，然而墨蝶呤的还原提供7，8-二氢生物蝶呤，其随后通过二氢叶酸还原酶还原提供BH4。6-丙酮酰四氢生物蝶呤、墨蝶呤和7，8-二氢生物蝶呤由此代表BH4的生物合成前体。
上述文件都没有公开或建议含有BH4的组合，或其功能衍生物或其生物合成前体，以及抑制AII生物合成和/或血管加压功能的药物。
发明公开
本发明的第一个方面提供了含有以下的组合产品：
(A)BH4、其功能衍生物或生物合成前体，或BH4药学可接受的衍生物或其衍生物或前体；和
(B)AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂，或其药学可接受的衍生物，
其中各组分(A)和(B)与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体配制在混合物中。
BH4、其功能衍生物或生物合成前体，或BH4药学可接受的衍生物或其衍生物或前体以下称为“组分(A)”。
类似地，AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂，或其药学可接受的衍生物以下称为“组分(B)”。
此处使用的术语“BH4的功能衍生物”指的是基于吡嗪并嘧啶酮环系(其中环系任选以5，6-二氢或5，6，7，8-四氢形式存在)的分子，其能够通过一氧化氮合酶的一种或多种异构形式增加一氧化氮的生产。化合物是否具有这种能力通过本领域技术人员使用已知技术非创造性地确定，例如通过在存在或不存在测试化合物的情况下电化学监测NO产生。
作为BH4功能衍生物的化合物在本领域已知，并且在这方面包括EP0164964A1、EP0983765A1和WO2004/058268(这些文件的内容通过引用的方式并入此处)中公开的那些，例如1′，2′-二乙酰基-5，6，7，8-四氢生物蝶呤、6-甲基-5，6，7，8-四氢生物蝶呤、6-羟甲基-5，6，7，8-四氢生物蝶呤和6-苯基-5，6，7，8-四氢生物蝶呤。
此处使用的术语“BH4的生物合成前体”指的是比BH4更高氧化态的蝶呤(通过在哌嗪并嘧啶酮环系中存在其它不饱和度，或者在该环系的3位取代基上使用氧代替一个或全部两个羟基)并且其为在生物合成到该分子的路径中的BH4的前体。因而，可以提及的BH4的生物合成前体包括6-丙酮酰四氢生物蝶呤、墨蝶呤和7，8-二氢生物蝶呤。
在本发明一个实施方案中，术语“BH4、其功能衍生物或生物合成前体”包括式I化合物：
其中R1和R2独立地表示H或C1-2烷基，或者一起表示它们所连接的碳和氮原子之间的键；
R3表示芳基或C1-4烷基，其中烷基任选被一个或多个选自下组的取代基取代：芳基、OR7和氧；
R7在每次出现时独立地表示H或C(O)R8；
R8表示C1-4烷基、芳基、C1-4烷氧基和C1-4烷氨基；
R4和R5独立地表示H或C1-2烷基，或者一起表示它们所连接的碳和氮原子之间的键；并且
R6表示H或C(O)-C1-31烷基。
此处使用的术语“芳基”包括C6-13(例如C6-10)芳基。这些基团可为单环、双环或三环，当为多环时可全部或部分为芳环。在这方面，可以提及的C6-13芳基包括苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基、茚满基、茚基、芴基等等。为了避免疑惑，芳基上取代基的连接点可通过环系的任一碳原子。
除非另有说明，芳基可被一个或多个选自下组的取代基取代：-OH、氰基、卤素、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-N(R9a)R9b、-C(O)R9c、-C(O)OR9d、-C(O)N(R9e)R9f、-N(R9g)C(O)R9h、-N(R9i)S(O)2R10a，-S(O)2N(R9j)(R9k)、-S(O)2R10b和/或-OS(O)2R10c(其中R9a至R9k独立地表示H或C1-4烷基和R10a至R10c独立地表示C1-4烷基)。当取代时，芳基和芳氧基优选被一至三个取代基取代。为了避免疑惑，芳基上取代基的连接点可通过环系的任一碳原子。
此处使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
除非另有说明，此处定义的烷基和烷氧基可为直链，或者当具有足够的碳原子数(即，至少3个)时可为支链和/或环状。当具有足够的碳原子数(即，至少4个)时，这些烷基和烷氧基还可为部分环状/无环。这些烷基和烷氧基还可饱和，或者当具有足够的碳原子数(即，至少2个)时，可以不饱和和/或被一个或多个氧和/或硫原子中断。除非另有说明，烷基和烷氧基还可被一个或多个卤素原子并且尤其是氟原子取代。
优选的式I化合物包括以下定义的那些：
R1和R2表示H，或者一起表示它们所连接的碳和氮原子之间的键；
R3表示苯基(任选被一至三个选自卤素、C1-3烷基和C1-3烷氧基的取代基取代)或C1-4烷基，其中烷基任选被一个或两个选自OR7和氧的取代基取代；
R7在每次出现时独立地表示H或C(O)-C1-3烷基；
R4表示H；
R5表示H；
R6表示C(O)-[任选单或二不饱和的C1-31正烷基]或特别表示H。
更优选的式I化合物包括其中R3表示以下的那些：
(a)-CH3；
(b)-CH2OH；
(c)-C(O)C(O)CH3；
d)-C(O)CH(OH)CH3；
(e)-CH(OH)CH(OH)CH3；
(f)-CH(OC(O)CH3)CH(OC(O)CH3)CH3；或
(g)未取代苯基。
当R6表示C(O)-[任选单或二不饱和的C1-31正烷基]时，可以提及的式I化合物包括其中R6表示癸酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或亚油酰基(linoloyl)的那些化合物。
此处使用的术语“AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂”包括肾素抑制剂、ACE抑制剂和AT1受体拮抗剂。因而，可以提及的AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂包括：
(i)肾素抑制剂，例如阿利吉仑、地替吉仑、依那吉仑、瑞米吉仑、特拉吉仑、占吉仑等等；
(ii)ACE抑制剂，例如贝那普利、卡托普利、西拉普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利(moexepril)、培哚普利、喹那普利、雷米普利、群多普利等等；和
(iii)AT1受体拮抗剂，例如坎地沙坦、依普沙坦、伊贝沙坦、洛沙坦，奥美沙坦、替米沙坦、他索沙坦、缬沙坦等等。
其它可以提及的肾素抑制剂包括公开在以下中的那些：
(a)US5,559,111和EPO678503(与阿利吉仑有关)；
(b)EP0173481(与地替吉仑有关)；
(c)EP0311012(与依那吉仑有关)；
(d)EP0416373(与瑞米吉仑有关)；
(e)EP0266950(与特拉吉仑有关)；和
(f)EP0456185(与占吉仑有关)，
这些文件中公开的内容通过引用的方式并入此处。
其它可以提及的ACE抑制剂包括公开在以下美国专利号中的那些：
(a)4,572,909，4,879,303和6,162,802(与贝那普利有关)；
(b)5,238,924(与卡托普利有关)；
(c)4,703,038和4,803,081(与依那普利有关)；
(d)4,337,201和4,384,123(与福辛普利有关)；
(e)4,508,729和5,162,362(与培哚普利有关)；
(f)4,743,450，5,684,016和5,747,504(与喹那普利有关)；
(g)4,587,258，5,061,722和5,403,856(与雷米普利有关)；和
(h)4,933,361，5,744,496和5,721,244(与群多普利有关)，
这些文件中公开的内容通过引用的方式并入此处。
其它可以提及的AT1受体拮抗剂包括公开在以下美国专利号中的那些：
(a)5,196,444，5,534,534，5,703,110和5,705,517(与坎地沙坦有关)；
(b)5,185,351和5,656,650(与依普沙坦有关)；
(c)5,270,317，5,994,348和6,342,247(与伊贝沙坦有关)；
(d)5,138,069，5,153,197，5,608,075和5,210,079(与洛沙坦有关)；
(e)5,616,599(与奥美沙坦有关)；
(f)5,591,762，5,864,043和6,358,986(与替米沙坦有关)；和
(g)5,399,578和6,294,197(与缬沙坦有关)，
这些文件中公开的内容通过引用的方式并入此处。
在本发明一个实施方案中，AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂为一种或多种ACE抑制剂，并且特别是上述AT1受体拮抗剂。
在本发明另一实施方案中，AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂为贝那普利、卡托普利、西拉普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、群多普利、坎地沙坦、依普沙坦、伊贝沙坦、洛沙坦、奥美沙坦、替米沙坦、他索沙坦和缬沙坦中一种或多种。
在本发明另一实施方案中，AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂为依普沙坦、伊贝沙坦、洛沙坦、奥美沙坦、替米沙坦、他索沙坦、缬沙坦，或，特别是坎地沙坦(任选处于前药形式，例如坎地沙坦西酯)。
本发明组合产品提供组分(A)与组分(B)结合给药，并且由此可以分离制剂的形式存在，其中这些制剂中至少一种含有组分(A)并且至少一种含有组分(B)；或者可以组合制剂(即，以含有组分(A)与组分(B)的单一制剂存在)存在(即配制)。
因此本发明另外提供：
(1)含有BH4、其功能衍生物或生物合成前体，或BH4或其衍生物或前体的药学可接受的衍生物；和AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂，或其药学可接受的衍生物，与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的药物制剂(该制剂以下简称为“组合制剂”)；和
(2)包含以下组分的多部分试剂盒(kit of parts)：
(I)含有BH4、其功能衍生物或生物合成前体，或BH4或其衍生物或前体的药学可接受的衍生物与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的药物制剂；和
(II)含有AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂，或其药学可接受的衍生物与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的药物制剂，
其中组分(I)和组分(II)分别以适于与另一个共同给药的形式提供。
由此多部分试剂盒的组分(I)为组分(A)与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合。类似地，组分(II)为组分(B)与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合。
本发明另一方面提供了制造如上所定义的多部分试剂盒的方法，所述方法包括使如上所定义的组分(I)与如上所定义的组分(II)组合，由此使得两个组分适于互相结合给药。
通过使得两个组分互相“结合”，多部分试剂盒的组分(I)和(II)可为：
(i)以分离制剂(即，彼此独立)提供，其随后放在一起以在联合治疗中互相结合使用；或
(ii)以在联合治疗中互相结合使用的“组合包装”的分离组分包装和存在。
因此另外提供了多部分试剂盒，其包括：
(1)此处所定义的组分(I)和(II)之一；和
(2)将组分与两个组分中另一个结合使用的说明书。
为了重复给药，此处所述的多部分试剂盒可包括一个以上含有合适量/剂量组分(A)的制剂，和/或一个以上含有合适量/剂量组分(B)的制剂。如果存在一个以上制剂(包括任何一个活性化合物)，这些制剂可在组分(A)或组分(B)剂量、化学组成和/或物理形式方面相同或不同。
发现本发明组合产品可用于治疗高血压和特征在于血管(例如微血管)功能障碍和/或损伤的病症。
此处使用的术语“特征在于(微)血管功能障碍和/或损伤的病症”包括内皮组织中氧化压力导致(微)血管系统收缩和/或损伤的病症。在此方面可以提及的病症包括左心室功能障碍、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、雷诺氏病(Reynaud’sdisease)、偏头痛、脑卒中、视网膜病、神经病，并且特别是肾病、肾小球性肾炎和肾小球硬化症。还可以提及的具体病症包括糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病变，并且特别包括糖尿病性肾病、糖尿病性肾小球性肾炎和糖尿病性肾小球硬化。
因此，本发明另一方面提供治疗高血压和和特征在于微血管功能障碍和/或损伤的病症的方法，所述治疗包括给药含有与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的组分(A)和组分(B)的药物制剂。
本发明另一方面提供治疗高血压和和特征在于微血管功能障碍和/或损伤的病症的方法，所述治疗包括向患有或容易患有这些疾病的患者给药
(a)含有与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的组分(A)的药物制剂；
(b)含有与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的组分(B)的药物制剂。
为了避免疑惑，此处使用的术语“治疗”包括疾病的治疗和/或预防性治疗。
对于此处所述的多部分试剂盒，“结合给药”包括在相关疾病的治疗期间，含有组分(A)和组分(B)的各个制剂连续、分别和/或同时给药，这些疾病可为急性或慢性。
因此，对于根据本发明的组合产品，术语“结合给药”包括联合产品的两个组分(组分(A)和组分(B))同时或者在时间上足够接近的给药(任选重复给药)，以使得在相关疾病的治疗期间对患者的有益效果大于在相同治疗期间单独给药(任选重复给药)含有组分(A)的制剂或含有组分(B)的制剂而不使用另一组分的情形。
在特定疾病的治疗方面和特定疾病治疗期间是否取得了更好的效果的确定依赖于所治疗或预防的疾病，但可由本领域技术人员常规性得到。
此外在本发明多部分试剂盒范围内，术语“结合”包括两个制剂中的一个或另一个可在另一组分之前、之后和/或同时给药(任选重复给药)。本发明中使用的术语“同时给药”和“在相同时间给药”包括组分(A)和组分(B)在彼此48小时内(例如24小时)给药。
此处使用的术语“药学上可接受的衍生物”包括盐(例如药学上可接受的无毒有机或无机酸加成盐)和溶剂化物。本领域技术人员可以理解的是该术语另外包括具有或提供相同生理学功能和/或活性的衍生物。并且对于本发明目的而言，术语还包括前药(BH4、其功能衍生物或其生物合成前体，和/或AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂的前药)。BH4、其功能衍生物或其生物合成前体的“前药”包括口服或肠胃外给药后在预定时间(例如6-24小时给药间隔(即，每天1-4次))内以试验可确定量体内代谢形成为BH4、或其功能衍生物或其生物合成前体的任意物质组合。类似地，AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂的“前药”包括口服或肠胃外给药后在预定时间(例如6-24小时给药间隔(即，每天1-4次))内以试验可确定量体内代谢为AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂的任意物质组合。
为了避免疑惑，术语“肠胃外”给药包括除了口服以外的所有给药方式。
当AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂为选自坎地沙坦、依普沙坦、奥美沙坦和缬沙坦的AT1受体拮抗剂时，可以提及的前药包括这些分子游离羧酸部分的酯(例如C1-6烷基酯，其烷基任选被一个或多个选自下组的取代基取代：卤素、羟基、C1-6烷氧基、C3-6环烷氧基、C1-6烷羰氧基和C3-6环烷羰氧基、C1-6烷氧基羰氧基和C3-6环烷氧基羰氧基)。AII生物合成和/或血管加压功能抑制剂优选的前药由此包括坎地沙坦西酯(即，坎地沙坦的1-(环己氧基羰氧基)乙酯)。根据本发明，组分(A)和组分(B)可以包括组分(A)和/或组分(B)的药物制剂的形式以药学上可接受的剂型口服、静脉内、皮下、口腔、直肠、经皮、经鼻、气管、支气管、局部、通过任何其它肠胃外途径给药，或通过吸入给药。根据治疗的病症、患者以及给药途径，组合物可以不同剂量给药。
优选的给药方式为全身给药，尤其是口服给药。
在哺乳动物尤其是人的治疗性治疗中，组分(A)和组分(B)将与药学上可接受的助剂、稀释剂或载体混合为药物制剂给药，其可根据给药的指定途径和标准药物实践进行选择。
给药组分(A)使用的合适的制剂已经公开在文献中，尤其是EP0164964、EP0983765和WO2004/05826，这些文献中公开的内容通过引用的方式并入此处。
类似地，给药组分(A)使用的合适的制剂已经公开在文献中，例如尤其公开在欧洲专利申请0173481、0266950、0311012、0416373、0456185、0622077和0678503以及美国专利4,337,201、4,384,123、4,508,729、4,572,909、4,587,258、4,703,038、4,743,450、4,803,081、4,879,303、4,933,361、5,061,722、5,138,069、5,153,197、5,162,362、5,185,351、5,196,444、5,210,079、5,238,924、5,270,317、5,399,578、5,403,856、5,534,534、5,559,111、5,591,762、5,608,075、5,616,599、5,656,650、5,684,016、5,703,110、5,705,517、5,721,244、5,721,263、5,744,496、5,747,504、5,864,043、5,958,961、5,994,348、6,162,802、6,294,197、6,342,247和6,358,986中，这些文献中公开的内容通过引用的方式并入此处。此外，本领域技术人员通过使用常规技术可以非创造性地完成合适制剂，并且特别是同时含有组分(A)和组分(B)的组合制剂的制备。
各个制剂中组分(A)和组分(B)的量将依赖于疾病的严重程度、治疗的患者以及使用的化合物，但也可由本领域技术人员非创造性地确定。
在哺乳动物尤其是人的治疗和/或预防性治疗中组分(A)和组分(B)的合适的量可由职业医生或其它熟练技术人员常规性确定，并且包括在以上提到的与两者有关的现有技术中所述的各个量，这些文献中公开的内容通过引用的方式并入此处。
对于组分(A)和组分(B)，治疗或预防目的的合适的剂量为0.001-300毫克/千克体重/天(例如0.001-50毫克/千克体重/天)。
例如对于组分(A)，合适的剂量为1-15毫克/千克体重/天。
在组分(B)的情形，在哺乳动物尤其是人的治疗和/或预防性治疗中，活性化合物、前药(尤其是坎地沙坦西酯)及其衍生物的合适剂量包括0.001-30毫克/千克体重/天(例如当组分(B)为坎地沙坦西酯时，为0.001-3毫克/千克体重/天)。例如，通过每天给药1-1500毫克(例如2-160毫克)组分(B)可以达到该剂量。
在任何情况下，医师或熟练技术人员将能够确定最适于各个患者的合适剂量，其很可能随着治疗的疾病、以及治疗的特定患者的年龄、体重、性别和反应而变化。上述剂量为一般情况的示例值；当然应使用较高或较低剂量范围的特定情况也在本发明范围之内。
当给药单独制剂时，医师和熟练技术人员可以确定含有组分(A)和组分(B)的制剂给药的顺序(即，是否并且在哪一点连续、单独和/或同时给药)。例如，给药顺序可以依赖于熟练技术人员所熟知的多种因素，例如在治疗期间由于实际原因(例如患者没有意识并且由此不能服用含有组分(A)或组分(B)的制剂)是否一种或多种其它药剂不能给药到患者。
根据本发明的组合产品具有以下优点：当给药到患者时与单独给药组分(A)或组分(B)相比，其提供出乎意料高的血压降低和器官保护(例如心脏、脑、视网膜，特别是肾保护)效果。此外与现有技术中已知用于治疗这些疾病的方法相比，根据本发明的组合产品可以更加有效、更低毒性、具有更宽范围的活性、更加有力、产生更少的副作用，或具有其它有用的药理学性质。
本发明参考附图通过以下实施例而非限制性地说明，这些附图表示如下所述生物研究得到的数据并且其中：
图1表示研究周期(4个月)结束时的死亡百分率。
图解(图1)：
SHAM-假手术的大鼠；
Nx-未经处理的5/6肾切除的大鼠；
BH4-使用BH4(10毫克/千克，i.p.)处理的5/6肾切除的大鼠；
C-使用坎地沙坦西酯(5毫克/千克，p.o.)处理的5/6肾切除的大鼠；
C+B-使用坎地沙坦西酯(5毫克/千克，p.o.)和BH4(10毫克/千克，i.p.)处理的5/6肾切除的大鼠(5毫克/千克，p.o.)。
图2表示与在第1月测量(此时没有给药)时相比，在研究的第2-4月中收缩血压的改变。
图3表示与在第1月测量(此时没有给药)时相比，在研究的第2-4月中24小时尿蛋白排泄(毫克/毫克肌氨酸)的改变。
图4表示对于不同组大鼠肾的中值研究后肾小球系膜增生评价(通过以下的组织学检查确定)。
图解(图2-4)：
sham-假手术的大鼠；
nx-未经处理的5/6肾切除的大鼠；
bh4-使用BH4(10毫克/千克，i.p.)处理的5/6肾切除的大鼠；
cand-使用坎地沙坦西酯(5毫克/千克，p.o.)处理的5/6肾切除的大鼠；
c+bh4-使用坎地沙坦西酯(5毫克/千克，p.o.)和BH4(10毫克/千克，i.p.)处理的5/6肾切除的大鼠(5毫克/千克，p.o.)。
生物学研究
方案
60只平均重量为324±4克的雄性Wistar大鼠以正常固体饮食饲养并且随意供给蒸馏水。根据标准方法进行5/6肾切除。总之，动物在第0天使用戊巴比妥(腹膜内35毫克/千克其中(BW))麻醉，然后进行右部肾切除并且扎紧左部主肾动脉(Nx)的两个主要分枝。由一个操作员进行全部肾切除。然后将动物随机分到如下五组中的一组：
组1：SHAM(n＝12)-假手术的大鼠。
组2：Nx(n＝15)-未经处理的5/6肾切除的大鼠。
组3：C(n＝11)-以5毫克/千克BW/天给药坎地沙坦西酯(AstraZeneca AB)的5/6肾切除的大鼠。
组4：BH4(n＝10)-以10毫克/千克BW/天腹膜内给药BH4(AlexisBiochemical，Lausen)的5/6肾切除的大鼠(参见Hypertension38，1044-1048(2001)，其中公开的内容通过引用的方式并入此处)。
组5：C+B-以5毫克/千克BW/天给药坎地沙坦西酯(AstraZeneca AB)并以10毫克/千克BW/天腹膜内给药BH4(Alexis Biochemical，Lausen)的5/6肾切除的大鼠[5]。
药物给药在手术后30天(肾切除的大鼠已经发展成高血压和肾机能不全的时间点)开始。持续研究直到在对照组(Nx)中观察到50％的死亡率(其在手术4个月后出现)。在手术前1天和研究的第30、60、90和120天使用自动血压计(Narco Bio Systems，Austin，TX，USA)通过tail-cuff测压计在受训应激大鼠中测量收缩血压(SBP)。Meir Hospital的动物试验管理委员会批准了全部方法。
临床和实验室评价
在研究结束时测试血清白蛋白和胆固醇(作为营养指数)。在研究前1天和研究的第30、60、90和120天测定血清肌酸酐。在手术前的连续两天和手术后第30、60、90和120天得到24小时尿收集物以测量肌酐清除率和蛋白尿。在每次收集尿3天以前将大鼠放置在代谢笼中并喂给每100克中含有0.35克NaCl、20克蛋白质和1.17克精氨酸的低硝酸盐饲料。向尿收集管中加入庆大霉素(6毫克/管)以避免细菌滋长。通过标准方法测试血清肌酸酐、白蛋白、胆固醇和尿蛋白尿。
组织学检查
将肾固定在中性缓冲福尔马林中并包埋在石蜡中以进行光线显微镜研究。组织切片使用苏木素-曙红、高碘酸-Schiff(PAS)和Masson染色。将组织切片编号以使得病理学家不知道各个样品的来源。每个肾中至少检查40个肾小球。使用半定量评价以评价肾小球损伤的严重程度(参见Nephrol.Dial.Transplant.8，501-506(1993)，该文件中公开的内容并入此处作为参考)。以100倍的放大率在PAS染色的石蜡剖面上评价Tubulointerstitial和血管损伤。评价根据Adamczak等人进行(参见J.Am.Soc.Nephrol.14，2833-2842(2003)，该文件中公开的内容并入此处作为参考)。
统计分析
除非另有说明，结果使用平均±SEM表示。在数据的统计分析中进行具有Bonferroni修正的单向方差分析。对于成对或不成对的组，酌情使用t-检验。小于0.05的P值被认为是显著的。
结果：
临床评价
由于尸体解剖研究后的反常发现，两个大鼠从“C+B”组(即，组5)的分析中除去。
在进入研究的第4个月(对组3-5的大鼠进行3个月的药物治疗)，存活率如下。
组5/6肾切除处理存活率(％年龄)
1没有(假手术)未处理12中12个(100％)
2进行未处理15中7个(46.67％)
3进行坎地沙坦西酯，5毫克/千克11中7个(63.64％)
4进行BH4，10毫克/千克10中5个(50％)
5进行坎地沙坦西酯，5毫克/千克和BH4，10毫克/千克10中8个(80％)
类似地，在进入研究的第4个月时(对组3-5的大鼠进行3个月的药物治疗)，肾小球系膜增生(mesangial expansion)评价如下。
组5/6肾切除处理ME评价*
1没有(假手术)未处理0
2进行未处理200
3进行坎地沙坦西酯，5毫克/千克82
4进行BH4，10毫克/千克158
5进行坎地沙坦西酯，5毫克/千克和BH4，10毫克/千克66
*中值