用于制备任选放射标记的伊马替尼的方法和中间体.pdf

本发明涉及制备式(I)的N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪子基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺的新方法、制备将N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪子基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺施用于温血动物后观察到的其代谢物的新方法以及用于所述方法的中间体。新原料以及其制备方法同样是本发明的主题。这里所述的方法尤其适合于提供具有同位素标记的所述化合物。由此获得的标记化合物特别适合于在临床和临床前研究中追踪和研究N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪子基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺以及其可药用盐的代谢。

权利要求书
1.  式I化合物，

其中R1和R2都是氢且C*表示通过富集一种碳同位素14C而被标记的碳。

2.  制备式I化合物的甲磺酸盐的方法，

其中R1和R2都是氢且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳，
其如下制备：使1-甲基哌嗪与式II化合物反应，

其中Hal表示卤素且其它基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义。

3.  式VIII化合物，

其中R5是氢或C1-4烷基且C*表示通过富集碳同位素14C而被标记的碳。

4.  制备式VIII化合物的方法，

其中R5是氢或C1-4烷基且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳，
其如下获得：使式X化合物

其中R5是保护基或C1-4烷基且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳，
与式XI化合物反应，

继而在R5构成保护基的情况下裂解保护基R5。

5.  式XIII化合物，

其中R1和R2都是氢且C*表示通过富集碳同位素14C而被标记的碳。

6.  制备式XIII化合物的方法，

其中R1和R2都是氢且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳，
该方法如下进行：氧化式I化合物，

其中R1和R2都是氢且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳。

7.  式XIV化合物，

其中R1和R2都是氢且C*表示通过富集碳同位素14C而被标记的碳。

8.  制备式XIV化合物的方法，

其中R1和R2都是氢且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳，
该方法如下进行：使式XVI化合物与1-甲基哌嗪反应，

其中Hal表示卤素，R1和R2都是氢且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳。

9.  式XVIII化合物，

其中R1和R2都是氢且C*表示通过富集碳同位素14C而被标记的碳。

10.  制备式XVIII化合物的方法，

其中R1和R2都是氢且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳，
该方法如下进行：使式II化合物

其中Hal表示卤素，R1和R2都是氢且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳，
与式XVII的哌嗪衍生物反应，


11.  式XX化合物，

其中C*表示通过富集碳同位素13C而被标记的碳且N*表示具有天然同位素分布或者通过富集氮同位素15N而被标记的氮。

12.  制备式XX化合物的方法，

其中C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳，且N*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种氮同位素15N而被标记的氮，
该方法包括：使式XXI的吡啶衍生物

其中R6和R7都是C1-4烷基且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳，
与式XXII的苯基胍衍生物反应，

其中R8和R9都是氢，C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳，且N*表示具有天然同位素分布或通过富集一种氮同位素15N而被标记的氮。

13.  式X化合物，

其中R5是保护基或C1-4烷基且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素而被标记的碳。

说明书用于制备任选放射-标记的伊马替尼的方法和中间体
N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪子基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺(式I化合物，伊马替尼(Imatinib))的甲磺酸盐以商标Glivec(Gleevec)市售。Glivec是一种适合于治疗慢性髓细胞性白血病和GIST(胃肠道间质瘤)的酪氨酸激酶抑制剂。N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪子基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺例如可以如US5,521,184所公开进行制备。N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪子基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺的单甲磺酸盐例如可以如WO99/03854的实施例4和6所述或者如WO03/090720所述进行制备和配制。
本发明涉及制备N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪子基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺(式I化合物，伊马替尼)的新方法、制备将N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪子基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺施用于温血动物后观察到的其代谢产物的新方法以及用于所述方法的中间体。新原料以及其制备方法同样也是本发明的主题。这里所述的方法尤其适合于提供具有同位素标记的所述化合物。由此获得的标记化合物特别适合于在临床和临床前研究中追踪和研究N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪子基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺以及其可药用盐的代谢。
基于本专利说明书的公开内容，本领域技术人员能够制备除具体提及的那些N-氧化物之外的本文所述化合物的N-氧化物衍生物、前体药物衍生物、被保护的衍生物、各异构体及其异构体混合物以及其可药用的盐。
在第一个实施方案中，式I化合物的甲磺酸盐如下制备：

其中R1和R2都是氢且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素、例如14C而被标记的碳，
使1-甲基哌嗪与式II化合物反应，

其中Hal表示卤素，优选氯，且其它基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义。
其中Hal表示卤素、优选氯且其它基团和符号具有以上对式I化合物所定义含义的式II化合物可以如下获得：首先使其中R1具有以上对式I化合物所定义含义的式III的盐酸加成盐

与H2NC*N反应，其中C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素、例如14C而被标记的碳，
得到式IV的胍基取代的硝基苯基衍生物，

其中基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义。
在第二步中，将式IV的胍基取代的硝基苯基衍生物进一步还原成相应的式V的胍基取代的氨基苯基衍生物，

其中基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义。
在第三步中，通过使该式V的胍基取代的氨基苯基衍生物与式VI的吡啶基衍生物反应，

其中R3和R4都是C1-4烷基，
得到式VII的吡啶基嘧啶，

其中基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义。
最后，使该式VII的吡啶基嘧啶与4-卤代甲基-苯甲酸反应，得到式II的酰胺。
其中基团和符号具有以上对式I化合物所定义含义的式VII的吡啶基嘧啶也可以通过以下途径制备。在第一步中，使其中基团和符号具有以上所定义含义的式I化合物与用保护基替代连接于氮原子的氢原子的试剂反应，从而得到式I化合物，

其中R1和R2都表示保护基且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素、例如14C而被标记的碳。
在第二步中，通过水解除去该分子的苯甲酸单元，得到式XII的游离胺，

其中R1和R2都表示保护基且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素、例如14C而被标记的碳，
然后用氢代替保护基R1和R2，即除去保护基，释放出式II化合物，其中基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义。
在第二个实施方案中，式VIII化合物

其中R5是氢或C1-4烷基且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素、例如14C而被标记的碳，
可如下制备：使式X化合物

其中R5是保护基、例如叔-丁氧基羰基或C1-4烷基，且C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素、例如14C而被标记的碳，
与式XI化合物反应，

继而在R5构成保护基的情况下裂解保护基R5。
其中基团和符号具有以上所定义含义的式X化合物可如下获得：

使式IX化合物

其中R5是保护基、例如叔-丁氧基羰基或C1-4烷基，
首先与叔-丁基锂反应，制得相应的锂代(lithio)衍生物，使该锂代衍生物与C*O2反应，其中C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素、例如14C而被标记的碳。
另一方面，本发明涉及式XIII化合物的制备，

其中基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义，
其通过氧化其中基团和符号具有以上所定义含义的式I化合物而进行。
另一方面，本发明涉及式XIV化合物的制备，

其中基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义，
其如下进行：使其中Hal表示卤素、优选氯且其它基团和符号具有以上对式I化合物所定义含义的式XVI化合物

与1-甲基哌嗪反应。
原料即其中Hal表示卤素且其它基团和符号具有以上对式I化合物所定义含义的式XVI化合物可通过以下方法获得。首先，使其中R1和R2都是氢的式VII的游离胺与引入保护基的试剂在仲氨基存在下完成伯胺一个氢原子的选择替代的条件下反应，然后氧化吡啶基氮原子，例如用MCPBA氧化，得到式XV的N-氧化物，

其中R1和R2都是氢，PG表示保护基且其它符号具有以上对式I化合物所定义的含义。首先，使该式XV的N-氧化物经历除去保护基PG的条件，然后使所得游离胺与4-卤代甲基苯甲酸反应，得到式XVI化合物，其中Hal表示卤素且其它基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义。
在另一个实施方案中，本发明提供式XVIII化合物，

其中基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义，
其如下获得：使式II化合物

其中Hal表示卤素、优选氯，且其它基团和符号具有以上对式I化合物所定义的含义，
与式XVII的哌嗪衍生物反应，

最后，本发明涉及式XX化合物的制备，

其中C*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种碳同位素、例如13C而被标记的碳，且N*表示具有天然同位素分布或者通过富集一种氮同位素、例如15N而被标记的氮，
其包括使式XXI的吡啶衍生物

其中R6和R7都是C1-4烷基且其它符号具有以上对式XX化合物所定义的含义，
与式XXII的苯基胍衍生物反应，

其中R8和R9都是氢且其它符号具有以上对式XX化合物所定义的含义。
其中R6和R7都是C1-4烷基且其它符号具有以上对式XX化合物所定义含义的式XXI的吡啶衍生物可如下制备：以3-三甲基甲锡烷基吡啶为原料，使该化合物与式XXIV的乙酰卤反应，

其中Hal表示卤素且其它符号具有以上对式XX化合物所定义的含义，得到式XXIII的乙酰基吡啶，

其中的符号具有以上对式XX化合物所定义的含义。
使该式XXIII的乙酰基吡啶进一步与二-C1-4烷基甲酰胺缩二-C1-4烷基醇(di-C1-4alkyl formamide di-C1-4alkyl acetal)反应，得到所需的式XXI的吡啶衍生物，其中R6和R7都是C1-4烷基且其它符号具有以上对式XX化合物所定义的含义。
其中R8和R9都是氢且其它符号具有以上对式XX化合物所定义含义的式XXII的氨基苯基胍衍生物可如下制备：以式XXV的硫脲衍生物为原料

其中R8和R9都是氢且其它符号具有以上对式XX化合物所定义的含义，使该式XXV的硫脲衍生物与用保护基、例如叔-丁氧基羰基交换各氨基的一个氢原子的试剂反应，得到式XXV的硫脲衍生物，其中R8和R9都表示保护基。然后，使该被保护的式XXV的硫脲衍生物与2-甲基-5-硝基苯胺反应，得到式XXVI的硝基苯基胍衍生物，

其中R8和R9都表示保护基且其它符号具有以上对式XX化合物所定义的含义。
将两个保护基裂解，继而还原硝基官能团，最后得到式XXII的氨基苯基胍衍生物，其中R8和R9都是氢且其它符号具有以上对式XX化合物所定义的含义。
所有其余原料均已知、能够根据已知方法制备或者市售可得；其特别可以用实施例所述的方法制备。
这里所述的所有方法步骤均可在已知反应条件下进行，优选在具体提及的那些条件下，不存在或者通常存在溶剂或稀释剂，优选对所用试剂呈惰性并能够溶解它们的溶剂或稀释剂，不存在或存在催化剂、缩合剂或中和剂，例如离子交换剂，通常为阳离子交换剂、例如H+形式的阳离子交换剂，取决于反应类型和/或反应物，在降低、正常或升高的温度、例如-100℃至约190℃、优选约-80℃至约150℃、例如-80至-60℃、室温、-20至40℃或所用溶剂的沸点，在大气压下或密封容器中，酌情在压力下，和/或在惰性气氛、例如氩气或氮气下。可从中选择的适合于所讨论反应的溶剂包括例如水；酯类，通常为低级链烷酸低级烷基酯，例如乙酸二乙酯；醚类，通常为脂族醚、例如乙醚，或环状醚类，例如四氢呋喃；液态芳族烃类，通常为苯或甲苯；醇类，通常为甲醇、乙醇或1-或2-丙醇；腈类，通常为乙腈；卤化烃类，通常为二氯甲烷；酰胺类，通常为二甲基甲酰胺；碱类，通常为杂环氮碱，例如吡啶；羧酸类，通常为低级链烷羧酸，例如乙酸；羧酸酐类，通常为低级链烷酸酐，例如乙酸酐；环状、直链或支链烃类，通常为环己烷、己烷或异戊烷，或这些溶剂的混合物，例如水溶液，方法描述中另有指示除外。该类溶剂混合物也可用于例如通过色谱法或分配进行的处理中。
通过使化合物的游离碱形式与可药用的无机酸或有机酸反应，可将本发明的化合物制备为可药用的酸加成盐。或者，通过使化合物的游离酸形式与可药用的无机或有机碱反应，可制备本发明化合物的可药用碱加成盐。或者，用原料或中间体的盐可制备盐形式的本发明化合物。
游离酸或游离碱形式的本发明化合物可以分别由相应的碱加成盐或酸加成盐形式制备。例如，通过用适合的碱(例如氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)处理可将酸加成盐形式的本发明化合物转化成相应的游离碱。通过用适合的酸(例如盐酸等)处理可将碱加成盐形式的本发明化合物转化成相应的游离酸。
本发明化合物的非氧化形式可以由本发明化合物的N-氧化物、通过用还原剂(例如硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化磷等)在适合的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、含水二烷等)中、在0至80℃处理而制备。
本发明化合物的前体药物衍生物可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备(例如，进一步细节可参见Saulnier等人(1994)，Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters，第4卷，1985页)。例如，通过使未衍生的本发明化合物与适合的氨基甲酰化试剂(例如1，1-酰氧基烷基氨基甲酰氯(1，1-acyloxyalkylcarbanochloridate)、碳酸对-硝基苯基酯等)反应，可制备适合的前体药物。
本发明化合物的保护形式的衍生物可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备。在T.W.Greene，“有机化学中的保护基”，第3版，John Wileyand Sons，Inc.，1999中可以找到适合于产生保护基以及除去保护基的技术的详细描述。
在本发明的方法中，本发明化合物可以方便地被制备或者被成形为溶剂合物(例如水合物)。本发明化合物的水合物可以方便地通过使用有机溶剂如二氧芑、四氢呋喃或甲醇、用含水/有机溶剂混合物重结晶而制备。
通过使化合物的外消旋混合物与光学活性拆分试剂反应以形成一对非对映异构化合物、分离非对映异构体并回收光学纯的对映异构体，可将本发明化合物制备为其各个立体异构体。虽然对映异构体的拆分可以用本发明化合物的共价非对映体衍生物进行，但是优选可解离的复合物(例如结晶的非对映体盐)。非对映异构体具有独特的物理性质(例如熔点、沸点、溶解度、反应性等)并且可以通过利用这些差异容易地对其进行分离。非对映异构体可以通过色谱法或者优选通过基于溶解度差异的分离/拆分技术来分离。然后，用不会导致外消旋化的任何实用手段与拆分试剂一起回收光学纯的对映异构体。适用于从外消旋混合物拆分立体异构体的技术的详细描述可见于Jean Jacques，Andre Collet，Samuel H.Wilen，“对映异构体，外消旋体和拆分”，John Wiley And Sons，Inc.，1981。
在实施例中可见上述化合物合成的详细实例。在优选的实施方案中，根据或类似于实施例中所定义的方法和方法步骤制备上述化合物。
实施例
以下阐明上述化合物制备的实施例进一步示例而非限制本发明。
缩写
DMAP   二甲基氨基吡啶
DMSO   二甲基亚砜
MCPBA  间-氯过苯甲酸
MeOH   甲醇
NMR    核磁共振
RT     室温
THF    四氢呋喃
TLC    薄层色谱
w/v    重量/体积
实施例1：4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺甲磺酸盐
将1-甲基哌嗪(3ml，27mmol)加至4-氯甲基-N-{4-甲基-3-[4-(1-氧基-吡啶-3-基)-[2-14C]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-苯甲酰胺盐酸盐(步骤1.5，335mg，0.71mmol)在乙醇(20ml)中的溶液中并将所得混合物在45℃搅拌5小时。将该混悬液冷却至RT并加入水(4.4ml)，继而加入20％w/v氢氧化钠(130μl)。将所得混悬液在90℃搅拌30分钟，然后冷却至RT，离心并除去水性溶剂。将该米色晶体再用水洗涤2次并在高真空下干燥。最后，将该固体用硅胶快速色谱纯化，用二氯甲烷：MeOH 90∶10和1％氨洗脱，得到中间体，为黄色油。最后，将所得中间体溶解于MeOH(4ml)中，加入甲磺酸(21μl)并搅拌所得溶液。通过用无活性的参考产物接种，使所得产物从溶液中结晶，得到比活度为1.73 GBq/mmol的标题产物。
1H-NMR 400 MHz(DMSO-d6)δ：2.21(s，3H)；2.3(s，3H)；2.8(s，3H)；2.85-3.1(m，4H)；3.25-3.4(m，4H)；3.62(br.s，3H)；7.18(d，J＝8Hz；1H)；7.38-7.51(m，4H)；7.91(d，7.6Hz，1H)；8.5(d，J＝1.4Hz，1H)；8.45(d，J＝7.8，1H)；8.49(d，J＝5Hz，1H)；8.65(dd，J＝1.5和4.6Hz，1H)；8.95(s，1H)；9.22(d，J＝1.5Hz，1h)；9.29(br.s，1H)，10.12(s，1H)；MS：(MH+，496.4)。
步骤1.1：[14C]氨腈
将[14C]碳酸钡(1.18g，6mmol，10.4 GBq，1.79 GBq/mmol)置于圆柱形石英玻璃管中并加热至800℃，同时通温和氨气流。3小时后，使该[14C]氰氨化钡粗品冷却至RT并停止氨气流。将该[14C]氰氨化钡粗品(1.063g，6mmol)混悬于水(10ml)中并通过超声处理使其溶解。在搅拌下小心滴加2M硫酸(2.6ml)直至pH为5.5。在60℃、23托下除去水。将残余物用干冰/丙酮冷却并将残余的水冷冻干燥，得到晶状固体产物。将其置于乙醚中，过滤除去不溶性残余物。除去醚并将所得残余物溶解于叔-丁醇中。
步骤1.2：N-(2-甲基-5-硝基-苯基)-[14C]胍
向2-甲基-4-硝基苯胺(1.52g，19mmol)在叔-丁醇中的40℃搅拌溶液加入含4M盐酸的二烷(5ml)，得到黄色混悬液。除去溶剂并将该干残余物加至[14C]氨腈(步骤1.2)粗品在叔-丁醇(5ml)中的溶液中，得到黄色混悬液。加热至100℃达1小时后，得到溶液。再5小时后，在45℃除去溶剂并将残余物用3％w/v氢氧化钠(10ml)处理并用二氯甲烷(3 × 30ml)萃取。将有机相合并并蒸发，进行硅胶色谱处理，用75∶25∶0.5∶0.5二氯甲烷∶MeOH∶水∶乙酸洗脱，得到标题产物，6.07 GBq。
步骤1.3：N-(5-氨基-2-甲基-苯基)-[14C]胍
将含10％Pd/C(125mg)、N-(2-甲基-5-硝基-苯基)[14C]胍(步骤1.2)(760mg，3.91mmol)在正-丁醇(25ml)中的混合物在1个氢气大气压、RT搅拌4.5小时。将该混合物用Hyflo(硅藻土)过滤，再用一部份正-丁醇(3×10ml)洗涤，合并并在旋转蒸发器上于45℃除去正-丁醇，得到粗品，为无色油。放射TLC 80∶25∶0.5∶0.5二氯甲烷∶MeOH∶水∶乙酸，硅胶F254板上的RF＝0.34；总活度为3.7 GBq。
步骤1.4：4-甲基-N*3*-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基)-苯-1，3-二胺
将N-(5-氨基-2-甲基-苯基)-[14C]胍(步骤1.4，476mg，2.89mmol)粗品和3-二甲基氨基-1-吡啶-3-基-丙烯酮(509mg，2.89mmol)在正-丁醇(30ml)中的溶液回流(130℃)加热3.5小时。除去溶剂并用快速色谱纯化，用2∶98戊烷∶丙酮洗脱，得到标题产物，为黄色泡沫。放射TLC：2∶98戊烷∶丙酮，硅胶F254板上的RF＝0.5。总活度为2.3 GBq。
步骤1.5：4-氯甲基-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺
向氩气下、0℃的4-甲基-N*3*-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基)-苯-1，3-二胺(步骤1.4，655mg，2.36mmol)在无水THF(20ml)中的溶液滴加4-(氯甲基)-苯甲酰氯(2.646g，14mmol)在THF(10ml)中的溶液并将相应的混合物在RT搅拌16小时。将所得混悬液离心，将沉淀产物用醚洗涤，重新离心，除去醚并将该固体干燥，得到标题产物的盐酸盐。
实施例2：4-(哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺盐酸盐
向4-{4-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基[14C]氨基甲酰基]-苄基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(步骤2.3，200.5mg，0.536mmol，486.8MBq)中加入含3M HCl的MeOH(20ml)。30分钟后，再向其中加入10ml含3M HCl的MeOH并将该反应物再搅拌60分钟。将产物在抽滤下用玻璃垂熔漏斗滤出，首先用冷MeOH(5ml)、然后用乙酸乙酯(100ml)洗涤，使其在高真空下干燥，得到标题化合物，为橙色晶体。
步骤2.1：4-(4-溴-苄基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将N-boc-哌嗪(4.94g，26.5mmol)、对-溴-苄基溴(5.52g，22mmol)和K2CO3(6.4g，46mmol)在MeOH(50ml)中的混合物在RT搅拌90分钟。将该混合物用玻璃垂熔漏斗过滤并蒸发溶剂。将残余物置于二氯甲烷中，第二次用垂熔漏斗过滤并用二氯甲烷洗涤。将滤液蒸发并将无色油粗品用硅胶色谱处理，用乙醚/正-己烷(10∶90至50∶50)洗脱，得到标题产物，为白色固体。
步骤2.2：4-(4-[14C]羧基-苄基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在-78℃，将1.5 M叔-丁基锂在己烷(0.97ml，1.46mmol)中的溶液加至4-(4-溴-苄基)-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯(步骤2.1，285mg，0.8mmol)在无水THF(5ml)中的溶液中并将该混合物在-78℃搅拌4分钟。将所得锂代衍生物冷却至-192℃，使其与通过向[14C]碳酸钡(0.85 eq，122mg，0.62mmol，1378MBq，Amersham Pharmacia Biotech)中加入浓硫酸而产生的二氧化[14C]碳反应，然后温至-78℃并搅拌30分钟。将反应用MeOH(1ml)在-78℃淬熄，然后使之温至RT。在真空下除去溶剂并加入饱和氯化铵。将混合物用乙酸乙酯(3×15ml)萃取，合并并用硫酸钠干燥。过滤并除去溶剂，得到粗品白色固体。将该粗品用硅胶色谱处理，首先用乙醚、然后用10％MeOH 90％乙醚洗脱。合并级分，在旋转蒸发器上蒸发，然后高真空，得到标题产物，为白色固体。
步骤2.3：4-{4-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基[14C]氨基甲酰基]-苄基}-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯
向4-(4-[14C]羧基-苄基)-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯(步骤2.2，171.5mg，0.536mmol，1114.26MBq)在THF(5ml)中的RT、搅拌溶液中滴加三乙胺(332μl，2.4mmol)，继而滴加氯甲酸异-丁酯(78μl，1.0mmol)。将该混合物再搅拌3分钟，然后加入4-甲基-N-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基)-苯-1，3-二胺(165mg，1.0mmol)。18小时后，将该溶液蒸发并将残余物用二氧化硅快速色谱处理，首先用乙酸乙酯、然后用10％MeOH/90％乙酸乙酯、然后用35％MeOH/65％乙酸乙酯洗脱，分离标题产物，为浅黄色固体。
实施例3：4-甲基-N*3*-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基)-苯-1，3-二胺将(5-叔-丁氧基羰基氨基-2-甲基-苯基)-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基)-氨基甲酸叔-丁酯(步骤3.2，86mg，0.18mmol)和三氟乙酸(463mg，310μl，4.06mmol)的溶液在RT搅拌过夜。根据在线控制(RTLC，硅胶，CH2Cl2∶MeOH 95∶5)，没有检测到原料。在真空下除去溶剂并使该粗物质在1N HCl水溶液和CH2Cl2之间分配。再次萃取有机相后，将酸性含水级分合并，用2N NaOH水溶液碱化并用CH2Cl2萃取三次。将有机相用盐水洗涤后，将有机相用Na2SO4干燥并蒸发溶剂。将粗物质(48mg)用快速色谱纯化(硅胶，CH2Cl2∶MeOH 98.5∶1.5)，到标题产物。比活度为1.934 GBq/mmol。MS：+cESI：279.89 M+。1H-NMR(500.1 MHz，d6-DMSO)：2.08(s，3H)，4.88(s，2H)，6.35(dd，1H，J＝2Hz，J＝7.9Hz)，6.8(d，1H，J＝1.7Hz)，6.80(d，1H，8.1Hz)，7.37(d，1H，5.3Hz)，7.55(dd，1H，J＝4.8Hz，J＝8Hz)，8.41(m，1H)，8.47(d，1H，J＝5.2Hz)，8.67(s，1H)，8.70(dd，1H，J＝1.5Hz，J＝4.9Hz)，9.25(d，1H，J＝1.9Hz)。
步骤3.1：(5-{叔-丁氧基羰基-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基]-氨基}-2-甲基-苯基)-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基)-氨基甲酸叔-丁酯
在RT、氩气下将4-二甲基氨基吡啶(30mg，0.24mmol)加至4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺(实施例1，120mg，0.24mmol)和二碳酸二-叔-丁基酯(265mg，1.22mmol)在CH2Cl2(2ml)中的混悬液中后，形成橙色溶液，将其在RT搅拌过夜。在真空下除去溶剂并将该粗品用二氧化硅色谱处理，用CH2Cl2∶MeOH 93∶7洗脱。合并级分，在旋转蒸发器上蒸发，然后高真空，得到标题产物。
步骤3.2：(5-叔-丁氧基羰基氨基-2-甲基-苯基)-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基)-氨基甲酸叔-丁酯
将(5-{叔-丁氧基羰基-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰基]-氨基}-2-甲基-苯基)-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基)-氨基甲酸叔-丁酯(步骤3.1，153mg，0.22mmol)和2-二乙基氨基乙基胺(53mg，64μl，0.45mmol)在THF(0.8ml)中的溶液在RT搅拌过夜。根据在线控制(RTLC，硅胶，CH2Cl2∶MeOH 95∶5)，加入另外的2-二乙基氨基乙基胺(159mg，192μl，1.35mmol)直至几乎检测不到原料。在真空下除去溶剂后，将粗品用快速色谱纯化(硅胶，CH2Cl2∶MeOH 98∶2)，得到标题产物。
实施例4：4-(4-甲基-4-氧基-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺
将4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺(实施例1，414mg，43.4mCi，1605.8MBq)在无水二氯甲烷(10ml)中的溶液在RT用MCPBA(260mg，1.5mmole)处理2小时。将形成的沉淀滤出，将滤液蒸发并将粗品用硅胶快速色谱纯化，用二氯甲烷∶MeOH 70∶35洗脱，得到标题产物，为白色固体。将产物用乙醇/乙酸乙酯结晶。
1H-NMR 400MHz(DMSO-d6)δ：2.21(s，3H)，2.78-2.89(m，4H)；3.01(s，3H)；3.28-3.38(m，4H)；3.6(s，2H)；7.18(d，J＝8.3Hz，1H)；7.38-7.51(m，5H)；7.89(s，1H)；7.91(s，1H)；8.03(s，1H)；8.45(d，J＝7.9Hz，1H)；8.49(d，J＝5.4Hz，1H)；8.66(dd，J＝2，4.2，1H)；8.98(s，1H)；9.25(d，J＝2；1H)；10.2(s，1H)；MS：(MH+＝512)。
实施例5：N-{4-甲基-3-[4-(1-氧基-吡啶-3-基)-[2-14C]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺
将1-甲基哌嗪(2ml，18mmol)加至4-氯甲基-N-{4-甲基-3-[4-(1-氧基-吡啶-3-基)-[2-14C]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-苯甲酰胺(步骤5.2，151mg，0.34mmole)在乙醇(20ml)中的溶液中并将所得混合物在60℃搅拌1小时。将溶液蒸发，将残余物用硅胶快速色谱纯化，用二氯甲烷∶MeOH 90∶10和1％氨洗脱，得到黄色油。将该油用二氯甲烷∶MeOH结晶，得到N-氧化物产物，为晶状固体，175.3MBq。1H-NMR 400 MHz(DMSO-d6)δ：2.15(s，3H)；2.21(s，3H)；2.25-2.42(m，4H)；3.28-3.34(m，4H)；3.52(s，2H)；7.19(d，J＝9.1Hz；1H)；7.38-7.42(m，3H)；7.45-7.52(m，2H)；7.88(s，1H)；7.89(s，1H)；7.99-8.2(m，2H)；8.28(d，J＝6.8Hz，1H)；8.5(d，J＝5.4Hz，1H)；8.8(2，1H)；9.2(s，1H)，10.1(s，1H)。
步骤5.1：{4-甲基-3-[4-(1-氧基-吡啶-3-基)-[2-14C]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-氨基甲酸叔-丁酯
将4-甲基-N-3-(4-吡啶-3-基-[2-14C]嘧啶-2-基)-苯-1，3-二胺(实施例3，286mg，1.03mmole，1890MBq)在THF(10ml)中的混悬液用二碳酸二-叔-丁基酯(467mg，2.33mmole)和催化量的DMAP处理并回流加热2小时。在真空下除去溶剂并将粗品用二氧化硅快速色谱纯化，用二氯甲烷∶MeOH，95∶5洗脱，得到被保护的产物，为黄色泡沫。将该化合物溶解于二氯甲烷中，冷却至-10℃，用MCPBA(285mg，1.65mmol)处理并在0℃搅拌4小时。过滤沉淀，蒸发溶剂，将粗品进一步用二氧化硅快速色谱纯化，用二氯甲烷∶MeOH 95∶5洗脱，得到标题产物，为黄色泡沫。
步骤5.2：4-氯甲基-N-{4-甲基-3-[4-(1-氧基-吡啶-3-基)-[2-14C]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-苯甲酰胺
将盐酸(4ml 4N溶液)加至{4-甲基-3-[4-(1-氧基-吡啶-3-基)-[2-14C]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-氨基甲酸叔-丁酯(步骤5.1，187mg，0.48mmol)在THF(10ml)中的混悬液中。将所得混合物在70℃加热1小时。将经冷却的混合物蒸发，得到黄色固体，将其用二氧化硅快速色谱纯化，用二氯甲烷∶MeOH 75∶35洗脱，得到黄色晶体。将这些晶体混悬于THF(10ml)中，用25％氢氧化铵水溶液(1滴)处理并将所得混合物超声处理。将该混悬液过滤并蒸发溶剂，得到黄色泡沫。将泡沫溶解于THF(10ml)中，滴加4-(氯甲基)-苯甲酰氯(149mg，0.8mmol)在THF(2ml)中的溶液进行处理并将相应的混合物在RT搅拌2小时。将所得混悬液离心，将沉淀的产物进一步用醚洗涤，重新离心，除去醚并将固体干燥，得到标题产物，为褐色晶体。实施例6：4-(4-甲基-[2，2，3，3，5，5，6，6-D8]哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺
将4-氯甲基-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺(3.57g，8.30mmol；根据实施例1用未标记的原料获得)溶解于二甲基甲酰胺(50ml)中。向该溶液加入碳酸钾(5.74g，41.5mmol)和N-甲基哌嗪-2，2，3，3，5，5，6，6-d8(815mg，7.54mmol，Isotec，Inc.of Miamisburg，OH)。将该混合物加热至45-50℃达约12-14小时。通过TLC监测反应，使用由DCM/EtOAc/MeOH/NH4OH(25％)(60/10/10/2)组成的溶剂系统，产物的Rf约0.30。在真空下除去DMF并将残余物用水研磨。该水洗操作产生十分粘的残余物，将其溶解于乙酸乙酯中，将水相真空浓缩，将残余物溶解于乙酸乙酯中。将合并的物质用使用与上述相同溶剂系统的快速色谱纯化四次。将产物置于小瓶中，然后置于处于真空(0.01mm汞柱)下、干燥温度65℃(回流的甲醇)的Abderhalden干燥装置中。MS ES+502.4(100％)[M+H]+，503.5(40％)，504.5(4％)；1H NMR(d6-DMSO)δ：2.1(3H，s)，2.4(3H，s)，3.6(2H，s)，7.2(1H，d)，7.5(3H，m)，7.8(2H，d)，8.1(1H，s)，8.5(2H，m)，8.8(1H，s)，9.0(1H，s)，9.2(1H，s)，10.1(1H，s)。
实施例7：4-甲基-N-(4-吡啶-3-基-[1，3-15N2，2，4，5-13C3]嘧啶-2-基)-苯-1，3-二胺
将N-(5-氨基-2-甲基-苯基)-[13C，15N2]胍粗品(步骤7.7，157mg，0.96mmol)和3-二甲基氨基-1-吡啶-3-基-[1，2-13C2]丙烯酮(步骤7.3，169mg，0.96mmol)在正-丁醇中的溶液回流(130℃)加热5小时。除去溶剂并用快速色谱纯化，用5∶95戊烷∶丙酮洗脱，得到纯标题产物，为黄色固体，1H-NMR400MHz(CDCl3)δ：9.14(1H，s，ArH)，8.73(1H，d，J 4，ArH)，8.50(1H，d八重峰，J 7，1.2，ArH)，8.37(1H，m，ArH)，7.70(1H，s，NH)，7.45(1H，dd，J 8，5)，7.17(1H，dm，J 168，ArH)，7.03-6.99(2H，m，ArH)，6.46(1H，dd，J 8，1.2，ArH)，2.27(3H，s，CH3)：MS(c+ESI)：283.3(100％)[M+H]+，284.4(15％)。
步骤7.1：3-三甲基锡烷基-吡啶
在氮气下，向两颈烧瓶中放入3-溴吡啶(4g，25.3mmol)，然后放入乙醚(40ml)。将该溶液冷却至-78℃，然后加入1.5 M正-丁基锂的己烷溶液(20ml，30.4mmol)。将所得黄色溶液搅拌10分钟，然后加入氯化三甲基锡(5.04g，25.3mmol)在乙醚(2ml)中的溶液。将所得溶液在-78℃搅拌20分钟，然后使其在1小时内缓慢温至RT。使该溶液在己烷(50ml)和水(100ml)之间分配，振摇并将有机层分离。将水相再用己烷(50ml)萃取两次，将有机相合并并用水(100ml)洗涤。将己烷相用硫酸钠干燥，过滤并将滤液蒸发，得到油状粗品，使其通过硅胶柱，用9∶1己烷∶乙酸乙酯洗脱并收集产物级分。合并级分，蒸发，得到浅黄色油，通过在Kugelrohr烘箱中蒸馏进一步纯化，得到标题产物，将其在50 mbar、100℃蒸馏，为无色油。
步骤7.2：1-吡啶-3-基-[13C2]乙酮
向30ml安瓿中放入3-三甲基甲锡烷基吡啶(步骤7.1，1.83g，7.56mmol)、新蒸馏的[13C2]乙酰氯(0.67g，8.32mmol)、PdCl2(PPh3)2(0.3g，0.44mmol)和无水苯(20ml)。将该安瓿密封并在95℃的油浴中放置过夜。将该安瓿打开，取出内含物，在水(30ml)和乙酸乙酯(30ml)之间分配并振摇。将有机相分离，用乙酸乙酯(2×30ml)对水相反萃取两次。将有机相合并并用水(30ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并小心蒸发滤液。将该油状粗品经硅胶纯化，用1∶1己烷∶乙酸乙酯洗脱，在小心冷冻干燥后得到标题产物。
步骤7.3：(E/Z)-3-二甲基氨基-1-吡啶-3-基-[1，2-13C2]丙烯酮
在密封的安瓿中，将1-吡啶-3-基-[13C2]乙酮(步骤7.2，500mg，4.06mmol)和N，N-二甲基甲酰胺缩二甲醇(628mg，5.28mmol)加热至100℃过夜。将该粗品用硅胶色谱纯化，用9∶1二氯甲烷∶甲醇洗脱，得到标题产物，为黄色晶体。
步骤7.4：[13C，15N2]硫脲-N，N’-二甲酸叔-丁酯
向0℃、氩气下氢化钠(60％矿物油分散体，1.18g，29.61mmol)在无水THF(50ml)中的混悬液中滴加得自Aldrich Chem.Co.的[13C，15N2]硫脲(500mg，6.58mmol)在无水THF(82ml)中的溶液。完全加入后，将该溶液搅拌5分钟，然后加入二碳酸二-叔-丁基酯(3.16g，14.48mmol)并将相应的溶液搅拌1小时。滴加NaHCO3饱和溶液(13ml)，然后滴加水(230ml)。将产物萃取到乙酸乙酯(3×150ml)中，将有机相合并，用盐水洗涤并用硫酸钠干燥，过滤并将滤液蒸发，得到粗品，为油状物。
步骤7.5：N-(2-甲基-5-硝基-苯基)-[13C，15N2]胍-N，N’-酸叔-丁酯
向[13C，15N2]硫脲-N，N’-二甲酸叔-丁酯粗品(步骤7.4，2.35g.6.58mmol)、2-甲基-5-硝基苯胺(1.00g，6.58mmol)、三乙胺(3.0ml，21.71mmol)在DMF中的0℃、搅拌的橙色溶液中加入固体氯化汞II(1.97g，7.24mmol)。在RT搅拌15分钟后，加入乙酸乙酯(50ml)并将混合物用Hyflo(硅藻土)过滤。将该乙酸乙酯溶液用水(50ml)、然后用盐水(50ml)洗涤并用硫酸钠干燥。将干燥剂滤出并将滤液蒸发，得到油状物，将其用硅胶快速色谱纯化，首先用100％己烷、然后用90∶10己烷∶乙酸乙酯、然后用80∶20己烷∶乙酸乙酯洗脱，得到标题产物。
步骤7.6：N-(2-甲基-5-硝基-苯基)-[15N2，13C]胍
将N-(2-甲基-5-硝基-苯基)-[13C，15N2]胍-N，N’-酸叔-丁酯(步骤7.5.445mg，1.13mmol)在1∶1三氟乙酸(9ml)∶二氯甲烷(9ml)中的溶液在RT搅拌1小时。加入2M氢氧化钠(50ml)并将该黄色溶液萃取到乙酸乙酯(3×30ml)中，合并并用水洗涤。将有机相用硫酸钠干燥，过滤并将滤液蒸发，得到黄色油，用正相硅胶快速色谱纯化，用90∶10∶0.5∶0.5二氯甲烷∶甲醇∶水∶乙酸的混合物洗脱，得到标题产物。
步骤7.7：N-(5-氨基-2-甲基-苯基)-[15N2，13C]胍
将包含10％Pd/C(12mg)、N-(2-甲基-5-硝基-苯基)[13C，15N2]胍(步骤7.6，121mg，0.62mmol)在正-丁醇(3ml)中的混合物在1个氢气大气压下、在RT搅拌16小时。加入另外12mg 10％Pd/C并将混合物再搅拌16小时。将混合物用Hyflo(硅藻土)过滤，再用一部分正-丁醇(3×2ml)洗涤，合并并在旋转蒸发器上除去正-丁醇，得到标题产物粗品。