欧文氏杆菌工厂化发酵快速提取苎麻纤维工艺.pdf

本发明公开了一种欧文氏杆菌工厂化发酵快速提取苎麻纤维工艺，主要包括原料预处理、浸泡或喷洒接种、浸泡或湿润发酵、热水灭活与循环洗涤、水理、纤维整理工序，对草本纤维原料的脱胶、制浆和糖化具有广谱性和高效性的欧文氏杆菌及其菌剂制备与活化技术参数。这种欧文氏杆菌嗜好甘露糖，纯培养7h-9h达到分泌非纤维素降解关键酶(果胶酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶)的高峰。将其菌剂活化5h-6h后接种到苎麻等草本纤维原料上发酵5h-6h的发酵草料变成蓝色，剥离和部分降解伴生于纤维细胞间的果胶、半纤维素及部分木质素，再借助高压水柱冲洗可除去附着在纤维上的非纤维素残留物，达到提取纯净纤维的目的。

权利要求书
1、  一种欧文氏杆菌菌种，其特征在于通过紫外线诱变胡萝卜软腐欧文氏杆菌CGMCC0245获得变异菌株CGMCC2194，该变异菌株拥有的生物学特性是：嗜好甘露糖；处于生长旺盛期的培养物在环境温度≤5℃下保持15d和≥50℃下保持30min.的检验结果，无活菌；在葡萄糖营养琼脂培养基上培养14h～16h的固态培养基显示棕褐色，在营养肉汤中培养5h～6h的培养液由金黄色变成桔黄色再变为橙黄色，在豆饼粉培养基中培养5h～6h的发酵液呈蓝绿色，接种到苎麻等草本纤维原料上发酵5h～6h的发酵草料变成蓝色；纯培养7h～9h的果胶酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶活力分别达到158U·mL-1、305U·mL-1和74U·mL-1，对草本纤维原料的脱胶、制浆和糖化具有广谱性和高效性。

2、  一种用权利要求1所述的欧文氏杆菌菌种制成高效菌剂并在异地制成活化菌液的方法，其特征在于包括如下步骤：
a、将保存的菌种放入试管营养肉汤活化3h～5h；
b、将步骤a活化后的液体倒入三角烧瓶营养肉汤扩增4h～6h；
c、将步骤b得到的液体倒入种子罐营养肉汤扩增5h～6h；
d、将步骤c得到的液体倒入发酵罐改良营养肉汤培养5h～6h；
e、对步骤d获得的液体进行超滤浓缩；
f、对步骤e获得的浓缩物用保护剂洗脱营养，然后分装、真空包装、中温休眠得到高效菌剂；
g、将步骤f得到的高效菌剂倒入三角烧瓶或种子罐改良营养肉汤活化4h～6h；
h、将步骤g得到的液体倒入发酵罐豆饼粉培养基培养5h～6h，当菌液呈蓝绿色时得到活化菌液；
所述改良营养肉汤的配方为蛋白胨5.0g·L-1、牛肉膏3.0g·L-1、酵母膏2.0g·L-1、葡萄糖10.0g·L-1、NaCl3.5g·L-1、KH2PO4 1.0g·L-1、MgSO4 0.5g·L-1；超滤浓缩时膜包孔径≥0.45μ、≤0.65μ，菌液温度保持10℃～35℃，蠕动泵输出压0～2bar；保护剂洗脱营养时以2～3倍浓缩液体积的8.0～9.0g·L-1NaCl溶液洗涤浓缩液3～5次；中温休眠时温度控制在10℃～20℃。

3、  一种用权利要求2所述方法制得的活化菌液提取苎麻纤维工艺，包括如下步骤：
a、原料预处理，主要采用光波照射和机械碾压方法使苎麻无霉变气味，含杂率≤0.5％，附壳率≤0.01％，浴比＝1∶10时，将苎麻置于蒸馏水中浸泡30min后测定浸泡液体pH值在5.0～8.5的范围内；装笼密度为110±11kg/m3；
b、对预处理后的苎麻进行浸泡接种或喷洒接种，按苎麻重量对液体为1∶8～12的比例灌自来水到接种锅并用蒸汽调节水温到34±1℃，将上述活化菌液注入其中稀释成活菌含量在5×107cfu·mL-1以上的菌悬液，再把装载苎麻的麻笼浸泡于菌悬液中处理10-15分钟；或者，按苎麻重量对液体为1∶2.5～3.5的比例灌自来水到配液桶并用蒸汽调节水温到34±1℃，将上述活化菌液注入其中稀释成活菌含量在2×108cfu·mL-1以上的菌悬液，用菌悬液喷淋苎麻至苎麻含水率达到72％±2％；
c、对接种后的苎麻进行浸泡发酵或湿润发酵，将接种过的麻笼继续浸泡在菌悬液中，在33℃±2℃、净化压缩空气的通入量为0.01m3/m3·min～0.1m3/m3·min条件下发酵6h～7h，或者，将接种过的麻笼置于33℃±2℃、相对湿度在85％以上、空气对流的环境中发酵5h～6h，直至苎麻变成蓝色，用水冲洗纤维分散；
d、对发酵后的苎麻进行热水灭活与循环洗涤，将接种剩余菌悬液、菌种活化罐冷却水、洗罐水、接种锅清洗废水一并收集到热水罐加热至90℃，同时，将经过发酵处理的麻笼置于带有循环装置的洗麻锅中，按照苎麻重量对水的重量为1∶10的比例，将加热后的废液注入洗麻锅中，循环冲洗25min～35min，排出废液，再用60℃～80℃温水和清水依次循环冲洗5min～10min各一次；
e、对步骤d获得的苎麻用压力≥0.35MPa的高压水进行水理，然后进行纤维整理。

说明书欧文氏杆菌工厂化发酵快速提取苎麻纤维工艺
技术领域
本发明属纺织行业中苎麻生物脱胶领域，具体涉及一种欧文氏杆菌及其用于苎麻纤维提取的工艺。
背景技术
现行麻类脱胶与草类制浆企业均采用化学方法，化学脱胶或制浆方法存在三个突出问题：一是成本高、能耗大，二是纤维流失多而且结构受到损伤，三是环境污染严重。尤其是化学方法在降解非纤维素的同时损伤纤维固有的形态与结构，使得纤维制品丧失了许多优良特性。这些问题业已成为产业发展的制约因子。为解决传统和常规方法存在的问题，国内外广泛开展了“生物脱胶”、“生物制浆”和“生物糖化”工艺的研究。苎麻等草本纤维原料中非纤维素物质的成分复杂、结构牢固，尽管开展生物法提取苎麻等草本纤维的研究历史长达80年之久，但一直不能用于大规模生产。究其原因，一是针对麻类等草本纤维原料非纤维素物质的成分与结构特点而采取基因工程手段定向改良菌种的工作做得太少；二是利用微生物发酵及其酶制剂降解非纤维素的机制不清楚。为此人们在不断努力探索，比如中国农业科学院麻类研究所1985年研究形成第一代苎麻生物脱胶技术——苎麻细菌化学联合脱胶技术曾经在5家企业得到推广应用。但不久就停产，主要原因是企业难以掌握菌种制备技术，尤其是菌种退化或变异的技术问题难以解决。1995年发明的“苎麻生物脱胶工艺技术与设备”，先后在沅江市第三、第二苎麻纺织厂等6家企业进行了生产性试验。导致该项发明专利实施进度缓慢的主要原因是企业难以掌握菌种制备技术、现行市场上流通的原料苎麻质量不能满足没有化学试剂补充的生物脱胶工艺要求。又如山东大学与沅江二苎麻纺织厂合作采用枯草芽孢杆菌(原种经斜面培养48h、三角烧瓶振荡培养48h、三级发酵累计60h)的发酵粗酶液直接用于处理苎麻2-4h，再用烧碱与助剂混合液煮沸2h即可完成脱胶，脱胶率达97.5-98.5％，纤维分散度100％(CN01106844.2)。该项发明存在的主要缺陷除了没有突破“生物-化学联合脱胶”模式以外，就是酶制剂生产问题的制约。将酶制剂生产车间建设在苎麻加工企业内，由于企业缺乏相关专业人才、酶制剂生产周期长(100h以上)、杂菌污染几率高等原因，导致企业脱胶生产稳定性差；将酶制剂生产车间移至外地，若采用粗酶液进行苎麻脱胶存在活性难以保证、运输成本高等问题，若采用精制酶，其酶制剂的生产成本将会突破现行企业可以承受的底线。因此，如何降低企业设施技术难度、提高生产稳定性使生物脱胶技术能用于工厂大规模生产是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能用于工厂化大规模生产的高效节能清洁型生物脱胶技术，该技术包括一种欧文氏杆菌菌种、将该菌中制成高效菌剂并在异地制成活化菌液的方法、用活化菌液对苎麻进行发酵而提取纤维的工艺。
本发明提供的这种欧文氏杆菌菌种的分类命名是：胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，该菌种已于2007年10月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)进行了保藏，保藏编号CGMCC No.2194。该菌种通过紫外线诱变胡萝卜软腐欧文氏杆菌(CGMCC0245)获得变异菌株(CGMCC2194)，其拥有的生物学特性是：嗜好甘露糖；处于生长旺盛期的培养物在环境温度≤5℃下保持15d和≥50℃下保持30min的检验结果，无活菌；在葡萄糖营养琼脂培养基上培养14h-16h的固态培养基显示棕褐色，在营养肉汤中培养5h-6h的培养液由金黄色变成桔黄色再变为橙黄色，在豆饼粉培养基中培养5-6h的发酵液呈蓝绿色，接种到苎麻等草本纤维原料上发酵5h-6h的发酵草料变成蓝色；纯培养7h-9h的果胶酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶活力分别达到158U·mL-1、305U·mL-1和74U·mL-1，对草本纤维原料的脱胶、制浆和糖化具有广谱性和高效性。
用上述欧文氏杆菌菌种制成活化菌液的方法，包括如下步骤：
a、将保存的菌种放入试管营养肉汤活化3-5h；
b、将步骤a活化后的液体倒入三角烧瓶营养肉汤扩增5-6h；
c、将步骤b得到的液体倒入种子罐营养肉汤扩增5-6h；
d、将步骤c得到的液体倒入发酵罐改良营养肉汤培养5-6h；
e、对步骤d获得的液体进行超滤浓缩；
f、对步骤e获得的浓缩物用保护剂洗脱营养，然后分装、真空包装、中温休眠得到高效菌剂；
g、将步骤f得到的高效菌剂分装到三角烧瓶或倒入种子罐改良营养肉汤中活化4-6h；
h、将步骤g得到的液体接种到发酵罐豆饼粉培养基中培养5-6h，当菌液呈蓝绿色时得到活化态菌液；
所述改良营养肉汤的配方为蛋白胨5.0g·L-1、牛肉膏3.0g·L-1、酵母膏2.0g·L-1、葡萄糖10.0g·L-1、NaCl3.5g·L-1、KH2PO4 1.0g·L-1、MgSO4 0.5g·L-1；超滤浓缩时膜包孔径≥0.45μ、≤0.65μ，菌液温度保持10-35℃，蠕动泵输出压0-2bar；保护剂洗脱营养时以2-3倍浓缩液体积的8.0-9.0g·L-1NaCl溶液洗涤浓缩液3-5次；中温休眠时温度控制在10-20℃。
用上述方法制得的活化菌液提取苎麻纤维工艺包括如下步骤：
a、原料预处理，主要采用光波照射和机械碾压方法使苎麻无霉变气味，含杂率≤0.5％，附壳率≤0.01％，浴比＝1∶10时，将苎麻置于蒸馏水中浸泡30min后测定浸泡液体pH值在5.0～8.5的范围内；装笼密度为110±11kg/M3；
b、对预处理后的苎麻进行浸泡接种或喷洒接种，按苎麻重量对液体为1∶8-12的比例灌自来水到接种锅并用蒸汽调节水温到34±1℃，将所述活化菌液注入其中稀释成活菌含量在5×107cfu·mL-1以上的菌悬液，再把装载苎麻的麻笼浸泡于菌悬液中处理10-15分钟；或者，按苎麻重量对液体为1∶2.5-3.5的比例灌自来水到配液桶并用蒸汽调节水温到34±1℃，将所述活化菌液注入其中稀释成活菌含量在2×108cfu·mL-1以上的菌悬液，用菌悬液喷淋苎麻至苎麻含水率达到72％±2％；
c、对接种后的苎麻进行浸泡发酵或湿润发酵，将接种过的麻笼继续浸泡在菌悬液中，在33℃±2℃、净化压缩空气的通入量为0.01-0.1 M3/M3·min条件下发酵6-7h，或者，将接种过的麻笼置于33℃±2℃、相对湿度在85％以上、空气对流的环境中发酵5-6h，直至苎麻变成蓝色，用水冲洗纤维分散；
d、对发酵后的苎麻进行热水灭活与循环洗涤，将接种剩余菌悬液、菌种活化罐冷却水、洗罐水、接种锅清洗废水一并收集到热水罐加热至90℃，同时，将经过发酵处理的麻笼置于带有循环装置的洗麻锅中，按照苎麻重量对水的重量为1∶10的比例，将加热后的废液注入洗麻锅中，循环冲洗25min～35min，排出废液，再用60℃～80℃温水和清水依次循环冲洗5min～10min各一次。
e、对步骤d获得的苎麻用压力≥0.35MPa的高压水柱进行水理，然后进行纤维整理。
本发明提供的这种欧文氏杆菌菌种不仅表现为发酵液酶活比CGMCC0245有明显提高，而且发酵到一定程度(工艺成熟期)时，混合发酵物产生独特而明显的颜色反应，例如，在营养肉汤中培养5-6h的培养液由金黄色→桔黄色→橙黄色，在豆饼粉培养基中培养5-6h的发酵液呈蓝绿色，接种到苎麻等草本纤维原料上发酵5-6h的发酵草料变成蓝色。这些颜色标记具有十分重要的工业化生产应用价值，不仅有利于降低工业污染，而且有利于降低生产过程相关工序质量检验的技术难度和生产管理成本。
本发明在原有发明专利技术基础上改进了菌剂制备、活化工艺参数，利用集中制备成的高效菌剂提供给相关企业在工厂化条件下活化5-6h以后，接种到草料上发酵5-6h就能剥离伴生于纤维细胞间的果胶、半纤维素及部分木质素，由此可以大幅度降低企业实施生物脱胶与生物制浆工艺的技术难度。
本发明提取苎麻纤维工艺，在原有发明专利技术基础上发明了原料预处理、热水灭活、水理步骤，改进了接种、发酵工艺参数。其中原料预处理能去掉杂质，除去部分杂菌，减少杂菌污染，使接种均匀、欧文氏杆菌的作用得到充分发挥。通过改进接种、发酵工艺参数，可以大幅度增加接种到苎麻上的欧文氏杆菌的数量，缩短发酵周期、减少杂菌的副作用和有效纤维的损失、提高生物脱胶工艺的稳定性、确保产品质量的一致性。热水灭活是将所有含菌废水集中回收加热以后用于循环洗涤发酵麻，该工序能杀死生物脱胶过程中繁殖起来的各类微生物，除去已降解的非纤维物质，以至于采用简单的水理工序，即借助高压水柱冲洗措施就能除去已降解但还附着在纤维上的残留物(非纤维物质)，达到提取纯净纤维的目的。没有化学试剂作用的苎麻纤维生物提取工艺，在消除了投入化学试剂带来污染的同时，通过预处理过程中除去部分杂质，欧文氏杆菌发酵消耗部分有机物以及酶的专一性作用而减少纤维流失，可以从源头上减少有机污染物排放量，减少幅度因原料不同变化于30％～60％之间；可能进入水体的污染物仅来自原料中的脱落物和少许微生物躯体与分泌物，多数是大分子颗粒或块状有机物可以通过离心分流除去，高浓度废水集中于热水灭活工序，污水的总量大幅度减少、水质单一，以至于实际进入水体的污染物处理负荷不到常规方法的10％。因此，利用欧文氏杆菌发酵方法可以实现草本纤维提取的清洁生产。综上所述，本发明提取苎麻纤维工艺不仅流程简单、操作方便、质量检测直观，而且具有高效、节能、省水、工艺投入少、脱胶制成率高、纤维品质好、环境污染轻等突出优点。
具体实施方式
(一)欧文氏杆菌变异菌株CGMCC2194的选育
1、实施地点
中国农业科学院麻类研究所工程微生物研究室(农业部麻类遗传改良与工程微生物重点开放实验室的重要组成部分)。
2、菌种选育研究
以T85-260(CGMCC0245)菌株为始发菌，采用紫外线照射120s，然后，按照常规的微生物选种程序和方法、常规的微生物菌种产酶性能鉴定和本实验室独创的苎麻脱胶菌种选育技术指标，从紫外线诱变菌液中分离、纯化、鉴定和筛选出欧文氏杆菌变异菌株CGMCC2194。
(二)欧文氏杆菌变异菌株CGMCC2194的生物学特性以及草本纤维生物提取工艺原理研究
1、实施地点
中国农业科学院麻类研究所工程微生物研究室(农业部麻类遗传改良与工程微生物重点开放实验室的重要组成部分)。
2、菌种特性研究
以T85-260和CXJZ95-198等菌株为对照，按照常规细菌分类鉴定、生物学特性研究方法，对欧文氏杆菌变异菌株CGMCC2194的特性进行了系统研究，并采用比较学原理对研究对象和参照物进行了全面比对，从而总结出系统差异、得到该菌株的特性。
3、草本纤维生物提取工艺原理研究
在模拟工厂化生产的工艺流程和技术条件下，采用欧文氏杆菌变异菌株CGMCC2194对苎麻、红麻韧皮、亚麻、罗布麻等麻类进行生物脱胶以及对龙须草、麦草、红麻韧皮等草本纤维原料进行生物制浆处理。同时，采用高效液相色谱仪、超滤装置等现代分析仪器与手段和生物化学、有机化学等研究方法，对生物脱胶或生物制浆过程中采集的各类样品进行了系统分析和研究。然后，根据植物发育学、微生物代谢、发酵及酶学专业的基础理论，对试验数据进行系统分析，总结出“块状崩溃”假说。
(三)高效菌剂(指用欧文氏杆菌变异菌株制成的菌剂)制备技术研究与应用
1、实施地点与生产规模
中国农业科学院麻类研究所工程微生物研究室和麻类加工生物制剂中试车间。中试车间设计批量生产能力为500kg高效菌剂。实际投入试验的批量生产能力为10kg高效菌剂(考虑到高效菌剂应用于工业生产的现实需求量，只启动了小型发酵罐——种子罐)。
2、高效菌剂制备技术研究与应用
高效菌剂制备以中国农业科学院麻类研究所前期发明专利“草本纤维工厂化脱胶或制浆用高效菌剂制备工艺”(专利号：ZL02108820.9)和“一种利用欧文氏杆菌生产甘露聚糖酶的工艺”(专利申请号：2005100324976)的技术方案为基础，针对应用过程中发现的实际问题做了一些改进和完善研究。其工艺流程包括：保存菌种→试管营养肉汤活化3-5h→三角烧瓶营养肉汤扩增5-6h→种子罐营养肉汤扩增5-6h→发酵罐改良营养肉汤培养5-6h→超滤浓缩→保护剂洗脱营养→分装→真空包装→中温休眠→高效菌剂。主要技术参数是改良营养肉汤配方为蛋白胨5.0g·L-1、牛肉膏3.0g·L-1、酵母膏2.0g·L-1、葡萄糖10.0g·L-1、NaCl3.5g·L-1、KH2PO41.0g·L-1、MgSO40.5g·L-1；超滤浓缩时膜包孔径≥0.45μ、≤0.65μ，菌液温度保持10-35℃，蠕动泵输出压0-2bar；保护剂洗脱营养时以2-3倍浓缩液体积的8.0-9.0g·L-1NaCl溶液洗涤浓缩液3-5次；中温休眠时温度控制在10-20℃。在工厂化条件下用于苎麻脱胶生产时，每个包装为300-500mL，经过活化可以处理1.5-2.5t苎麻。
(四)工厂化发酵快速提取苎麻纤维工艺
1、实施地点与生产规模
沅江市明星麻业有限公司按照本发明的技术路线完成工艺改造并投入了工厂化生产应用试验。原苎麻脱胶车间设计生产能力为日产6t-8t苎麻精干麻。已投入实施的生产能力为日产4t-5t苎麻精干麻(完成新增设备配套和原有设备改造工作，可达到的生产能力为日产12t苎麻精干麻，预计2007年底以前可以实现该产能)。
2、工艺技术路线
在沅江市明星麻业有限公司实施的欧文氏杆菌工厂化发酵快速提取苎麻纤维工艺技术路线包括原料预处理、菌剂活化、浸泡接种、湿润发酵、热水灭活与循环洗涤、水理以及渍油、轧干、抖麻、烘干等常规纤维整理工序。
3、操作步骤
(1)原料预处理  将农民提交的农产品——苎麻置于特定机械设备上进行碾压、干热杀菌、搓松和除杂处理以后，按照每把0.5-0.9kg进行扎把和装笼。主要技术参数是苎麻无霉变气味，含杂率≤0.5％，附壳率≤0.01％，浴比＝1∶10时，将苎麻置于蒸馏水中浸泡30min后测定浸泡液体pH值在5.0～8.5的范围内；装笼密度为110±11kg/M3。
(2)菌剂活化  将中国农业科学院麻类研究所提供的活化母液(改良营养肉汤浓缩液)分装于500mL三角烧瓶中，用无菌水稀释10倍并调节温度至33℃±2℃，再将该所提供的高效菌剂接种到三角烧瓶中，在恒温振荡器上活化5-6h后转接到发酵罐豆饼粉培养基培养5-6h即可获得活化菌液(菌液呈蓝绿色)。
(3)浸泡接种  按苎麻重量对液体为1∶8-12的比例灌自来水到接种锅并用蒸汽调节水温到34±1℃，将上述活化菌液注入其中稀释成活菌含量在5×107cfu·mL-1以上的菌悬液，再把装载苎麻的麻笼浸泡于菌悬液中处理10-15分钟。
(4)湿润发酵  将接种过的麻笼置于33℃±2℃、相对湿度在85％以上、空气对流的环境中发酵5-6h，直至苎麻变成蓝色，用水冲洗纤维分散。
(5)热水灭活与循环洗涤  将接种剩余菌悬液、菌种活化罐冷却水、洗罐水、接种锅清洗废水一并收集到热水罐加热至90℃，同时，将经过发酵处理的麻笼置于带有循环装置的洗麻锅中，按照苎麻重量对水的重量为1∶10的比例，将加热后的废液注入洗麻锅中，循环冲洗25min～35min，排出废液，再用60℃～80℃温水和清水依次循环冲洗5min～10min各一次。
(6)水理  将灭活以后的发酵苎麻置于自行设计试制的类似于进口苎麻纤维水理机的装置上进行碾压、搓松和高压水柱冲洗，以除去那些已经降解但是依然附着在苎麻纤维上的非纤维素残留物。给水管道的水压≥0.35MPa。
(7)纤维整理  纤维整理包括渍油、脱水(轧干)、抖麻、烘干等常规工序，各工序具体技术参数与常规方法相差无几。
4、实施效果
至2007年8月底，沅江市明星麻业有限公司累计应用本发明技术方案生产出将近500t苎麻精干麻。生产实践测算结果表明：(1)将苎麻加工成精干麻的脱胶制成率提高12％，燃煤节省2t/t精干麻，水节省360M3/t精干麻，烧碱、硫酸、钠盐等化学试剂减少89.9％。(2)精干麻纤维分散度好，弯曲疲劳及扭曲频率等内在品质指标提高15％-225％，苎麻纱的综合品质明显改善，精梳梳成率提高12.8％。(3)无机污染物减少89.9％，有机污染物指标CODcr和BOD5分别降低85.98％和77.25％；锅炉废气、废渣和废汽排放量减少60％以上，机械噪音明显降低。(4)将1t苎麻加工至苎麻纱增收节支效益在3000元以上。