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1、10申请公布号CN104120170A43申请公布日20141029CN104120170A21申请号201310145529822申请日20130424C12Q1/68200601C12Q1/0420060171申请人河北农业大学地址071001河北省保定市灵雨寺街289号72发明人朱杰华杨志辉徐进郭倩倩杨毅清耿硕张维宏崔亚婧74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君54发明名称马铃薯早疫病菌检测试剂盒及检测方法57摘要本发明属于植物病原真菌的种类分子鉴定技术领域，目的是提供一种基于聚合酶链式反应（PCR）技术的简便、快速和准确鉴定马铃薯叶片组织中早疫病菌的检测试剂盒。
2、和检测方法。检测试剂盒包括一对自行设计的专一性PCR引物和MIX，一对引物序列为ASF5CACCTCCCGGGGTGGCCA3，ASR5CCCGCAAGGGGAGACAAA3。检测过程如下提取叶片或菌丝DNA，用专一性引物对ASF和ASR进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳分析是否专一性出现一条358BP条带；通过扩增条带的有无，即可判断供试样品是否为马铃薯早疫病菌。该技术有效解决了马铃薯早疫病田间早期诊断和分离物不产孢而造成的种类难以鉴定的难题，实现了对早疫病的早期诊断和检测，也可用于科研人员对未产孢的早疫病病菌分离物进行分子鉴定提供技术支撑。51INTCL权利要求书1页说明书2页19中华人民共和。
3、国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书2页10申请公布号CN104120170ACN104120170A1/1页21一种马铃薯早疫病菌（茄链格孢）的检测试剂盒，其特征在于试剂盒包括一对特异性引物DNA序列和MIX。2如权利要求1所述的马铃薯早疫病菌（茄链格孢）的检测试剂盒，其特征在于一对特异性引物DNA序列，为ASF5CACCTCCCGGGGTGGCCA3和ASR5CCCGCAAGGGGAGACAAA3。3如权利要求1所述的马铃薯早疫病菌（茄链格孢）的检测试剂盒，其特征在于试剂盒MIX的成分为TAQ酶0105U/L、DATP005010MM、DTTP005010MM、DGTP00。
4、5010MM、DCTP005010MM、MGCL20510MM、KCL100150MM、TRISHCL2025MM,PH9093、1TRITONX100及稳定剂。4如权利要求1所述的马铃薯早疫病菌（茄链格孢）的检测试剂盒，其特征在于试剂盒的检测方法为自待鉴定物上提取基因组DNA，利用自行设计的特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR），扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后呈现专一大小的条带。5如权利要求4所述的马铃薯早疫病菌（茄链格孢）的检测试剂盒检测方法，其特征在于PCR扩增产生的条带长度为358BP。6如权利要求1所述的马铃薯早疫病菌（茄链格孢）的检测试剂盒，其特征在于该方法既可以用于菌丝鉴定，也可用。
5、于早疫病发病早期症状不明显的叶片中早疫病菌的分子鉴定。7如权利要求4所述的马铃薯早疫病菌（茄链格孢）的检测试剂盒，其特征在于利用PCR扩增基因组DNA的检测极限浓度为0515NG/L。8如权利要求4所述的马铃薯早疫病菌（茄链格孢）的检测试剂盒，其特征在于聚合酶链式反应（PCR）的各阶段反应条件为起始变性阶段95、1MIN；变性阶段95、2535S；复性阶段50、2535S；延伸阶段72、2025S；循环次数35个循环；最后延伸阶段72、79MIN。权利要求书CN104120170A1/2页3马铃薯早疫病菌检测试剂盒及检测方法技术领域0001本发明涉及植物病原菌真菌的种类分子鉴定技术领域。背景技。
6、术0002马铃薯早疫病由茄链格孢ALTERNARIASOLANISORAUERELLIS引起，该病害可危害马铃薯叶片、地上茎和地下薯块，属世界性病害，一般年份给马铃薯引起的损失在578之间，严重地区也可造成绝收。马铃薯早疫病的早期诊断对于该病的防控具有重要意义，而早期被早疫病菌侵入的叶片和组织症状发展缓慢，并且不明显，易与其它病害混淆，而从这些被侵染组织中分离获得的早疫病病菌绝大多数不产孢，对其种类很难鉴定，而早疫病病菌体外诱导产孢周期长且工作量大，很难适应对早疫病田间检测和不产孢分离物的种类鉴定的需求。然而，随着近年来测序技术的飞速发展，GENBANK中积累了大量可用于茄链格孢ITS序列，该。
7、序列由于进化速率较快、多拷贝适合于真菌分子鉴定的需要。我们从GENBANK中下载1672条茄链格孢属种类的ITS序列，经过序列比对和分析，设计出了对马铃薯早疫病菌具有专一性的引物对，通过PCR技术可对马铃薯叶片组织中的早疫病菌和未产孢的纯培养分离物进行准确的分子鉴定，发明了一套早疫病菌检测试剂盒。该试剂盒可用于我国农业系统各级植保部门、种薯企业以及马铃薯喷灌圈大种植户对早疫病的早期诊断和检测，也可用于科研人员对未产孢的早疫病病菌分离物进行分子鉴定。发明内容0003本发明的目的是提供一种快速、准确鉴别马铃薯早期感染早疫病的试剂盒和诊断方法，包括一对自主设计的特异性PCR引物对和MIX，以及整套P。
8、CR鉴定程序和步骤。00041本发明的技术方案如下首先从GENBANK中下载了链格孢属的ITS序列1672条，利用BIOEDIT和CLUSTALX软件对其进行序列分析，得到茄链格孢的特征DNA碱基序列，针对茄链格孢与其它种类链格孢DNA序列的差别，设计特异性引物对。通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，根据是否有预期长度358BP相同条带来判定该样品是否被早疫病菌侵染或该菌株是否为早疫病菌，通过比较同批样品条带的明暗也可对其进行含量多少的估计。对需鉴定早疫病标样或菌丝，提取总DNA，在给定的条件下，利用自行设计的专一性引物对ASF和ASR进行PCR扩增，扩增产物在1琼脂糖凝胶上进行电泳，被马铃薯早疫。
9、病菌感染的叶片或未产孢的茄链格孢能扩增出一条长度为358BP的DNA条带，而其他菌及阴性对照均未能扩出预期的条带。当供试样品经本法进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳观察是否有358BP的DNA片段出现，便可准确鉴别琼脂糖凝胶电泳结果。00052本发明设计的用于鉴别马铃薯早期感染早疫病的诊断方法和马铃薯上分离的未产孢茄链格孢分子鉴定方法是采用以下步骤（1）菌丝或带菌叶片DNA的提取；（2）扩增DNA片段，即进行聚合酶链式反应，用于聚合酶链式反应的一对引物的DNA序列为说明书CN104120170A2/2页4ASF5CACCTCCCGGGGTGGCCA3ASR5CCCGCAAGGGGAGACAAA3。
10、（2）琼脂糖凝胶电泳分析；（4）鉴定结果的判断若PCR扩增产物在琼脂糖上出现预期358BP长度的特异性条带，则供测试样品为马铃薯早疫病菌（茄链格孢）；本发明的效果是有效解决了马铃薯早疫病田间早期诊断和分离物不产孢而造成的种类难以鉴定的难题。该方法可为我国农业系统各级植保部门、种薯企业以及马铃薯喷灌圈大种植户对早疫病的早期诊断和检测，也可用于科研人员对未产孢的早疫病病菌分离物进行分子鉴定提供技术支撑。00063具体实施方式（1）试剂盒成分包括引物ASF和ASR（各10M）、MIXTAQ酶0105U/L、DATP005010MM、DTTP005010MM、DGTP005010MM、DCTP0050。
11、10MM、MGCL20510MM、KCL100150MM、TRISHCL2025MM,PH9093、1TRITONX100及稳定剂、DDH2O；（2）DNA的提取早疫病菌的菌丝采用CTAB法进行DNA的提取，田间叶片采用改进的玻璃珠震荡法进行DNA的提取；（3）聚合酶链式反应A聚合酶链式反应以25UL为参考，各种物品的用量分别为模板DNA10L引物ASF10L引物ASR10LMIX125LDDH2O95LBPCR反应条件反应在PCR仪上进行，反应条件为起始变性阶段95、1MIN；变性阶段95、2535S；复性阶段50、2535S；延伸阶段72、2025S；循环次数35个循环；最后延伸阶段72、79MIN，反应结束后在4保存；（4）电泳观察结果用1琼脂糖凝胶（含05G/L的溴化乙锭），在110V电压下电泳3050分钟，观察电泳结果；（5）测定结果的判断，若出现358BP的条带，则为马铃薯早疫病菌（茄链格孢）；若不出现，则不为马铃薯早疫病菌（茄链格孢）。说明书CN104120170A。