钌和铱金属配合物单线态氧荧光探针的制备及其应用.pdf

本发明公开了一类钌和铱金属配合物单线态氧荧光探针的制备及其应用。这类配合物以过渡金属为钌或铱为中心离子，以蒽环衍生物为配体，在溶液中与单线态氧反应前后荧光性能发生较大的变化，利用其荧光信号的变化可实现溶液中单线态氧的检测，而且这类配合物用于检测单线态氧具有可见光激发、选择性好、灵敏度高、检测手段简单等优点，适于中性和碱性体系中单线态氧的测定。

1.  一种含有蒽环衍生物配体的钌或铱配合物，其结构通式为[MA_mL_n]X_k，其中：M为Ru或Ir；X为抗衡阴离子；L为蒽环衍生物配体，其结构式如式I所示：

式I中R₁和R₂独立为氢或C1～C22的直链或支链烷基；当M为Ir时，A为C＾N配体，m＝2，n＝1，k＝1；当M为Ru时，A为N＾N》配体，m＝0或2，n＝1或3，且m+n＝3，k＝2。

2.  如权利要求1所述的配合物，其特征在于，所述C＾N配体是2-苯基吡啶或7，8-苯并喹啉。

3.  如权利要求1所述的配合物，其特征在于，所述N＾N配体是联吡啶或邻菲咯啉。

4.  如权利要求1所述的配合物，其特征在于，所述R₁和R₂为氢或C1～C6的直链或支链烷基；所述抗衡阴离子为负一价离子，选自Cl^-、ClO₄^-、PF₆^-、NO₃^-、CF₃SO₃^-和BF₄^-中的一种。

5.  如权利要求1所述的配合物，是下列配合物1a、1b、2a、2b和2c之一：


6.  铱配合物(C＾N)₂Ir(L)X的制备方法，包括下列步骤：
1)将C＾N配体和IrCl₃·3H₂O在溶剂中加热至120-160℃反应得到二氯桥配合物(C＾N)₄Ir₂Cl₂；
2)二氯桥配合物(C＾N)₄Ir₂Cl₂与配体L在溶剂中加热至50-80℃进行配位反应，当X≠Cl^-时，还需冷却后加入抗衡阴离子X搅拌一定时间，其中L为蒽环衍生物配体，其结构式如式I所示：

式I中R₁和R₂独立为氢或C1～C22的直链或支链烷基；
3)柱层析分离纯化得到所述的铱配合物。

7.  钌配合物(N＾N)_mRu(L)_nX₂的制备方法，将(N＾N)_m RuCl_(3-m/2)与配体L在溶剂中加热至80—180℃进行配位反应，当X≠Cl^-时需冷却后加入抗衡阴离子X搅拌一定时间，最后用柱层析分离纯化或重结晶提纯得到所述钌配合物，其中L为蒽环衍生物配体，其结构式如式I所示：

式I中R₁和R₂独立为氢或C1～C22的直链或支链烷基。

8.  权利要求1所述的配合物作为单线态氧荧光探针的用途。

9.  如权利要求8所述的用途，其特征在于，利用所述配合物测定中性或碱性待测溶液中的单线态氧的含量，包括以下步骤：
1)在已知的能有效的产生单线态氧的中性或碱性体系中加入权利要求1所述的配合物，在一系列的单线态氧浓度条件下，通过可见光激发测定体系的荧光强度和吸光度，得到相对应的荧光量子效率，获得荧光量子效率相对于单线态氧浓度的标准曲线；
2)在含所述配合物的中性或碱性缓冲溶液中加入一定量的待测溶液，通过可见光激发测定其荧光强度和吸光度，得到其荧光量子效率；
3)根据步骤2)测得的荧光量子效率的值和步骤1)获得的标准曲线，确定待测溶液中单线态氧的含量。

10.  如权利要求9所述的用途，其特征在于：所述步骤1)和2)中荧光量子效率可通过如下公式计算得到：
φ_s＝φ_std(A_std/A_s)(I_s/I_std)(η_s/η_std)²
其中，下标s和std分别表示待测体系和标准物质，φ为荧光量子效率，A为激发波长处的吸光度，I为发射的荧光强度，η为溶液的折光率。

钌和铱金属配合物单线态氧荧光探针的制备及其应用
技术领域
本发明涉及溶液中单线态氧(¹O₂)的测定，具体地说是一类含有蒽环衍生物配体的钌和铱金属配合物单线态氧荧光探针的制备及其应用。
背景技术
单线态氧是氧分子处于高能激发态的一种不稳定的存在形式，单线态氧作为有机化学中一种珍贵试剂，在许多光化学和光生物反应，如光降解、污染物的光转化、化学发光、生物体氧化老化、甚至是光致癌作用等过程中，都扮演着十分重要的角色。在有机合成中，单线态氧使得在高度立体专一的有机化合物中引入氧变得极为容易。在生物体系中，单线态氧对生命体系有着重大的影响，单线态的生理学氧化作用越来越受到研究者的关注。单线态氧在细胞损伤和凋亡中起着重要的作用，它可能造成对机体的强氧化性损伤，从而引起机体脂质过氧化作用的发生，导致生物膜、小动脉、DNA、蛋白质和中枢神经系统的损伤，加快机体的衰老和死亡，因此被认为是体内重要的毒性物种，引发与氧化损伤有关的疾病，如白内障、肺水肿、糖尿病、肌肉萎缩、营养缺乏、精神病和肿瘤萌生等[(a)K.Briviba，L O.Klotz，H.Sies，Toxic and signaling effects of photochemically or chemically generatedsinglet oxygen in biological systems，Biol.Chem.，1997，378，1259.b)J.R.Wagner，P.A.Motchnik，R.Stocker，H.Sies，B.N.Ames，The oxidation of blood plasma and low densitylipoprotein components by chemically generated singlet oxygen，J.Biol.Chem.，1993，268，18502.]。单线态氧在细胞的增生、分化、凋亡等调控中也起重要作用，被认为是一种新的第二信使[(a)R.W.Redmond，I.E.Kochevar，Spatially resolved cellular responses to singletoxygen，Photochem.Photobiol.，2006，82(5)，1178-1186.(b)N.L.Oleinick，R.L.Morris，I.Belichenko，The role of apoptosis in response to photodynamic therapy：what，where，why，andhow，Photochem.Photobiol.Sci.，2002，1，1-21.]。相反，人们也可以利用单线态氧的强氧化性质去杀死恶性肿瘤细胞或组织，达到治愈癌症的目的。实验发现，当恶性肿瘤细胞获取并结合单线态氧敏化剂药物的能力显著大于正常组织时，通过光照后，药物分子产生的单线态氧就能选择性地杀死肿瘤细胞。医学上用亚甲基蓝光敏法产生的单线态氧来对血浆消毒和肿瘤的光动力学诊断，这种光动力学治疗技术在肿瘤的诊断和治疗中具有广泛的应用前景。单线态氧与人类健康和疾病密切相关，是当前生命科学和化学科学交叉研究的热点。
由于单线态氧在光化学和光生物过程中具有如此重要的地位，¹O₂检测倍受关注，特别是生物体系中¹O₂的检测越来越引起科研工作者的关注。研发高灵敏度和选择性好的单线态氧的小分子荧光探针具有重要意义，它能实时地给出单线态氧靶向细胞体系内生物大分子的重要空间分布信息，能够适时准确地检测体内单线态氧的含量，对于某些疾病的预防、诊断以及病理的研究都有十分重要的指导意义[K.Tanaka，T.Miura，N.Umezawa，Y.Urano，K.Kikuchi，T.Higuchi，T.Nagano，Rational design of fluorescein-based fluorescenceprobes，Mechanism-based design of a maximum fluorescence probefor singlet oxygen，J.Am.Chgm.Soc.，2001，123(11)，2530.]。目前已报道的用于检测单线态氧的方法主要有以下几种：(1)磷光光度法，检测单线态氧的标准方法，利用单线态氧自身淬灭在1268nm处产生的近红外磷光进行检测，此法对生物体无侵害，选择性高，但灵敏度低、检出信号弱、无法用于很低浓度¹O₂的检测[K.Andersen，Z.Cao，P.R.Ogilby，L Poulsen，I.Zebger，J.Phys.Chem.A.2002，106，8488.]。(2)化学捕获吸光光度法，利用9，10-二苯基蒽(DPA)与¹O₂的特征性反应生成稳定的内过氧化物引起DPA吸收光谱的变化，通过检测DPA吸收光谱的变化来测量¹O₂，此法选择性好，灵敏度虽比1268nm磷光探测高得多[M.J.Steinbeck，A.U.Khan，M.J.Karnovsky，Extracellular production of singlet oxygen by stimulatedmacrophages quantified using 9，10-diphenylanthracene and perylene in a polystyrene film，J.Biol.Chem.，1993，268(21)，15649.]，但此法是基于吸收光谱，所以灵敏度仍然较低。(3)有机荧光探针法，利用荧光信号为检出手段的有机荧光探针法包括两类：(a)利用¹O₂与带有蒽环的荧光素类探针分子专一性反应，使得探针由原来的非荧光性分子变为强荧光性分子，从而用于¹O₂的检测(N.Umezawa，K.Tanaka，Y.Urano，K.Kikuchi，T.Higuchi，T.Nagano，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1999，38，2899；K.Tanaka，T.Miura，N.Umezawa，Y.Urano，K.Kikuchi，T.Higuchi，T.Nagano，J.Am.Chem.Soc.2001，123，2530.)。该方法检测时间短，灵敏度高，但不适用于低pH值环境和实时检测。(b)利用荧光探针分子间的能量传递，激发探针分子发出强的迟滞荧光，进而用于检测¹O₂(A.A.Krasnovskii，C.Schweitzer，H.Leismann，C.Tanielian，E.A.Luk’yanets，Quantum Electron.，2000，30，445；A.A.Krasnovskii，M.E.Bashtanov，N.N.Drozdova，O.A.Yuzhakova，E.A.Luk’yanets，QuantumElectron.，2002，32，83.)。这类探针主要有酞菁染料和紫菜嗪衍生物等，当接收到单线态氧的能量后能在700nm附近发出荧光用于检测。(4)化学发光探针法，这是一类基于光诱导电子转移机理的单线态氧荧光探针(X.H.Li，G.X.Zhang，H.M.Ma，D.Q.Zhang，J.Li，D.B.Zhu，J.Am.Chem.Soc.2004，126，11543.)，这类探针检测速度快且具有很高的灵敏度和很好的选择性，但水溶性差，不利于生物体系¹O₂的测定。(5)稀土荧光探针，袁景利小组基于稀土荧光配合物的长寿命荧光特征，制备了一系列稀土荧光探针，利用时间分辨荧光检测技术测定单线态氧已取得较好的效果(袁景利，宋波，王桂兰，谭明乾，一种基于铕配合物的单线态氧荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号200510130851.9；袁景利，宋波，王桂兰，一种单线态氧铕配合物荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号：200510045768.1；袁景利，宋波，王桂兰，一种铽配合物单线态氧荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号200510045767.7)，这类配合物的激发波长处于紫外区，测定¹O₂时，对生物体系有损伤(B.Song.G.L.Wang.M.Q.Tan.J.L.Yuan.New J.Chem.2005，29，1431.)。最近报道了一个铼(I)配合物的单线态氧荧光探针(Y.J.Liu，K.Z.Wang，Eur.J.Inorg.Chem.，2008，5214.)。该配合物虽可在可见光激发下检测单线态氧，但无单线态氧存在时该配合物表现出较大的背景荧光，且水溶性、单线态氧的检测灵敏度与选择性仍需进一步改进。因此制备具有灵敏度高、选择性好，适用范围广，可见光激发的单线态氧荧光探针具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是开发可见光激发，背景荧光低，选择性好，灵敏度高的新型¹O₂荧光探针。
本发明的技术方案如下：
一种含有蒽环衍生物配体的钌或铱配合物，其结构通式为[MA_mL_n]X_k，其中：M为钌(Ru)或铱(Ir)；X为抗衡阴离子；L为蒽环衍生物配体，其结构式如式I所示：

式中R₁为氢或C1～C22的直链或支链烷基；R₂为氢或C1～C22的直链或支链烷基；当M为Ir时，A为C^N配体(例如2-苯基吡啶(ppy)或7，8-苯并喹啉)，m＝2，n＝1，k＝1，即(C^N)₂Ir(L)X；当M为Ru时，A为N^N配体(例如联吡啶(bpy)或邻菲咯啉)，m＝0或2，n＝1或3，且m+n＝3，k＝2，即Ru(L)₃X和(N^N)₂Ru(L)X₂。

ppy      7，8-苯并喹啉           bpy          邻菲咯啉
上述R₁和R₂优选氢或C1～C6的直链或支链烷基，所述烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基。上述抗衡阴离子多为负一价的离子，例如Cl^-、ClO₄^-、PF₆^-、NO₃^-、CF₃SO₃^-、BF₄^-。
本发明的配合物的具体例子例如：
当M为铱，A为ppy，L为2-(9-蒽基)-1H-咪唑[4，5-f][1，10]菲咯啉(aip)或2-(9-蒽基)-1-乙基-1H-咪唑[4，5-f][1，10]菲咯啉(aeip)，m＝2，n＝1，X＝PF₆^-时，k＝1，该配合物的结构如下式1a或1b所示：

当M为钌，A为bpy，L为aeip，m＝2，n＝1，X＝Cl^-时，k＝2，该配合物的结构如下式2a所示：

当M为钌，L为aip或aeip，m＝0，n＝3，X＝PF₆^-时，k＝2，该配合物的结构如下式2b或2c所示：

上述铱配合物(C^N)₂Ir(L)X可通过下述方法制备得到的：
1)将C^N配体和IrCl₃·3H₂O在溶剂中加热至120-160℃反应得到二氯桥配合物(C^N)₄Ir₂Cl₂；
2)二氯桥配合物(C^N)₄Ir₂Cl₂与配体L在溶剂中加热至50-80℃进行配位反应，当X≠Cl^-时，还需冷却后进一步加入抗衡阴离子X搅拌反应一定时间；
3)柱层析分离纯化得到所述铱配合物。
上述步骤1)通常是将反应物在氮气保护下于溶剂中回流反应18—30小时，所用溶剂例如乙二醇单乙醚和水的混合溶液(乙二醇单乙醚和水的体积比以3:1为佳)，反应时间以24小时为最佳，得到的二氯桥配合物(C^N)₄Ir₂Cl₂粗产品再经乙醚和水洗涤后备用。
上述步骤2)通常是在氮气保护下于溶剂中回流4—12小时，所用溶剂例如二氯甲烷和甲醇(两种溶剂体积比以2:1为佳)的混合溶液中，反应时间一般为8小时，冷至室温后加含有抗衡离子的盐进行搅拌反应。
上述步骤3)的柱层析一般采用硅胶或氧化铝柱层析。
上述钌配合物(N^N)_mRu(L)_nX₂的制备方法是：首先将(N^N)_mRuCl_(3-m/2)与配体L在溶剂中加热至80—180℃进行配位反应，当X≠Cl^-时还需反应后冷却并加入抗衡阴离子搅拌一定时间，最后用柱层析分离纯化或重结晶提纯得到所述钌配合物。
(N^N)_mRuCl_(3-m/2)与配体L通常是在氮气保护下于溶剂中回流反应4-12小时，所用溶剂例如乙二醇、乙醇、DMF、乙腈等，反应时间一般为8小时，反应结束后，当X≠Cl^-时还需冷却后加入抗衡阴离子X搅拌反应一定时间，粗产品再经柱层析(硅胶或氧化铝柱)或重结晶提纯。
本发明的以过渡金属钌或铱为中心离子，以蒽环衍生物为配体的配合物具有单线态氧荧光探针的性能，适用于中性和碱性体系中¹O₂的定性和/或定量测定。
该Ru或Ir为中心离子的单线态氧荧光探针的应用过程为：在中性或碱性溶液中，利用所述的配合物作为荧光探针捕获体系中的¹O₂并与单线态氧作用生成所述配合物的内过氧化物，体系的荧光强度显著增强，通过可见光激发的荧光测定法可以检测体系中的¹O₂。
具体步骤是：
1.在已知的能有效的产生单线态氧的中性或碱性体系中加入本发明的配合物，在一系列的单线态氧浓度条件下，通过可见光激发测定体系的荧光强度和吸光度，得到相对应的荧光量子效率，获得荧光量子效率相对于单线态氧浓度的标准曲线；
2.在含所述配合物的中性或碱性缓冲溶液中加入一定量的待测溶液，通过可见光激发测定体系的荧光强度和吸光度，计算得到其荧光量子效率；
3.根据步骤2测得的荧光量子效率的值，通过步骤1获得的标准曲线确定待测溶液中含有的单线态氧的量。
上述步骤1和2中荧光量子效率可通过如下公式计算得出：
φ_s＝φ_std(A_std/A_s)(I_s/I_std)(η_s/η_std)²
其中，下标s和std分别表示待测体系和标准物质，φ为荧光量子效率，A为激发波长处的吸光度，I为发射的荧光强度，η为溶液的折光率。以[Ru(bpy)₃]²⁺为标准物质，其水溶液的荧光量子效率是φ_std＝0.028，在A_std、I_std、η_std和η_s已知的情况下，通过测定待测体系在激发波长处的吸光度A_s和荧光强度I_s，即可计算得到其荧光量子效率φ_s。
本发明在已报道的单线态氧检测方法的基础上设计合成了一系列本底荧光弱，可见光激发，且与单线态氧反应后生成其内过氧化物荧光强度增强幅度大的单线态氧荧光探针。
本发明的荧光探针具有如下优点：
1.适用于中性和碱性体系中¹O₂的测定。
2.具有较高的单线态氧检测灵敏度，最低检测下限可达9.9nM。
3.具有较好的选择性，其它活性氧物种(H₂O₂，·OH，ONOO^-)引起体系荧光信号增强的幅度很小。
4.与¹O₂作用后荧光强度增强因子大，最高可达65倍，量子效率增强可达100倍。
附图说明
图1示意了在中性和碱性体系中单线态氧对配合物Ru(aeip)₃(PF₆)₂(9.6897×10^-6M)吸收光谱的影响，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液中的吸收光谱的变化；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的吸收光谱的变化。
图2示意了在中性和碱性体系中单线态氧对配合物Ru(aeip)₃(PF₆)₂(9.6897×10^-6M)荧光光谱的影响，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液中的荧光光谱的变化；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的荧光光谱的变化。
图3示意了在中性和碱性体系中的配合物Ru(aeip)₃(PF₆)₂(9.6897×10^-6M)的荧光强度与体系中单线态氧浓度之间的关系，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光强度之间的关系；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸盐缓冲溶液中的单线态氧浓度与体系荧光强度之间的关系。
图4示意了在中性和碱性体系中的配合物Ru(aeip)₃(PF₆)₂(9.6897×10^-6M)的荧光量子效率与单线态氧浓度之间的关系，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液中；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸盐缓冲溶液中。
图5示意了中性和碱性体系中配合物Ru(aeip)₃(PF₆)₂(9.6897×10^-6M)与活性氧物种([ROS]＝30mM)的作用，其中：(a)是在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液中；(b)是在pH＝9.95的0.1M碳酸盐缓冲溶液中。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步说明。
实施例一、配体aeip的合成：
在氮气保护下，用无水正己烷洗去NaH 52mg(含量约50％)中的矿物油，aip(358.2mg，0.9mmol)[M.Mariappan，B.G.Maiya，Eur.J.Inorg.Chem.2005，2164-2173.]，10ml DMF，100℃加热，反应1小时，停止加热冷至室温，加入溴乙烷24.6mg(0.22mmol)，继续在100～110℃反应24小时，冷至室温，过滤，将滤液蒸干后溶于二氯甲烷，再过滤除去不溶物，粗产品用硅胶柱层析，二氯甲烷甲醇(20:1，v/v)淋洗得到产品。产率40％。核磁分析：¹H NMR(δ_H，ppm，500MHz，d₆-DMSO)：9.11～9.15(m，2H)；8.89～8.97(m，3H)；8.29(d，J＝8.5Hz，2H)；7.63～7.85(m，2H)；7.62(t，J＝6.7Hz，2H)；7.49～7.54(m，4H)；4.28～4.32(m，2H)；1.18(t，J＝7Hz，3H).元素分析：C₂₉H₂₀N₄·0.25H₂O：计算值：C，81.25；H，4.82；N，13.06.测定值：C，81.41；H，4.54；N，12.08.
实施例二、(ppy)₂Ir(aip)PF₆，(ppy)₂Ir(aeip)PF₆的合成：
在氮气保护下，将IrCl₃·3H₂O(0.75mmol，116.4mg)和2-苯基吡啶(Hppy)(0.3mmol，97.68mg)，10ml乙二醇单乙醚和3ml三次水加入到三口烧瓶中，加热至回流反应24小时。冷却至室温，过滤得到固体，依次用水、乙醚洗，得到黄色固体产物。即铱二氯桥化合物(ppy)₂Ir(μ-Cl)₂Ir(ppy)₂。二氯桥化合物(0.05mmol)和配体(aip或者aeip)(0.1mmol)，二氯甲烷12ml和甲醇6ml在氮气保护下反应6小时，冷至室温加入5倍当量的NH₄PF₆搅拌2小时，减压蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，过滤除去不溶物，滤液减压蒸馏除去二氯甲烷，所得固体用硅胶柱层析，丙酮二氯甲烷(1:80，v/v)淋洗得到产品。产率分别为：68％；65％。
(ppy)₂Ir(aip)PF₆核磁分析：¹H NMR(δ_H，ppm，500MHz，d₆-DMSO)：8.98(s，2H)；8.31(d，J＝8.26Hz，4H)；8.21(s，2H)；8.11(t，J＝3.01Hz，2H)；7.99(t，J＝7.69Hz，4H)；7.81(d，J＝8.67Hz，2H)；7.61(m，6H)；7.06(m，6H)；6.35(d，J＝7.44Hz，2H).元素分析：C₄₉H₃₂N₆PF₆Ir·C₄H₁₄O₂计算值：C，56.03；H，4.08；N，7.40.测定值：C，56.03；H，4.104；N，7.384.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱：m/Z＝897，([M-PF₆^-]⁺)
(Ppy)₂Ir(aeip)PF₆核磁分析：¹H NMR(δ_H，ppm，500MHz，d₆-DMSO)：9.23(t，J＝9.4Hz，2H)；9.02(s，1H)，8.32(m，6H)；8.11(dd，J₁＝16Hz，J₂＝2.5Hz，2H)；7.96(dd，J₁＝8Hz，J₂＝8Hz，4H)；7.52(m，8H)；7.08(t，4H)；6.99(d，J＝7.5Hz，2H)；6.34(t，2H)；4.37(m，2H)；1.20(t，3H).基质辅助激光解析电离飞行时间质谱：m/Z＝926.2，(M+H⁺).元素分析：C₅₁H₃₆N₆PF₆Ir计算值：C，57.24；H，3.39；N 7.85.测定值：C，56.98；H，3.33；N，7.61.
实施例三、Ru(bpy)₂(aeip)Cl₂的合成：
在氮气保护下，将aeip(84.9mg，0.2mmol)，Ru(bpy)₂Cl₂·2H₂O(104.1mg，0.2mmol)，10ml乙二醇溶液在140℃反应6小时。冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，固体甲醇溶解然后加入二氧六环析出油状物，倾出溶剂，油状物用乙醇溶解，氧化铝柱层析，二氯甲烷甲醇(20:1，v/v)淋洗得到产品，产率：45％。核磁分析：¹H NMR(δ_H，ppm，500MHz，d₆-DMSO)：9.12(d，J＝8Hz，2H)；8.93(m，5H)；8.67(t，2H)；8.25(s，2H)；8.16(m，4H)；7.95(m，2H)；7.89(d，J＝5.2Hz，2H)；7.69(m，4H)；7.63(d，J＝6.4Hz，2H)；7.55(d，J＝7.2Hz，2H)；7.47(d，J＝4Hz，4H).4.38(m，2H)；1.20(t，3H).元素分析：C₄₉H₃₆N₈RuCl₂·C₂H₆O₂·4H₂O·C₄H₈O₂·3CH₃OH计算值：C，56.77；H，5.75；N，9.13.测定值：C，56.41；H，5.69；N，9.78.
实施例四、Ru(aip)₃(PF₆)₂和Ru(aeip)₃(PF₆)₂的合成：
(1)Ru(aip)₃(PF₆)₂的合成
RuCl₃.3H₂O(0.1mmol，0.0261g)和配体aip(0.33mmol，0.132g)加入到30mL乙二醇中，氮气保护下回流8小时，冷却至室温，加入10倍当量的NH₄PF₆，搅拌2小时，析出大量红色沉淀，过滤得到红色固体，乙醚洗，固体用乙睛溶解过滤除去不溶物，溶液用乙醚扩散重结晶，析出固体硅胶柱层析，甲醇丙酮(3:1，v/v)淋洗得到产品，真空干燥后得到红色固体74mg。产率：46.8％。¹H NMR(δ_H，ppm，500MHz，d₆-DMSO)：8.97(d，6H)；8.66(dd，12H)；7.69(12H)；7.51(t，6H)；7.39(t，6H).元素分析：C₈₁H₄₈F₁₂N₁₂P₂Ru·10H₂O·10CH₃CN·6CH₃OH(FW＝2363)，计算值：C，54.38；N，13.04；H，5.20.测量值：C，54.50；N，13.03；H，5.02.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱：m/z＝1289([M-2PF₆^--H⁺]⁺)。红外光谱(KBr压片，cm^-1)：3443.3(w)；1635.7(s)；843.3(s)。
(2)Ru(aeip)₃(PF₆)₂的合成
RuCl₃.3H₂O(0.2mmol，0.0522g)和配体aeip(0.66mmol，0.280g)加入到30mL乙二醇中，氮气保护下回流8小时，冷却至室温，加入10倍过量NH₄PF₆，搅拌2h，过滤得到红色沉淀。DMF-乙醚扩散重结晶，析出固体硅胶柱层析，二氯甲烷甲醇(10:1，v/v)淋洗得到粗产品，所得产品再用硅胶柱层析二氯甲烷甲醇(30:1，v/v)淋洗得到产品，真空干燥后得到红色固体62mg。产率：21.3％。¹H NMR(δ_H，ppm，500MHz，d₆-DMSO)：9.17(d，6H)；9.03(s，3H)；8.27(12H)；7.95(6H)；7.64(18H)；7.39(t，6H)；4.41(6H)；1.25(t，9H).元素分析C₈₇H₆₀N₁₂F₁₂P₂Ru·4H₂O：计算值：C，60.17；H，3.95；N，9.68.测量值：C，60.18；H，4.375；N，10.38.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱：m/z＝1374([M-2PF₆^--H]⁺)。红外光谱(KBr压片，cm^-1)：3443.5(w)，3044.4(s)，2977.8(s)，2918.5(s)，1660.5(s)，841.0(s).
实施例五
以Ru(aeip)₃(PF₆)₂为例，介绍本发明配合物作为荧光探针在中性和碱性溶液中检测单线态氧的方法和检测性能。
中性体系中¹O₂的测定：首先在含有10mM NaOCl的pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液中加入配合物，然后在该体系中加入H₂O₂，H₂O₂/NaOCl体系在中性溶液中单线态氧产率几乎是100％(A.M.Held，D.J.Halko，J.K.Hurst，J.Am.Chem.Soc.1978，100，5732-5740.)。随着H₂O₂的加入，体系中不断产生¹O₂，所产生的¹O₂与配合物作用，配合物中的蒽环在350nm-400nm之间的吸收不断降低，证明蒽环是与¹O₂反应的活性基团，同时体系荧光强度逐渐增强。
碱性体系中¹O₂的测定：在含有10mM Na₂MoO₄的pH＝9-11的碳酸盐缓冲溶液中加入配合物，然后在体系中加入H₂O₂，H₂O₂/Na₂MoO₄体系在碱性溶液中能有效的产生单线态氧(K.Tanaka，T.Miura，N.Umezawa，Y.Urano，K.Kikuchi，T.Higuchi，T.Nagano，J.Am.Chem.Soc.，2001，123，2530-2536；M.Q.Tan，B.Song，G.L.Wang，J.LYuan，FreeRadic.Biol.Med.，2006，40，1644-1653.)。随着H₂O₂的加入，体系不断产生¹O₂，所产生的¹O₂与配合物作用，配合物中的蒽环在350nm-400nm之间的吸收不断降低，证明蒽环是与¹O₂反应的活性基团，同时体系荧光强度逐渐增强。
配合物在中性和碱性溶液中对单线态氧均有较好的检测性能，参见图1～图4，中性条件下的单线态氧是由H₂O₂/NaClO体系在pH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲溶液产生的；碱性环境中单线态氧可由H₂O₂/Na₂MoO₄体系在pH＝9.95的0.1M的碳酸盐缓冲溶液产生。测定用仪器为GBC Cintra10e紫外-可见分光光度计和Cary Eclipse荧光分光光度计。在中性(碱性)缓冲溶液中加入H₂O₂体系即会产生¹O₂，随着¹O₂与配合物的作用，蒽环部分在350nm-400nm之间的吸收不断降低，如图1所示，证明蒽环是与¹O₂反应的活性基团。在未加入H₂O₂时体系几乎没有荧光发射，随着¹O₂浓度的增加，在464nm光激发下体系在602nm处的荧光发射逐渐增强，如图2所示(图2中箭头所指方向为¹O₂浓度增加的方向)，中性和碱性的溶液中有单线态氧和无单线态氧存在时荧光强度比分别达65和27，量子效率增加分别达到100和37。体系的荧光增强是由于配合物与¹O₂作用生成其内过氧化物从而影响荧光体的发射性质，改变了其发光性能从而发出较强的荧光。在464nm光激发下体系的在602nm处荧光发射强度与¹O₂浓度之间的关系如图3所示，其中碱性体系中¹O₂浓度在4.8μM到9.46mM之间体系的荧光强度与¹O₂浓度之间有很好的线性关系，线性相关系数达0.99943。根据如下公式计算出该体系的荧光量子效率：
φ_s＝φ_std(A_std/A_s)(I_s/I_std)(η_s/η_std)²
上式中，下标s和std分别代表待测体系和标准物质，φ为量子效率，A为激发波长处的吸光度，I为荧光发射强度，η为溶液的折光率。以[Ru(bpy)₃]²⁺为标准物质，其水溶液的荧光量子效率是φ_std＝0.028，在A_std、I_std、η_std和η_s已知的情况下，通过测定待测体系在激发波长处的吸光度A_s和荧光发射强度I_s，即可计算得到其量子效率φ_s。配合物Ru(aeip)₃(PF₆)₂(9.6897×10^-6M)在中性和碱性条件下生成的内过氧化物的量子效率与单线态氧浓度之间的关系如图4所示。将图4中的曲线作为标准曲线，可以以Ru(aeip)₃(PF₆)₂为探针在中性和碱性条件下测定任一未知体系中的单线态氧浓度。
配合物与活性氧物种的作用实验中，配合物与H₂O₂，-OH，ONOO^-等活性氧物种作用时体系荧光强度变化很小，而配合物与¹O₂作用后体系的荧光大大增强，如图5所示，这表明配合物对¹O₂具有很好的选择性。在中性和碱性条件下对¹O₂的检测最低浓度根据背景标准偏差的三倍计算分别为18nM和27.8nM，表明该配合物对¹O₂具有很高的灵敏度。
实施例六
与配合物Ru(aeip)₃(PF₆)₂在溶液中检测单线态氧的方法相同，其余配合物的单线态氧检测性能如下表所示：