虾变应原特异性IgE的ELISA检测试剂盒及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种定性检测人血清中虾变应原特异性IgE的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒及其制备方法，筛查和诊断因进食或接触虾类食物而引起的过敏症。
背景技术
食物过敏反应是现代社会中常见的一大类疾病，其发生是因进食或接触各种食物中的变应原而引起的，大都是由IgE介导的I型超敏反应。
食物过敏反应的发病机理主要涉及两方面因素，一是食物变应原的刺激，另一个是个体的反应性。当食物变应原进入机体后，激活特异性B细胞克隆产生针对该变应原的特异性IgE，IgE以其Fc段与肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面的IgE Fc受体(FcεR)结合，使机体处于致敏状态。当机体再次受到相同的变应原刺激时，再次进入的变应原与已结合在肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的特异性IgE结合，引起FcεR桥联，激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞，通过一系列膜分子行为导致细胞脱颗粒、释放和合成组胺、激肽酶原、前列腺素、白三烯、血小板活化因子等多种生物活性介质，作用于血管、皮肤、粘膜、腺体等靶器官，引起支气管平滑肌收缩、血管扩张、毛细血管通透性增加、组织水肿及呼吸道和消化道炎症反应；导致支气管哮喘，过敏性鼻炎，过敏性胃肠炎，过敏性荨麻疹，严重时可引起过敏性休克。
正常人血清中IgE的量极低，约为5×10-5mg/ml，用特异性变应原进行检测时一般呈阴性反应。发生过敏反应的个体血清中IgE含量显著升高，可比正常高出1000～2000倍，用特异性变应原进行检测时都呈阳性反应。因此，应用变应原作为抗原检测血清中的特异性IgE，是理想的I型超敏反应的临床诊断指标之一。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、方便快速地定性检测人血清中虾变应原特异性IgE的ELISA检测试剂盒，用以筛查和诊断虾类食物过敏症。
本发明的虾变应原特异性IgE ELISA检测试剂盒，其组成包括已包被纯化的虾变应原蛋白的酶标反应板、酶标记抗体、底物显色液、样品稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、浓缩洗涤液和终止反应液；
其中：
包被酶标反应板的虾变应原蛋白是从刀额新对虾(Metapenaeus ensis)组织蛋白中经过分离纯化得到的纯化变应原蛋白，包括分子量为21.6KDa、30KDa、33KDa、36KDa、46.2KDa、60KDa、64.8KDa、68KDa、78KDa、88.5KDa的10种蛋白质，以其中任意1种或1种以上组合包被酶标反应板作为检测抗原。
酶标记抗体：辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgE抗体；
底物显色液：1.25mmol/L 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、12mmol/L过氧化脲、15mmol/L柠檬酸-5mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4；
样品稀释液：75mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0-7.4，含0.1％Tween-20、庆大霉素100u/ml、0.01％硫柳汞和0.01％山梨酸、1％牛血清白蛋白；
阳性对照血清：虾变应原特异性IgE阳性血清混合物；
阴性对照血清：正常人血清混合物；
浓缩洗涤液：0.25mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4，含1％Tween-20、0.01％硫柳汞和0.01％山梨酸；
终止反应液：1mol/L H2SO4。
本发明的虾变应原特异性IgE ELISA检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)包被酶标反应板：用纯化的刀额新对虾变应原蛋白为抗原包被酶标反应板；
(2)封闭酶标反应板：用封闭液封闭已包被虾变应原蛋白的酶标反应板；
(3)配制酶标记抗体；
(4)配制底物显色液；
(5)配制样品稀释液；
(6)配制浓缩洗涤液和终止反应液。
本发明的虾变应原特异性IgE ELISA检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)取待检样品、阳性对照血清、阴性对照血清分别加入相应的酶标反应板反应孔中，37℃孵育30分钟，使待检样品以及阳性对照血清中特异性IgE与包被在酶标反应板反应孔中的虾变应原特异性结合；
(2)用洗涤液洗涤，除去未结合的杂蛋白和其它物质；
(3)于酶标反应板反应孔中加入HRP标记的羊抗人IgE抗体，37℃孵育30分钟，使HRP标记的羊抗人IgE抗体与已结合在反应孔固相的特异性IgE结合；
(4)用洗涤液洗涤，除去未结合的酶标记抗体；
(5)于酶标反应板反应孔中加入底物显色液，37℃或室温孵育15分钟，使标记酶分解底物出现颜色反应；
(6)于酶标反应板反应孔中加入终止反应液，终止酶反应后，用酶标仪在450nm波长下测定吸光值。
具体实施方法
下面的实施例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实施例一
虾变应原特异性IgE ELISA检测试剂盒的制备。
本试剂盒的制备过程包括如下步骤：
1.包被酶标反应板
用包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.5-9.6)将纯化的刀额新对虾的33KDa变应原蛋白稀释至1μg/ml，于96孔(或48孔)酶标反应板每孔加入50μl(变应原蛋白包被量为50ng/孔)，将加好包被抗原液的酶标反应板置湿盒内，于37℃孵育3小时，然后放置4℃过夜。
次日甩去包被液，用洗涤液洗酶标反应板三次，拍干。
2.封闭酶标反应板
于酶标反应板每孔加入封闭液(含1％BSA、0.01％硫柳汞和0.01％山梨酸的生理盐水)220μl，置湿盒内，于37℃孵育3小时，然后放置4℃过夜。
次日甩去包被液，用洗涤液洗酶标反应板三次；将酶标反应板真空干燥，装入带有干燥剂的铝箔袋内密封，贮存于4℃。
3.配制酶标记抗体
用样品稀释液将HRP标记的羊抗人IgE抗体(购自美国KPL公司)稀释为1∶1500浓度；分装于小试剂瓶，贮存于4℃。
4.配制底物显色液
底物显色液成分为1.25mmol/L3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、12mmol/L过氧化脲、15mmol/L柠檬酸-5mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4。
先按配液总量的80～90％配制15mmol/L柠檬酸-5mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，调节pH至5.4；准确称取所需量的过氧化脲加入缓冲液内，使完全溶解并充分混匀；准确称取所需量的TMB用适量乙醇溶解，缓慢加入缓冲液内，充分混匀；最后用蒸馏水定容至配液总量；分装于小试剂瓶，贮存于4℃。
5.配制样品稀释液
样品稀释液成分为75mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0-7.4，含0.1％Tween-20、庆大霉素100u/ml、0.01％硫柳汞和0.01％山梨酸、1％牛血清白蛋白。
先按配液总量的80～90％配制75mmol/L磷酸盐缓冲液，调节pH至7.2；按所需量加入庆大霉素(原液8万u/ml或4万u/ml)、1％的硫柳汞和10％的山梨酸，使其终浓度分别为100u/ml、0.01％和0.01％，充分混匀；准确称取所需量的牛血清白蛋白加入缓冲液内，使完全溶解并充分混匀；按所需量加入Tween-20使其终浓度为0.1％，充分混匀；最后用蒸馏水定容至配液总量；分装于小试剂瓶，贮存于4℃。
6.配制浓缩洗涤液
浓缩洗涤液为20倍浓缩，成分为0.25mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4，含1％Tween-20、0.01％硫柳汞和0.01％山梨酸。
先按配液总量的80～90％配制0.25mol/L磷酸盐缓冲液，调节pH至7.4，按所需量加入1％地硫柳汞和10％的山梨酸，使其终浓度分别为0.01％和0.01％，充分混匀；按所需量加入Tween-20使其终浓度为1％，充分混匀；最后用蒸馏水定容至配液总量；分装于小试剂瓶，贮存于4℃。
7.配制终止反应液
终止反应液成分为1mol/L H2SO4，按常规方法配制；分装于小试剂瓶，贮存于4℃。
8.阳性对照与阴性对照
将虾变应原特异性IgE阳性血清混合均匀，用样品稀释液适当稀释，使其经本试剂盒检测的OD450值在1～2之间，分装于小试剂瓶，贮存于4℃。
阴性对照血清用样品稀释液适当稀释(或不稀释)，分装于小试剂瓶，贮存于4℃。
实施例二
用虾变应原特异性IgE ELISA检测试剂盒检测临床疑似虾类食物过敏症患者血清
对44例临床疑似虾类食物过敏症的患者，用本发明的ELISA试剂盒检测其血清中的虾变应原特异性IgE，操作步骤如下：
1.取铝箔包装的48孔已包被酶标反应板1块，平衡至室温后，开启包装袋取出酶标反应板。
2.设置阳性对照、阴性对照和空白孔：本例设置A12孔为阳性对照孔，加入阳性对照50μl/孔；B12孔和C12孔为阴性对照孔，分别加入阴性对照50μl/孔；D12孔为空白，加入样品稀释液50μl/孔。
3.加样：取待检血清编号，从酶标反应板A1至A11孔、B1至B11孔、C1至C11孔、D1至D11孔依次加入待检血清，50μl/孔；用封口胶纸封好酶标反应板反应孔，置37℃温箱孵育30分钟。
4.洗板：取浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍；酶标反应板孵育结束后撕下封口胶纸，甩去反应孔中的液体，在吸水纸上拍干；于反应孔中加满洗涤液，静置约30秒，甩去反应孔中的液体，在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。
5.加酶标记抗体：于酶标反应板每孔加入HRP标记的羊抗人IgE 50μl，用封口胶纸封好反应孔，置37℃温箱孵育30分钟；如步骤4洗板5次。
6.加底物显色：于酶标反应板每孔加入底物显色液50μl，置37℃温箱或室温下反应15分钟。
7.终止反应测OD值：于酶标反应板每孔加入终止反应液50μl(或2滴)，混匀，在10分钟内用酶标仪在450nm波长下以空白孔调零，测定吸光值(OD值)。
8.结果判断：
(1)以阴性对照孔OD值的平均值×2.1为阈值(cut off值，CO值)，样品孔OD值≥cut off值的判断为虾变应原特异性IgE阳性，样品孔OD值＜cut off值的判断为虾变应原特异性IgE阴性。
(2)在缺乏酶标仪的基层医院，可直接观察判断结果，以样品孔与阳性对照孔进行比较，样品孔反应液的颜色深于或等于阳性对照孔的判断为阳性，样品孔反应液的颜色淡于阳性对照孔的判断为阴性。
本例对临床疑似虾类食物过敏症患者血清的检测结果(表1)显示，44份血清中有29份血清的OD值大于cut off值(0.243)，为虾变应原特异性IgE阳性，可确诊为虾类食物过敏症。
表144份疑似虾过敏症患者血清中虾变应原特异性IgE的检测结果