一种羟基自由基的测定方法 【技术领域】
本发明涉及一种羟基自由基的测定方法。具体地说，涉及一种利用萘基二苯甲烷染料-夜蓝作为显色剂，利用分光光度法测定羟基自由基的新方法。
背景技术
羟基自由基(·OH)对生物体毒性强危害大，并且反应活性大，寿命短，存在浓度低。目前，国内外报道的测定羟基自由基的方法有：电子自旋共振法、高效液相色谱法、荧光法、共振散射光谱法和分光光度法等。这些方法或仪器昂贵，或灵敏度不够。
【发明内容】
本发明的目的是克服上述技术弊端，提供一种具有使用设备简单、检测成本低、操作简便、灵敏度高等优点的羟基自由基的测定方法。
本发明的技术原理
在水溶液中，羟基自由基氧化夜蓝，夜蓝溶液褪色，对波长618nm处的可见光有选择性吸收，通过测定溶液的吸光度可以得到溶液中羟基自由基的浓度。
本发明的技术方案
一种羟基自由基的测定方法，测定步骤如下：
(1)标准曲线的绘制
分别往编号为①到⑥的6个50mL容量瓶中都加入2.0×10-4mol·L-1的夜蓝水溶液9.0mL，pH为3.1～3.3的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液5.0mL，1.0×10-3mol·L-1FeSO4水溶液0.3mL；
再分别往①到⑤号的5个容量瓶中加入现配制的5.0×10-4mol·L-1的双氧水，其中①号中加入0.2mL双氧水，②号中加入0.4mL双氧水，③号中加入0.6mL双氧水，④号中加入0.8mL双氧水，⑤号中加入1.0mL双氧水；
⑥号中不加双氧水，作为参比液；
将①到⑥号分别充分混匀，静置15min后，用蒸馏水定容，摇匀；
用1cm比色皿，用⑥号作参比，测定618nm处①到⑤号的5个容量瓶中溶液的吸光度；
以吸光度为纵坐标，双氧水浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(2)回归方程的获得
根据步骤(1)的标准曲线获得回归方程：A＝1.07C(mg·L-1)-0.0038；其中A为吸光度；C为双氧水摩尔浓度；
(3)羟基自由基的测定
往50mL容量瓶中加入2.0×10-4mol·L-1夜蓝水溶液9.0mL，pH为3.1～3.3的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液5.0mL，1.0×10-3mol·L-1FeSO4水溶液0.3mL，加入可产生羟基自由基的物质，充分混匀，静置15min后，用蒸馏水定容，摇匀，用1cm比色皿，用步骤(1)中的⑥号作参比，测定618nm处溶液的吸光度，根据步骤(2)的回归方程计算羟基自由基的浓度；
其中加入可产生羟基自由基的物质的量按其最终含羟基自由基浓度为0.039～0.379mg/L计算。
本发明的测定方法当H2O2浓度为0.17mg·L-1，相对误差小于5％时，以下离子允许量为(mg·L-1)：K+(2000)、Ca2+(2000)、Sn2+(2000)、Al3+(2000)、Pb2+(2000)、NO3-(2000)、SO42-(2000)、NH4+(2000)、Br-(2000)、HC2O4-(2000)、H2BO3-(2000)、H4P3O10-(2000)、柠檬酸根(2000)，Ni+(100)、Cu2+(100)、Co2+(100)、Mn2+(100)、Cr3+(100)，Cl-(5000)，Fe3+(400)，F-(30)，硅酸氢根(1000)，Ag+(0.05)，Hg2+(0.03)，Cd2+(0.05)，Mn7+(0.2)，Cr6+(0.6)。以上离子浓度上限未做。
本发明的有益效果
目前国内外报道的测定羟基自由基的方法有：电子自旋共振法、高效液相色谱法、荧光法、共振散射光谱法和分光光度法等。这些方法或仪器昂贵，或灵敏度不高，本发明采用夜蓝为显色剂，分光光度法测定羟基自由基，可检测浓度范围为0.039～0.379mg/L的羟基自由基，该方法具有仪器简单、检测成本低、操作简便快捷、灵敏度高，摩尔吸光系数以双氧水浓度计高达3.6×104L·mol-1·cm-1等优点。
【具体实施方式】
下面通过实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明检测方法所用的仪器
UV757CRT紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)
PHS-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)
JA2003型电子天平(上海精科天平厂)
本发明检测方法所用的试剂：
FeSO4、H2O2、H3PO4和NaH2PO4均为分析纯
商品化夜蓝(C.I 44085)
实施例1
(1)标准曲线的绘制
分别往编号为①到⑥的6个50mL容量瓶中都加入2.0×10-4mol·L-1的夜蓝水溶液9.0mL，pH为3.1～3.3的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液5.0mL，1.0×10-3mol·L-1FeSO4水溶液0.3mL；
再分别往①到⑤号的5个容量瓶中加入现配制的5.0×10-4mol·L-1的双氧水，其中①号中加入0.2mL双氧水，②号中加入0.4mL双氧水，③号中加入0.6mL双氧水，④号中加入0.8mL双氧水，⑤号中加入1.0mL双氧水；
⑥号中不加双氧水，作为参比液；
将①到⑥号分别充分混匀，静置15min后，用蒸馏水定容，摇匀；
用1cm比色皿，用⑥号作参比，测定618nm处①到⑤号的5个容量瓶中溶液的吸光度；
以吸光度为纵坐标，双氧水浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(2)回归方程的获得
根据步骤(1)的标准曲线获得回归方程：A＝1.07C(mg·L-1)-0.0038；其中A为吸光度；C为双氧水摩尔浓度；
(3)羟基自由基的测定
往50mL容量瓶中加入含乳化剂2.0×10-4mol·L-1夜蓝水溶液9.0mL，pH为3.1～3.3的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液5.0mL，1.0×10-3mol·L-1FeSO4水溶液0.3mL，现配制的浓度为5.0×10-4mol·L-1的双氧水0.1mL，充分混匀，静置15min后，用蒸馏水定容，摇匀，用1cm比色皿，用步骤(1)中的⑥号作参比，测定618nm处溶液的吸光度为0.038，根据步骤(2)地回归方程计算羟基自由基的浓度为0.039mg/L；
实施例2
(1)标准曲线的绘制
同实施例1；
(2)回归方程的获得
同实施例1
(3)羟基自由基的测定
往50mL容量瓶中加入含乳化剂2.0×10-4mol·L-1夜蓝水溶液9.0mL，pH为3.1～3.3的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液5.0mL，1.0×10-3mol·L-1FeSO4水溶液0.3mL，现配制的浓度为5.0×10-4mol·L-1的双氧水0.7mL，充分混匀，静置15min后，用蒸馏水定容，摇匀，用1cm比色皿，用步骤(1)中的⑥号作参比，测定618nm处溶液的吸光度为0.252，根据步骤(2)的回归方程计算羟基自由基的浓度为0.119mg/L；
实施例3
(1)标准曲线的绘制
同实施例1；
(2)回归方程的获得
同实施例1
(3)羟基自由基的测定
往50mL容量瓶中加入含乳化剂2.0×10-4mol·L-1夜蓝(C.I 44085)水溶液9.0mL，pH为3.1～3.3的磷酸-磷酸二氢钠缓冲溶液5.0mL，1.0×10-3mol·L-1FeSO4水溶液0.3mL，现配制的浓度为5.0×10-4mol·L-1的双氧水1.1mL，充分混匀，静置15min后，用蒸馏水定容，摇匀，用1cm比色皿，用步骤(1)中的⑥号作参比，测定618nm处溶液的吸光度为0.401，根据步骤(2)的回归方程计算羟基自由基的浓度为0.379mg/L。
以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。