斑蝥素人工抗原的制备方法.pdf

本发明公开了一种斑蝥素人工抗原的制备方法。它包括天然斑蝥素与β-丙氨酸的缩合反应，中间产物的结晶纯化，中间产物与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)的偶联几个步骤。本发明步骤简明合理，产品独特新颖，还可以用于斑蝥素完全抗原的制备以及斑蝥素靶向定位抗肿瘤药物的人工合成。

权利要求书
1、  一种斑蝥素人工抗原的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1，N-羧乙基斑蝥酰亚胺的制备及纯化
(1)在烧瓶中加入天然斑蝥素结晶以及β-丙氨酸，二者的摩尔比为1∶1.1～1∶1.4，然后加入10ml～20ml的冰醋酸，在35～40℃水浴4～6小时，蒸去冰乙酸，加入10ml～20ml三乙胺，加装吸湿干燥球，加温至135℃～140℃，反应4～6小时；
(2)反应结束后，蒸去三乙胺，用稀盐酸调反应产物酸碱度为pH 1～2，随后，用乙酸乙酯萃取，保留黄绿色水相，浓缩近干，用甲醇冲洗过滤，滤液浓缩近干，最后用乙酸乙酯重结晶，得精制N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶，其结构式为

步骤2，斑蝥素人工完全抗原制备
(1)取N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶溶解在二氯甲烷中，然后加入NHS、DCC，N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶∶NHS∶DCC的摩尔比为1∶2∶2，混合后室温下搅拌18～24小时，然后进行减压蒸发，蒸发所得残渣用二氯甲烷进行重结晶；
(2)结晶溶解于吡啶中完全溶解形成吡啶溶液；取BSA或OVA溶解在0.03mol/L的磷酸缓冲液中，将N-羧乙基斑蝥酰亚胺吡啶溶液与BSA或OVA磷酸缓冲液混合，其中BSA或OVA与N-羧乙基斑蝥酰亚胺的摩尔比为1∶20～1∶30；在4℃下搅拌反应12～24小时后进行透析、冷冻干燥，得到无色斑蝥素人工完全抗原结晶体。

2、  根据权利要求1所述斑蝥素人工抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤1中天然斑蝥素结晶与β-丙氨酸反应的最优摩尔比为1∶1.2。

3、  根据权利要求1所述斑蝥素人工抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤2中BSA或OVA与N-羧乙基斑蝥酰亚胺的最优摩尔比为1∶25。

说明书斑蝥素人工抗原的制备方法
技术领域
本发明属于小分子有机物人工制备抗原的方法，具体的说，涉及一种斑蝥素人工抗原的制备方法。
背景技术
斑蝥素(canthariding)是部分鞘翅目芫菁科昆虫(俗称斑蝥)合成分泌的一种小分子有毒物质，其化学结构为萜类化合物(C10H12O4)。传统中医药及现代的临床应用研究发现，斑蝥素在治疗癌症和一些疑难杂症方面具有独特的疗效。斑蝥素及其衍生物等对肿瘤细胞中的“斑蝥素结合蛋白”-蛋白磷酸酶2A有着极强的亲和性和专化性，对治疗原发性肝癌疗效显著(郑英兰等，2005；李琦等，2006)，也被用于治疗或辅助治疗乳腺癌、食道癌、肺癌、贲门癌、肠癌、肝硬化、慢性肝炎和神经性皮炎等疾病，同时可用于治疗疥癣、消瘰病等，是日前应用较多的理想的广谱抗癌药和皮肤外用药。此外，斑蝥素还能刺激脾淋巴细胞产生的白细胞介素II增加2-5倍，巨噬细胞产生的白细胞介素I增加1.5-2倍，从而提高机体免疫功能，可以作为抗癌放化疗的辅助用药(Zhang Junping等，1992)。斑蝥的药用机理研究及其资源的开发利用日益受到人们的重视。在我国，以斑蝥素为主要成分的抗癌药物已经有10种以上，如奇宁片(斑蝥酸钠片)、奇宁注射液、得力生注射液、艾康注射液(斑蝥酸钠+维生素B6)、依尔康注射液(去甲斑蝥酸钠注射液)、甲基斑蝥素片、去甲斑蝥素片、甲基斑蝥胺片、复方斑蝥胶囊等。其中，复方斑蝥胶囊对一些恶性肿瘤有良好的治疗效果，该药既可提高患者免疫能力，激活抑癌基因，又能杀死癌细胞，有着双重作用，2002年国家药监局将其评选为通用治癌药物。同时也是国家中药保护品种。
生物活性小分子由于不具备完全抗原性，因此不能直接采用免疫方法检测。目前，对于小分子生物活性物质的检测主要使用气相色谱、液相色谱等方法，斑蝥素的分析鉴定目前主要用气相色谱等方法。这些方法都只能检测游离状态的斑蝥素，而且需要专门的设备。在斑蝥素的生物合成研究、药物中斑蝥素成分鉴定、产斑蝥素昆虫的选育等方面常常需要快速简便的方法，有时还需要对组织细胞内的斑蝥素进行原位检测。采用免疫学方法检测则有着快速、灵敏、特别是能够进行原位检测的优点，但斑蝥素人工抗原的制备迄今未见有文献记载。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以天然斑蝥素为抗原决定簇，以β-丙氨酸为连接臂，将斑蝥素与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)经缩合、偶联、结晶而得斑蝥素人工完全抗原的制备方法。
本发明的技术方案如下：使天然斑蝥素与β-丙氨酸进行缩合反应，将中间产物的提取结晶纯化，中间产物再与载体蛋白偶联等步骤制得具有免疫原性的完全抗原。
本发明是这样实现的：
步骤1，N-羧乙基斑蝥酰亚胺的制备及纯化，
(1)在双口烧瓶中加入天然斑蝥素结晶以及β-丙氨酸，摩尔比为1∶1.1～1∶1.4，加入10ml～20ml冰醋酸使之能将上述反应后物质溶解，促进天然斑蝥素结晶与β-丙氨酸反应，装上冷凝管，温度计，35～40℃水浴4～6小时。然后蒸去冰乙酸，加入10ml～20ml三乙胺少量作为催化剂和反应物，使之将上述反应后物质溶解，同时加装吸湿干燥球，升温到135℃～140℃反应4～6小时。反应过程如下：

(2)反应结束后，蒸去三乙胺，用稀盐酸调酸碱度为pH 1～2，随后，用乙酸乙酯萃取，可根据情况萃取多次，保留黄绿色水相，浓缩近干；用甲醇冲洗，过滤，滤液浓缩近干，最后用乙酸乙酯重结晶，得精制N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶其结构式为
(3)取N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶溶解在二氯甲烷中，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，摩尔比为1∶2∶2，混合后室温下搅拌反应18～24小时后进行减压蒸发，所得浓缩物用二氯甲烷进行重结晶。结晶溶解于少量吡啶中将结晶完全溶解形成吡啶溶液；取BSA(牛血清白蛋白)或OVA(卵清白蛋白)溶解在0.03mol/L的磷酸缓冲液中，其中BSA或OVA与N-羧乙基斑蝥酰亚胺的摩尔比为1∶20～1∶30；将N-羧乙基斑蝥酰亚胺吡啶溶液与BSA或OVA磷酸缓冲液混合，混合液在4℃下搅拌反应12～24小时后进行透析、冷冻干燥，得斑蝥素人工完全抗原。
步骤2，N-羧乙基斑蝥酰亚胺的检测：
(1)紫外波谱分析鉴定
用蒸馏水作为溶剂，对β-丙氨酸和缩合产物作紫外全波长扫描(斑蝥素不溶于水)，得出缩合产物与β-丙氨酸的紫外吸收图谱。经测定，β-丙氨酸(Ala)的λmax为214nm，缩合产物(产物)的λmax是245.5nm，即β-丙氨酸在引入斑蝥酰基后吸收波发生了明显的红移。
(2)核磁共振验证
用BrukerAvance500NMR核磁共振仪测定缩合物的碳谱(D2O为溶剂，500MHz，常温)，从缩合产物的13C-NMR图谱可以得出8种不同化学环境的碳，其δ(ppm)分别为：8.449(q，-CH3)；11.579(t，-CH2-)；23.286(t，-CH2-)；35.910(t，-CH2-)；46.787(d，)；54.245(s，)；163.782(s，)；183.959(s，-COOH)。与N-羧乙基斑蝥酰亚胺结构在ChemDraw程序计算机模拟中13C-NMR各碳的预测值基本符合。由此可见，该缩合产物即为N-羧乙基斑蝥酰亚胺。
有益效果：本发明具有方法合理、简单实用、安全性好，制备的抗原成品性质稳定，免疫性强等优点。本发明还可用于斑蝥素抗体的制备以及斑蝥素靶向定位的应用。
附图说明
图1是缩合产物与β-丙氨酸的紫外吸收图谱；
图2是缩合产物的13C-NMR图谱。
具体实施方式
实施例一、
(1)在双口烧瓶中加入天然斑蝥素结晶70.6mg以及β-丙氨酸37.6mg，然后加入10ml的冰醋酸，装上冷凝管，温度计，35℃水浴6小时。蒸去冰乙酸，加入三乙胺20ml，升温至135℃反应5小时。
(2)反应结束后，蒸去三乙胺，用稀盐酸调pH至1.5，随后，用乙酸乙酯萃取一次，保留黄绿色水相，浓缩近干，用甲醇冲洗，过滤，滤液浓缩近干，最后用乙酸乙酯重结晶，得精制N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶体。
(3)取N-羧乙基斑蝥酰亚胺95.8mg溶解在二氯甲烷中，依次加入NHS82.8mg、DCC 148.5mg，混合后室温下搅拌20小时后进行减压蒸发，将浓缩物用二氯甲烷进行重结晶。结晶溶解于2毫升吡啶中形成吡啶溶液；取BSA 792mg溶解在20ml 0.03mol/L的磷酸缓冲液中，将N-羧乙基斑蝥酰亚胺吡啶溶液与BSA磷酸缓冲液混合，在4℃下搅拌反应24小时后进行透析、冷冻干燥，得斑蝥素人工完全抗原。
用蒸馏水作为溶剂，对β-丙氨酸和缩合产物作紫外全波长扫描(斑蝥素不溶于水)，得出缩合产物与β-丙氨酸的紫外吸收图谱。经测定，(参见图1)β-丙氨酸(Ala)的λmax为214nm，缩合产物(产物)的λmax是245.5nm，即β-丙氨酸在引入斑蝥酰基后吸收波发生了明显的红移。
用Bruker Avance500NMR核磁共振仪测定缩合物的碳谱(D2O为溶剂，500MHz，常温)，(参见图2)从缩合产物的13C-NMR图谱可以得出8种不同化学环境的碳，其δ(ppm)分别为：8.449(q，-CH3)；11.579(t，-CH2-)；23.286(t，-CH2-)；35.910(t，-CH2-)；46.787(d，)；54.245(s，)；163.782(s，)；183.959(s，-COOH)。与N-羧乙基斑蝥酰亚胺结构在ChemDraw程序计算机模拟中13C-NMR各碳的预测值基本符合。由此可见，该缩合产物即为N-羧乙基斑蝥酰亚胺。
实施例二、
(1)在双口烧瓶中加入斑蝥素结晶75.2mg以及β-丙氨酸37.6mg，然后加入20ml的冰醋酸，装上冷凝管，温度计，40℃水浴4.5小时。蒸去冰乙酸，加入三乙胺10ml，升温至135℃反应6小时。
(2)反应结束后，蒸去三乙胺，用稀盐酸调pH至2.0，随后，用乙酸乙酯萃取三次，保留黄绿色水相，浓缩近干，用甲醇冲洗，过滤，滤液浓缩近干，最后用乙酸乙酯重结晶，得精制N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶体。
(3)取N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶95.8mg溶解在二氯甲烷中，依次加入NHS82.8mg、DCC 148.5mg，室温搅拌反应24小时后进行减压蒸发，将浓缩物用二氯甲烷进行重结晶。结晶溶解于少量吡啶中形成吡啶溶液；取卵清白蛋白(OVA)365mg溶解在0.03mol/L的磷酸缓冲液20ml中，将N-羧乙基斑蝥酰亚胺吡啶溶液与OVA磷酸缓冲液混合，在4℃下搅拌反应16小时后进行透析、冷冻干燥，得斑蝥素人工完全抗原。
用蒸馏水作为溶剂，对β-丙氨酸和缩合产物作紫外全波长扫描(斑蝥素不溶于水)，得出缩合产物与β-丙氨酸的紫外吸收图谱。经测定，(参见图1)β-丙氨酸(Ala)的λmax为214nm，缩合产物(产物)的λmax是245.5nm，即β-丙氨酸在引入斑蝥酰基后吸收波发生了明显的红移。
用Bruker Avance500NMR核磁共振仪测定缩合物的碳谱(D2O为溶剂，500MHz，常温)，(参见图2)从缩合产物的13C-NMR图谱可以得出8种不同化学环境的碳，其δ(ppm)分别为：8.449(q，-CH3)；11.579(t，-CH2-)；23.286(t，-CH2-)；35.910(t，-CH2-)；46.787(d，)；54.245(s，)；163.782(s，)；183.959(s，-COOH)。与N-羧乙基斑蝥酰亚胺结构在ChemDraw程序计算机模拟中13C-NMR各碳的预测值基本符合。由此可见，该缩合产物即为N-羧乙基斑蝥酰亚胺。
实施例三、
(1)在双口烧瓶中加入斑蝥素结晶68.6mg以及β-丙氨酸40.5mg，然后加入15ml的冰醋酸，装上冷凝管，温度计，40℃水浴5小时。蒸去冰乙酸，加入三乙胺15ml，升温至140℃反应4小时。
(2)反应结束后，蒸去三乙胺，用稀盐酸调pH至2.0，随后，用乙酸乙酯萃取五次，保留黄绿色水相，浓缩近干，用甲醇冲洗，过滤，滤液浓缩近干，最后用乙酸乙酯重结晶，得精制N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶体。
(3)取N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶95.8mg溶解在二氯甲烷中，依次加入NHS82.8mg、DCC 148.5mg，室温搅拌反应18小时后进行减压蒸发，将浓缩物用二氯甲烷进行重结晶。结晶溶解于少量吡啶中形成吡啶溶液；取卵清白蛋白(OVA)400mg溶解在0.03mol/L的磷酸缓冲液20ml中，将N-羧乙基斑蝥酰亚胺吡啶溶液与OVA磷酸缓冲液混合，在4℃下搅拌反应16小时后进行透析、冷冻干燥，得斑蝥素人工抗原。
用蒸馏水作为溶剂，对β-丙氨酸和缩合产物作紫外全波长扫描(斑蝥素不溶于水)，得出缩合产物与β-丙氨酸的紫外吸收图谱。经测定，(参见图1)β-丙氨酸(Ala)的λmax为214nm，缩合产物(产物)的λmax是245.5nm，即β-丙氨酸在引入斑蝥酰基后吸收波发生了明显的红移。
用Bruker Avance500NMR核磁共振仪测定缩合物的碳谱(D2O为溶剂，500MHz，常温)，(参见图2)从缩合产物的13C-NMR图谱可以得出8种不同化学环境的碳，其δ(ppm)分别为：8.449(q，-CH3)；11.579(t，-CH2-)；23.286(t，-CH2-)；35.910(t，-CH2-)；46.787(d，)；54.245(s，)；163.782(s，)；183.959(s，-COOH)。与N-羧乙基斑蝥酰亚胺结构在ChemDraw程序计算机模拟中13C-NMR各碳的预测值基本符合。由此可见，该缩合产物即为N-羧乙基斑蝥酰亚胺。
实施例四、
(1)在双口烧瓶中加入斑蝥素结晶68.6mg以及β-丙氨酸43.6mg，然后加入15ml的冰醋酸，装上冷凝管，温度计，38℃水浴6小时。蒸去冰乙酸，加入三乙胺20ml，升温至138℃反应5小时。
(2)反应结束后，蒸去三乙胺，用稀盐酸调pH至1.8，随后，用乙酸乙酯萃取三次，保留黄绿色水相，浓缩近干，用甲醇冲洗，过滤，滤液浓缩近干，最后用乙酸乙酯重结晶，得精制N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶体。
(3)取N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶95.8mg溶解在二氯甲烷中，依次加入NHS82.8mg、DCC 148.5mg，室温搅拌反应22小时后进行减压蒸发。将浓缩物用二氯甲烷进行重结晶。结晶溶解于少量吡啶中形成吡啶溶液；取BSA 820mg溶解在0.03mol/L磷酸缓冲液20ml中，将N-羧乙基斑蝥酰亚胺吡啶溶液与BSA磷酸缓冲液混合，在4℃下搅拌反应18小时后进行透析、冷冻干燥，得斑蝥素人工完全抗原。
用蒸馏水作为溶剂，对β-丙氨酸和缩合产物作紫外全波长扫描(斑蝥素不溶于水)，得出缩合产物与β-丙氨酸的紫外吸收图谱。经测定，(参见图1)β-丙氨酸(Ala)的λmax为214nm，缩合产物(产物)的λmax是245.5nm，即β-丙氨酸在引入斑蝥酰基后吸收波发生了明显的红移。
用BrukerAvance500NMR核磁共振仪测定缩合物的碳谱(D2O为溶剂，500MHz，常温)，(参见图2)从缩合产物的13C-NMR图谱可以得出8种不同化学环境的碳，其δ(ppm)分别为：8.449(q，-CH3)；11.579(t，-CH2-)；23.286(t，-CH2-)；35.910(t，-CH2-)；46.787(d，)；54.245(s，)；163.782(s，)；183.959(s，-COOH)。与N-羧乙基斑蝥酰亚胺结构在ChemDraw程序计算机模拟中13C-NMR各碳的预测值基本符合。由此可见，该缩合产物即为N-羧乙基斑蝥酰亚胺。