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钩端螺旋体快速质谱检测试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103344695 A (43)申请公布日 2013.10.09 CN 103344695 A *CN103344695A* (21)申请号 201310241394.5 (22)申请日 2013.06.18 G01N 27/64(2006.01) (71)申请人中国疾病预防控制中心传染病预防控制所地址 102206 北京市昌平区昌百路 155 号 (72)发明人肖迪张翠彩张建中蒋秀高张慧芳李秀文 (74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司 11002 代理人王朋飞 (54) 发明名称钩端螺旋体快速质谱检测试剂盒 (57) 摘要本发明。

2、提供一种钩端螺旋体致病性（毒性）快速质谱检测试剂盒，涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域。本发明基于质谱技术，构建了针对钩端螺旋体进行快速致病性鉴定的特异性多肽质谱模型，以及使用质谱技术进行致病性检测的试剂盒。本发明试剂盒能够通过特异性指纹图谱鉴定致病性（有毒）、非致病性（无毒）钩端螺旋体，准确度高、重复性好， 2 小时内可完成 96 个样本的检测，能够解决大批量钩端螺旋体致病性分析检测费时费力的难题，且成本低廉，具有良好的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 10 页附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。

3、发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图9页 (10)申请公布号 CN 103344695 A CN 103344695 A *CN103344695A* 1/2 页 2 1. 一种用于钩端螺旋体（Leptospira）检测的特征蛋白质谱模型，其特征在于，含有以下两组钩端螺旋体特征蛋白， 1） 23 个特征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5， 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4， 7066.1， 7432.1。

4、， 8057.9， 8252.7， 8734.3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73， 11307.9 ； 2） 19 个特征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 4389.3， 5442.3， 5690.3， 5731.6， 6003.5， 6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7， 8088.1， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3。 2. 检测钩端螺旋体特征蛋白的质谱模型在制备钩端螺旋体检测试剂盒中的应用，其特征在于，。

5、所述质谱模型含有以下两组钩端螺旋体特征蛋白， 1） 23 个特征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5， 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4， 7066.1， 7432.1， 8057.9， 8252.7， 8734.3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73， 11307.9 ； 2） 19 个特征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 4389.3， 5442.3， 5690.3， 5731.6，。

6、 6003.5， 6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7， 8088.1， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3。 3. 一种用于检测钩端螺旋体特征蛋白质谱模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1）制备钩端螺旋体蛋白样品：收集液体培养至对数生长期的钩端螺旋体菌株，离心，弃上清；将沉淀用菌体洗涤液 A 洗涤，离心，弃上清；沉淀菌体用菌体洗涤液 B 和 C 混合后洗涤，高速离心，弃上清洗涤液；将沉淀菌体加入蛋白提取液 A 。

7、和 B 进行抽提，高速离心，取上清； 2）将上述待检钩端螺旋体蛋白样品分别上质谱仪样品靶，采集 2000-20000Da 范围内的肽图谱；设定参数，对蛋白质指纹图谱进行标准化处理； 3）对所得数据进行统计学处理，得到具有统计学意义的钩端螺旋体特征蛋白，其中，致病性钩端螺旋体特征蛋白其质荷比分别为： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5， 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4， 7066.1， 7432.1， 8057.9， 8252.7。

8、， 8734.3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73， 11307.9 ；将上述 23 个特征蛋白作为检测致病性钩端螺旋体的质谱模型；其中，非致病性钩端螺旋体特征蛋白质荷比为： 4389.3， 5442.3， 5690.3， 5731.6， 6003.5， 6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7， 8088.1， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3 ；将上述 19 个特征蛋白作为检测非致病性钩端螺旋体的质谱模型；。

9、其中，步骤 1）所述菌体洗涤液 A 配方为磷酸二氢钾 0.2g，磷酸氢二钠 2.9g，氯化钠 8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mL，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；所述菌体洗涤液 B 为 18.2 兆欧超纯水，所述菌体洗涤液 C 为 100% 色谱级乙醇；所述蛋白提取液 A 为 70% 色谱级甲酸，所述蛋白提取液 B 为色谱级乙腈。 4. 如权利要求 3 所述的制备方法，其特征在于，步骤 1）中所述的离心，其参数为 12000g， 5min ；所述的高速离心，其参数为 16000g， 2min。权利要求书。

10、 CN 103344695 A 2 2/2 页 3 5. 如权利要求 3 所述的制备方法，其特征在于，步骤 2）将蛋白样品上质谱仪样品靶，样品干燥后，按体积比 1:1 在样品上覆盖基质，所述基质为 - 氢基 -4- 羟基肉桂酸在 50% 乙腈、 2.5% 三氟乙酸中的饱和液。 6. 如权利要求 3 所述的制备方法，其特征在于，步骤 2）中质谱仪为 MALDI-TOF 质谱仪，氮激光器波长 377nm, 质量采集范围 2000 至 20000Da，源 1 电压 ,20kV, 源 2 电压 ,18.5kV, 透镜电压 ,8.45kV ；延时提取 ,320ns ；激光频率。

11、20Hz，调整总采集频次使谱图总强度大于 10000 ；每次数据采集前，采用大肠杆菌 ATCC8739 质控校正仪器，使分子量误差 0.02%。 7. 如权利要求 3 所述的制备方法，其特征在于，步骤 3）所述的统计学处理包括通过设定主谱图预测MSP参数，质量偏差小于0.02%、信噪比大于3、峰出现频率最小值25%，最多峰数目 70，每个浓度的标准由 20 张谱图构建标准参考谱；并由 MSP 内置的统计学功能提取特征蛋白。 8. 用于致病性钩端螺旋体检测的试剂盒，其特征在于，含有以下特征蛋白质荷比的图谱： 23 个特征蛋白，其质荷比 m。

12、/z 分别为： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5， 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4， 7066.1， 7432.1， 8057.9， 8252.7， 8734.3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73， 11307.9。 9. 用于非致病性钩端螺旋体检测的试剂盒，其特征在于，含有以下特征蛋白质荷比的图谱： 19 个特征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 4389.3， 5442.3， 569。

13、0.3， 5731.6， 6003.5， 6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7， 8088.1， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3。 10. 如权利要求 8 或 9 所述的试剂盒，其特征在于，还含有 : 1）菌体洗涤液 A ：其 1L 配方为磷酸二氢钾 0.2g，磷酸氢二钠 2.9g，氯化钠 8.0g，氯化钾 0.2g，吐温 -200.5mL，加水至 1000mL，使用盐酸调节 pH 值为 7.4，高压灭菌； 2）菌体洗涤液 B ：。

14、 18.2 兆欧超纯水； 3）菌体洗涤液 C ： 100% 色谱级乙醇； 4）蛋白提取液 A ： 70% 色谱级甲酸； 5）蛋白提取液 B ：色谱级乙腈； 6）基质： - 氰基 -4 羟基肉桂酸，基质溶解液： 50%18.2 兆欧超纯水， 50% 色谱级乙腈， 2.5% 色谱级三氟乙酸。权利要求书 CN 103344695 A 3 1/10 页 4 钩端螺旋体快速质谱检测试剂盒技术领域 0001 本发明涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域，具体地，涉及用于检测钩端螺旋体的质谱模型以及基于该质谱模型进行致病性检测的试剂盒。背景技术 0002 钩端螺旋体病是由。

15、致病性钩端螺旋体（Leptospira）引起的一种分布广泛的人兽共患病，其流行几乎遍及全世界，在东南亚地区尤为严重，且一年四季均可发病。钩端螺旋体属于螺旋体目螺旋体科钩端螺旋体属，下分为两个种：问号钩端螺旋体（致病性）和双曲钩端螺旋体（非致病性）。钩端螺旋体病是全身性感染疾病，重者可出现急性炎症性肝损伤、肾损伤的症状如黄疸、出血、尿毒症等，也可出现脑膜的炎性症状如神志障碍和脑膜刺激征等；严重病人可出现肝、肾功能衰竭、肺大出血而导致死亡。钩端螺旋体病作为一种严重人畜共患传染病 , 已成为我国重要的公共卫生问题之一。在我国，钩端螺旋体病被列为乙。

16、类传染病。 0003 致病性钩端螺旋体是导致钩端螺旋体病的元凶。钩端螺旋体致病性检测的金标准是传统的血清学方法。但其操作程序繁琐，实验技术要求较高，需要保存大量的国际、国内参考菌株，同时，实验中需要采用不同血清型抗原来免疫实验动物以制备免疫血清，如果操作不当还将导致抗体效价滴度的迅速降低，影响最终实验结果的判断，如此繁琐的操作程序，普通的实验室实难开展，国内、国际上也只有个别的参比实验室可以开展该项工作。因此，目前作为金标准的传统血清学分类方法很受限制，这也对日常钩体病疫情的监测、预防控制造成很大的影响。以 16SrDNA 为代表的分子生物学方法可对。

17、钩端螺旋体致病性进行鉴定，但需要提取DNA，进行基因测序，费力耗时。因此迫切需要一种更加快速，可靠，高通量的鉴定方法来应对钩端螺旋体病临床诊断与疫情控制。 0004 基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）方法是近年来出现的用于病原识别的方法，许多国家的科研人员对该方法进行了验证，均表明 MALDI-TOF MS 满足现代传染病快速诊断的所有要求：快速、准确、易操作、廉价、高通量。目前商业化的用于质谱的微生物鉴定系统有德国布鲁克公司的 Biotyer 系统及生物梅里埃公司的 Saramis 系统。但这两套商业化的数据库内均没有钩端螺旋。

18、体的标准肽谱，无法识别钩端螺旋体，更无法鉴定致病性。发明内容 0005 本发明的目的是为了克服目前致病性钩端螺旋体检测技术的不足，提供一种基于质谱技术的用于快速鉴定致病性、非致病性钩端螺旋体的特征蛋白谱模型。 0006 本发明的另一目的是提供检测致病性和 / 或非致病性钩端螺旋体的试剂盒。 0007 本发明提供的用于钩端螺旋体检测的特征蛋白质谱模型，含有以下两组钩端螺旋体特征蛋白， 0008 1） 23 个特征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5，说明书 CN 103344695 A 4 2/。

19、10 页 5 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4， 7066.1， 7432.1， 8057.9， 8252.7， 8734.3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73， 11307.9 ； 0009 2） 19 个特征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 4389.3， 5442.3， 5690.3， 5731.6， 6003.5， 6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7。

20、， 8088.1， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3。 0010 进一步，本发明提供了上述质谱模型在制备钩端螺旋体致病性检测试剂盒中的应用。 0011 本发明提供了一种检测钩端螺旋体致病性的质谱模型的制备方法，包括以下步骤： 0012 1）制备致病性钩端螺旋体和非致病性钩端螺旋体蛋白样品：收集液体培养至对数生长期的钩端螺旋体菌株，离心，弃上清；将沉淀用菌体洗涤液 A 洗涤，离心，弃上清；沉淀菌体用菌体洗涤液 B 和 C 混合后洗涤，高速离心，弃上清洗涤液；将沉淀菌体加入蛋白提取液 A 和 B 进行抽提，高速离心，。

21、取上清； 0013 2）将上述待检钩端螺旋体蛋白样品分别上质谱仪样品靶，采集 2000-20000Da 范围内的肽图谱；设定参数，对蛋白质指纹图谱进行标准化处理； 0014 3）对所得数据进行统计学处理，得到具有统计学意义的钩端螺旋体特征蛋白，其中，致病性钩端螺旋体特征蛋白质荷比分别为： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5， 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4， 7066.1， 7432.1， 8057.9， 8252.7， 8734.。

22、3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73， 11307.9 ； 0015 将上述 23 个特征蛋白作为检测致病性钩端螺旋体的质谱模型； 0016 其中，非致病性钩端螺旋体特征蛋白质荷比为： 4389.3， 5442.3， 5690.3， 5731.6， 6003.5， 6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7， 8088.1， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3 ； 0017 将上述 19 个特征蛋白作为检测非致病性钩端螺旋体。

23、的质谱模型。 0018 其中，步骤 1）所述菌体洗涤液 A 配方为磷酸二氢钾 0.2g，磷酸氢二钠 2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mL，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；所述菌体洗涤液 B 为 18.2 兆欧超纯水，所述菌体洗涤液 C 为 100% 色谱级乙醇；所述蛋白提取液 A 为 70% 色谱级甲酸，所述蛋白提取液 B 为色谱级乙腈。 0019 其中，步骤 1）中所述的离心，其参数为 12000g， 5min ；所述的高速离心，其参数为 16000g， 2min。 0020 步骤 2）将蛋白样。

24、品上质谱仪样品靶，样品干燥后，按体积比 1:1 在样品上覆盖基质，所述基质为 - 氢基 -4- 羟基肉桂酸在 50% 乙腈、 2.5% 三氟乙酸中的饱和液。 0021 步骤 2）中质谱仪为 MALDI-TOF 质谱仪，氮激光器波长 377nm, 质量采集范围 2000 至 20000Da，源 1 电压 ,20kV, 源 2 电压 ,18.5kV, 透镜电压 ,8.45kV ；延时提取 ,320ns ；激光频率 20Hz，调整总采集频次使谱图总强度大于 10000 ；每次数据采集前，采用大肠杆菌 ATCC8739 质控校正仪器，使分子量误差 0.02%。 0022 步。

25、骤 2）所述的标准化处理包括归一化、基线修正、平滑、去噪、峰筛选，具体参数如下：最大范方法数标准化， Savitsky-Golay 平滑 , 帧幅 25Da; 基线修正采用 Multipolygon 法， 5 个搜索窗口，执行数目 2 ；最大峰数 100，阈值 0.001，最小信噪比 3 ；说明书 CN 103344695 A 5 3/10 页 6 0023 步骤3）所述的统计学处理包括通过设定MSP参数，质量偏差小于0.02%、信噪比大于 3、峰出现频率最小值 25%，最多峰数目 70，构建质谱模型的钩端螺旋体每个样本由 20 张谱图构建标准参。

26、考谱；并由 MSP 内置的统计学功能提取特征蛋白。 0024 本发明提供了用于致病性钩端螺旋体检测的试剂盒，含有以下特征蛋白质荷比的图谱： 0025 23 个特征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5， 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4， 7066.1， 7432.1， 8057.9， 8252.7， 8734.3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73， 11307.9。 0026 本。

27、发明提供了用于非致病性钩端螺旋体检测的试剂盒，含有以下特征蛋白质荷比的图谱： 0027 19 个特征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 4389.3， 5442.3， 5690.3， 5731.6， 6003.5， 6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7， 8088.1， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3。 0028 进一步地，本发明还提供了用于钩端螺旋体检测的试剂盒，含有：含有以下两组特征蛋白质荷比的图谱： 0029 （1） 23 个特。

28、征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5， 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4， 7066.1， 7432.1， 8057.9， 8252.7， 8734.3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73， 11307.9 ； 0030 （2） 19 个特征蛋白，其质荷比 m/z 分别为： 4389.3， 5442.3， 5690.3， 5731.6， 6003.5，。

29、6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7， 8088.1， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3。 0031 本发明提供的上述试剂盒中，还含有： 0032 1）菌体洗涤液 A ：其 1L 配方为磷酸二氢钾 0.2g，磷酸氢二钠 2.9g，氯化钠 8.0g，氯化钾 0.2g，吐温 -200.5mL，加水至 1000mL，使用盐酸调节 pH 值为 7.4，高压灭菌； 0033 2）菌体洗涤液 B ： 18.2 兆欧超纯水； 0034 3）菌体。

30、洗涤液 C ： 100% 色谱级乙醇； 0035 4）蛋白提取液 A ： 70% 色谱级甲酸； 0036 5）蛋白提取液 B ：色谱级乙腈； 0037 6）基质： -氰基-4羟基肉桂酸，基质溶解液： 50%18.2兆欧超纯水， 50%色谱级乙腈， 2.5% 色谱级三氟乙酸。 0038 进一步地，本发明的上述试剂盒，其工作步骤为： 0039 1）制备待测钩端螺旋体蛋白样品：收集液体培养至对数生长期的钩端螺旋体菌株， 12000g离心5min，弃上清；将沉淀用菌体洗涤液A洗涤， 12000g离心5min，弃上清；沉淀菌体用菌体洗涤液B和C混合后洗涤。

31、， 16000g离心2min，弃上清洗涤液；将沉淀菌体加入蛋白提取液 A 和 B 进行抽提， 16000g 离心 2min，高速离心，取上清； 0040 2）将上述待检钩端螺旋体蛋白样品分别上质谱仪样品靶，采集 2000-20000Da 范围内的肽图谱；肽图谱结果与权利要求 1 所述质谱模型的图谱进行比对，若得到的蛋白质谱图中含有以下 23 个特征蛋白的质荷比： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5， 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4，。

32、7066.1， 7432.1， 8057.9，说明书 CN 103344695 A 6 4/10 页 7 8252.7， 8734.3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73， 11307.9 中的至少 15 个，则待测钩端螺旋体为致病性钩端螺旋体。 0041 若得到的蛋白质谱图中含有以下 19 个特征蛋白的质荷比： 4389.3， 5442.3， 5690.3， 5731.6， 6003.5， 6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7， 8088.1。

33、， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3 中的至少 12 个，则待测钩端螺旋体为非致病性钩端螺旋体。 0042 在应用本发明试剂盒进行钩端螺旋体致病性检测的操作中，待测的钩端螺旋体可以是液体培养，也可以固体培养。 0043 本发明采用钩端螺旋体 ATCC 国际标准株构建了钩端螺旋体参考谱库，从而构建了钩端螺旋体特征蛋白的质谱模型，在此基础上开发的检测试剂盒能快速准确地对临床分离的钩端螺旋体进行致病性检测。采用本发明的方法，样品经预提取处理后，菌体全部死亡，可在普通分子生物学实验室进行操作，消除了对人员及环境的危害。 0044 利用本发明检。

34、测了 35 份钩端螺旋体样本，检测结果显示， 35 份样本中 28 份致病性钩端螺旋体、 7 份非致病性钩端螺旋体全部被准确检出，检出率（敏感性）达 100%，特异性为 100%。与钩端螺旋体致病性的其它检测方法比较，本发明在 2 小时内可完成 96 个样本的检测、每个样本检测成本为一元人民币，相对于目前使用的核酸检测技术单个样本几个小时及十元以上的成本，极大地节省了检测时间及检测成本，真正意义上实现了高通量、快速、经济的理想病原检测标准，完全适用于临床确诊、疾病监测、流行病学调查、公共卫生应急处理，具有十分重要的现实意义。附图说明 0045 图。

35、 1 为样本前处理优化肽谱图，其中 A 为菌株 56603 未经菌体洗涤预提取蛋白的肽谱图； B为菌株56603经过菌体洗涤预提取蛋白的肽谱图；图中，横坐标为质荷比，纵坐标为相对强度。 0046 图 2 为部分钩端螺旋体 2000 20000Da 范围内肽质量图谱；图中横坐标为质荷比，纵坐标为相对强度； 57602、 56601、 57616 为模型构建样本； 57607、 57622、 56607、 7751、 J1 为模型验证样本。 0047 图 3 为钩端螺旋体基于肽质量谱的聚类图；图中星标致病性钩端螺旋体、非致病性钩端螺旋体分别是本发明特异蛋白构建的。

36、模拟致病性钩端螺旋体及非致病性钩端螺旋体参考谱。 0048 图4图7为部分致病性钩端螺旋体与质谱模型匹配图。图中横坐标为质荷比，纵坐标为相对强度， * 表示匹配峰；致病性钩体样本标号依次为 7751、 8202、 9069、 9075 ；各图上部为致病性钩体样本实际质谱检测峰；下部为本发明所构建的特征蛋白峰值质谱模型，从左至右峰值依次为： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5， 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4， 7066.1， 7432.。

37、1， 8057.9， 8252.7， 8734.3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73， 11307.9。 0049 图 8 图 11 为部分非致病性钩端螺旋体与质谱模型匹配图；图中横坐标为质荷比，纵坐标为相对强度， * 表示匹配峰；非致病性钩体样本标号依次为 57607、 57614、 57621、 57622 ；各图上部为非致病性钩体样本实际质谱检测峰；下部为本发明所构建的特说明书 CN 103344695 A 7 5/10 页 8 征蛋白质谱模型，从左至右峰值依次为： 4389.3， 5442.3， 5690.3， 5731。

38、.6， 6003.5， 6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7， 8088.1， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3。具体实施方式 0050 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 0051 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的试剂为市售。 0052 实施例 1 液体培养钩端螺旋体。

39、样本前处理优化 0053 由于液体培养基成分复杂，有众多影响质谱谱图质量的因素，因此样本在菌体蛋白提取前培养基成分的有效去除非常关键。菌体的洗涤是有效降低培养基成分影响的有效途径。 0054 本实施例所用的菌体洗涤液 A 配方为磷酸二氢钾 0.2g，磷酸氢二钠 2.9g，氯化钠 8.0g，氯化钾 0.2g，吐温 -200.5mL，加水至 1000mL，使用盐酸调节 pH 值为 7.4，高压灭菌。 0055 细菌主要洗涤步骤是通过菌体洗涤液 A 完成的，本实施例分别将钩端螺旋体不经过洗涤液 A 洗涤，经洗涤液 A 洗涤 1 次进行肽指纹图谱分析，每次洗涤后需 12。

40、000g，离心 5min。 0056 （1）不洗涤菌体直接离心处理，谱图采集困难（激光强度需提高 50%，谱图叠加数量增加 100%），信号噪音大，峰数目少。信噪比 6 以上的峰数目不超过 10 个，不能用于致病性鉴定（图 1 中的 A）； 0057 （2）洗涤 1 次后离心处理，谱图采集顺利，且信噪比、分辨率均满足需求，可获得理想的肽质量指纹图谱，信噪比 6 以上的峰数目超过 100，没有离子及血清等杂信号的影响，可以用于致病性鉴定（图 1 中的 B）； 0058 因此，液体培养的细菌，采用洗涤一次后预提取蛋白，即可完全可以达到质谱检测。

41、的要求。 0059 实施例 2 钩端螺旋体质谱模型的构建 0060 1、样本和仪器 0061 采用致病性钩端螺旋体 43 株，非致病性钩端螺旋体 22 株，各随机抽取 15 株 ATCC 国际标准株用于构建质谱模型（表1）。其余35株用于模型测试。所有菌株都已采用G1/G2、 B64-I/B64-II 作为引物的 PCR 及 16SrRNA 进行致病性确认。 0062 表 1. 模型构建菌株列表说明书 CN 103344695 A 8 6/10 页 9 0063 0064 2、菌体预处理 0065 分别取 5mL 培养至对数生长期的钩端螺旋体菌悬液， 12000g 离心。

42、5min，弃上层液体培养基；菌体沉淀用菌体洗涤液 A 洗涤后 12000g，离心 5min，弃上清；菌体沉淀加入 200L 菌体洗涤液 B，混匀，加入 600L 菌体洗涤液 C，混匀； 16000g，离心 2min，弃上清。加入 50L 蛋白提取液 A，混匀，再加入 50L 蛋白提取液 B，混匀， 16000g 离心 2min，上清液体即为制备好的蛋白样品，用于后续质谱检测。 0066 菌体洗涤液 A 配方为磷酸二氢钾 0.2g，磷酸氢二钠 2.9g，氯化钠 8.0g，氯化钾 0.2g，吐温 -200.5mL，加水至 1000mL，使用盐酸。

43、调节 pH 值为 7.4，高压灭菌；菌体洗涤液 B 为 18.2 兆欧超纯水，菌体洗涤液 C 为 100% 色谱级乙醇；所述蛋白提取液 A 为 70% 色谱级甲酸，所述蛋白提取液 B 为色谱级乙腈。 0067 3、质谱数据采集 0068 取 1L 蛋白样品点于样品靶上，干燥后，覆盖 1L 基质 (- 氢基 -4- 羟基肉桂酸饱和液，基质溶解液： 50%18.2 兆欧超纯水， 50% 乙腈， 2.5% 三氟乙酸 )，放干后采集数据，模型构建菌株每个样本采集 20 张谱图。 0069 基质辅助激光解析飞行时间质谱为美国布鲁克公司的 MicroflexLT。数据采集采。

44、用布鲁克公司的 FlexControlTM(version3.0) 软件。采集的质量范围为 2000-20000Da，参数设定为：源 1 电压 ,20kV, 源 2 电压 ,18.5kV, 透镜电压 ,8.45kV; 延时提取 ,320ns; 激光频率,20.0Hz.80shots采集一个样品结晶点，平均每个样本结晶点收集8次，共计640shots 说明书 CN 103344695 A 9 7/10 页 10 形成一张谱图。采用大肠杆菌 ATCC8739 做为仪器校正用标准品，校正后分子量平均偏差小于 200ppm。 0070 4、特征蛋白质谱模型构建 0071 部分。

45、钩端螺旋体原始谱图参见图 2。采用布鲁克 Biotyper 标准处理方法 (version1.5) 处理原始谱图，对谱图进行基线校正、平滑、去噪、峰筛选，具体参数如下：最大范方法数标准化， Savitsky-Golay 平滑 , 帧幅 25Da; 基线修正采用 Multipolygon 法， 5 个搜索窗口，执行数目 2 ；最大峰数 100，阈值 0.001，最小信噪比 3。采用 Biotyper2.0 的 MSP 功能分别对致病性和非致病性建模菌株构建的共性参考谱，并加入到 Biotyper MSP 数据库。采用 MSP 创建功能构建特异肽谱系列。参数如下： M。

46、SP 质量偏差 ,200 ；信噪比大于 3，峰出现频率最小值 ,25%;MSP 最大峰数目 :70。 0072 对所得数据采用 MSP 内置的统计学功能进行统计学处理，致病性钩端螺旋体，存在 23 个特征蛋白，其质荷比分别为： 3209.1， 3715.6， 4279.9， 5262.6， 5656.5， 5777.5， 5802.8， 6008.7， 6189.0， 6215.6， 6280.5， 6350.9， 6994.4， 7066.1， 7432.1， 8057.9， 8252.7， 8734.3， 9909.4， 10100.5， 10274.9， 10520.73，。

47、11307.9。MSP 分析显示至少 15 个特征蛋白质，即可正确判定致病性钩端螺旋体。 0073 非致病性钩端螺旋体，存在 19 个特征蛋白，其质荷比分别为： 4389.3， 5442.3， 5690.3， 5731.6， 6003.5， 6203.8， 6392.6， 6697.9， 7192.2， 7224.1， 7289.5， 7321.9， 7368.7， 7390.7， 8088.1， 8417.6， 9571.3， 11830.0， 11876.3。 MSP分析显示至少12个特征蛋白质，即可正确判定非致病性钩端螺旋体。 0074 实施例 3 钩端螺旋体质谱模型验证。

48、0075 灵敏度（sensitivity），又称真阳性率（true positive rate），即实际上是该病原并按照该检测方法的标准被正确地判为该病原体的百分比。特异度（specificity），又称真阴性率（true negative rate），即实际上不是该病原体而按照该检测方法的标准被正确地判为该病原体的百分比。 0076 应用实施例2所构建的致病性与非致病性钩端螺旋体特征蛋白质谱模型，对35例菌株，其中 14 株 ATCC 国际标准株， 21 株临床分离株，菌株名称见表 2， * 标识的菌株为 ATCC 菌株。进行检测分析。检测步骤为：。

49、0077 1） 35 份钩端螺旋体菌株样本，分别取 5mL 培养至对数生长期的菌体悬液， 12000g 离心 5min，弃上层液体培养基；菌体沉淀用菌体洗涤液 A 洗涤后 12000g，离心 5min，弃上清；菌体沉淀加入 200L 菌体洗涤液 B，混匀，加入 600L 菌体洗涤液 C，混匀； 16000g，离心 2min，弃上清。加入 50L 蛋白提取液 A，混匀，再加入 50L 蛋白提取液 B，混匀， 16000g 离心 2min，上清液体即为制备好的蛋白样品，用于后续质谱检测。 0078 菌体洗涤液 A 配方为磷酸二氢钾 0.2g，磷酸氢二钠 2.9g，氯化钠 8.0g，氯化钾 0.2g，吐温 -200.5mL，加水至 1000mL，使用盐酸调节 pH 值为 7.4，高压灭菌；菌体洗涤液 B 为 18.2 兆欧超纯水，菌体洗涤液 C 为 100% 色谱级乙醇；所述蛋白。

摘要
申请专利号：	CN201310241394.5	申请日：	2013.06.18
公开号：	CN103344695A	公开日：	2013.10.09
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 27/64申请日:20130618\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N27/64	主分类号：	G01N27/64
申请人：	中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
发明人：	肖迪; 张翠彩; 张建中; 蒋秀高; 张慧芳; 李秀文
地址：	102206 北京市昌平区昌百路155号
优先权：
专利代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司 11002	代理人：	王朋飞
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内容摘要

本发明提供一种钩端螺旋体致病性（毒性）快速质谱检测试剂盒，涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域。本发明基于质谱技术，构建了针对钩端螺旋体进行快速致病性鉴定的特异性多肽质谱模型，以及使用质谱技术进行致病性检测的试剂盒。本发明试剂盒能够通过特异性指纹图谱鉴定致病性（有毒）、非致病性（无毒）钩端螺旋体，准确度高、重复性好，2小时内可完成96个样本的检测，能够解决大批量钩端螺旋体致病性分析检测费时费力的难题，且成本低廉，具有良好的应用前景。

权利要求书

权利要求书
1.  一种用于钩端螺旋体（Leptospira）检测的特征蛋白质谱模型，其特征在于，含有以下两组钩端螺旋体特征蛋白，
1）23个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9；
2）19个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3。

2.  检测钩端螺旋体特征蛋白的质谱模型在制备钩端螺旋体检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述质谱模型含有以下两组钩端螺旋体特征蛋白，
1）23个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9；
2）19个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3。

3.  一种用于检测钩端螺旋体特征蛋白质谱模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备钩端螺旋体蛋白样品：收集液体培养至对数生长期的钩端螺旋体菌株，离心，弃上清；将沉淀用菌体洗涤液A洗涤，离心，弃上清；沉淀菌体用菌体洗涤液B和C混合后洗涤，高速离心，弃上清洗涤液；将沉淀菌体加入蛋白提取液A和B进行抽提，高速离心，取上清；
2）将上述待检钩端螺旋体蛋白样品分别上质谱仪样品靶，采集2000-20000Da范围内的肽图谱；设定参数，对蛋白质指纹图谱进行标准化处理；
3）对所得数据进行统计学处理，得到具有统计学意义的钩端螺旋体特征蛋白，其中，致病性钩端螺旋体特征蛋白其质荷比分别为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9；
将上述23个特征蛋白作为检测致病性钩端螺旋体的质谱模型；
其中，非致病性钩端螺旋体特征蛋白质荷比为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3；
将上述19个特征蛋白作为检测非致病性钩端螺旋体的质谱模型；
其中，步骤1）所述菌体洗涤液A配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mL，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；所述菌体洗涤液B为18.2兆欧超纯水，所述菌体洗涤液C为100%色谱级乙醇；所述蛋白提取液A为70%色谱级甲酸，所述蛋白提取液B为色谱级乙腈。

4.  如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述的离心，其参数为12000g，5min；所述的高速离心，其参数为16000g，2min。

5.  如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2）将蛋白样品上质谱仪样品靶，样品干燥后，按体积比1:1在样品上覆盖基质，所述基质为α-氢基-4-羟基肉桂酸在50%乙腈、2.5%三氟乙酸中的饱和液。

6.  如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中质谱仪为MALDI-TOF质谱仪，氮激光器波长377nm,质量采集范围2000至20000Da，源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV；延时提取,320ns；激光频率20Hz，调整总采集频次使谱图总强度大于10000；每次数据采集前，采用大肠杆菌ATCC8739质控校正仪器，使分子量误差<0.02%。

7.  如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3）所述的统计学处理包括通过设定主谱图预测MSP参数，质量偏差小于0.02%、信噪比大于3、峰出现频率最小值25%，最多峰数目70，每个浓度的标准由20张谱图构建标准参考谱；并由MSP内置的统计学功能提取特征蛋白。

8.  用于致病性钩端螺旋体检测的试剂盒，其特征在于，含有以下特征蛋白质荷比的图谱：
23个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9。

9.  用于非致病性钩端螺旋体检测的试剂盒，其特征在于，含有以下特征蛋白质荷比的图谱：
19个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3。

10.  如权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，还含有:
1）菌体洗涤液A：其1L配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mL，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；
2）菌体洗涤液B：18.2兆欧超纯水；
3）菌体洗涤液C：100%色谱级乙醇；
4）蛋白提取液A：70%色谱级甲酸；
5）蛋白提取液B：色谱级乙腈；
6）基质：α-氰基-4羟基肉桂酸，基质溶解液：50%18.2兆欧超纯水，50%色谱级乙腈，2.5%色谱级三氟乙酸。

说明书

说明书钩端螺旋体快速质谱检测试剂盒
技术领域
本发明涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域，具体地，涉及用于检测钩端螺旋体的质谱模型以及基于该质谱模型进行致病性检测的试剂盒。
背景技术
钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体（Leptospira）引起的一种分布广泛的人兽共患病，其流行几乎遍及全世界，在东南亚地区尤为严重，且一年四季均可发病。钩端螺旋体属于螺旋体目螺旋体科钩端螺旋体属，下分为两个种：问号钩端螺旋体（致病性）和双曲钩端螺旋体（非致病性）。钩端螺旋体病是全身性感染疾病，重者可出现急性炎症性肝损伤、肾损伤的症状如黄疸、出血、尿毒症等，也可出现脑膜的炎性症状如神志障碍和脑膜刺激征等；严重病人可出现肝、肾功能衰竭、肺大出血而导致死亡。钩端螺旋体病作为一种严重人畜共患传染病,已成为我国重要的公共卫生问题之一。在我国，钩端螺旋体病被列为乙类传染病。
致病性钩端螺旋体是导致钩端螺旋体病的元凶。钩端螺旋体致病性检测的金标准是传统的血清学方法。但其操作程序繁琐，实验技术要求较高，需要保存大量的国际、国内参考菌株，同时，实验中需要采用不同血清型抗原来免疫实验动物以制备免疫血清，如果操作不当还将导致抗体效价滴度的迅速降低，影响最终实验结果的判断，如此繁琐的操作程序，普通的实验室实难开展，国内、国际上也只有个别的参比实验室可以开展该项工作。因此，目前作为金标准的传统血清学分类方法很受限制，这也对日常钩体病疫情的监测、预防控制造成很大的影响。以16SrDNA为代表的分子生物学方法可对钩端螺旋体致病性进行鉴定，但需要提取DNA，进行基因测序，费力耗时。因此迫切需要一种更加快速，可靠，高通量的鉴定方法来应对钩端螺旋体病临床诊断与疫情控制。
基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）方法是近年来出现的用于病原识别的方法，许多国家的科研人员对该方法进行了验证，均表明MALDI-TOF MS满足现代传染病快速诊断的所有要求：快速、准确、易操作、廉价、高通量。目前商业化的用于质谱的微生物鉴定系统有德国布鲁克公司的Biotyer系统及生物梅里埃公司的Saramis系统。但这两套商业化的数据库内均没有钩端螺旋体的标准肽谱，无法识别钩端螺旋体，更无法鉴定致病性。
发明内容
本发明的目的是为了克服目前致病性钩端螺旋体检测技术的不足，提供一种基于质谱技术的用于快速鉴定致病性、非致病性钩端螺旋体的特征蛋白谱模型。
本发明的另一目的是提供检测致病性和/或非致病性钩端螺旋体的试剂盒。
本发明提供的用于钩端螺旋体检测的特征蛋白质谱模型，含有以下两组钩端螺旋体特征蛋白，
1）23个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9；
2）19个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3。
进一步，本发明提供了上述质谱模型在制备钩端螺旋体致病性检测试剂盒中的应用。
本发明提供了一种检测钩端螺旋体致病性的质谱模型的制备方法，包括以下步骤：
1）制备致病性钩端螺旋体和非致病性钩端螺旋体蛋白样品：收集液体培养至对数生长期的钩端螺旋体菌株，离心，弃上清；将沉淀用菌体洗涤液A洗涤，离心，弃上清；沉淀菌体用菌体洗涤液B和C混合后洗涤，高速离心，弃上清洗涤液；将沉淀菌体加入蛋白提取液A和B进行抽提，高速离心，取上清；
2）将上述待检钩端螺旋体蛋白样品分别上质谱仪样品靶，采集2000-20000Da范围内的肽图谱；设定参数，对蛋白质指纹图谱进行标准化处理；
3）对所得数据进行统计学处理，得到具有统计学意义的钩端螺旋体特征蛋白，其中，致病性钩端螺旋体特征蛋白质荷比分别为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9；
将上述23个特征蛋白作为检测致病性钩端螺旋体的质谱模型；
其中，非致病性钩端螺旋体特征蛋白质荷比为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3；
将上述19个特征蛋白作为检测非致病性钩端螺旋体的质谱模型。
其中，步骤1）所述菌体洗涤液A配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mL，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；所述菌体洗涤液B为18.2兆欧超纯水，所述菌体洗涤液C为100%色谱级乙醇；所述蛋白提取液A为70%色谱级甲酸，所述蛋白提取液B为色谱级乙腈。
其中，步骤1）中所述的离心，其参数为12000g，5min；所述的高速离心，其参数为16000g，2min。
步骤2）将蛋白样品上质谱仪样品靶，样品干燥后，按体积比1:1在样品上覆盖基质，所述基质为α-氢基-4-羟基肉桂酸在50%乙腈、2.5%三氟乙酸中的饱和液。
步骤2）中质谱仪为MALDI-TOF质谱仪，氮激光器波长377nm,质量采集范围2000至20000Da，源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV；延时提取,320ns；激光频率20Hz，调整总采集频次使谱图总强度大于10000；每次数据采集前，采用大肠杆菌ATCC8739质控校正仪器，使分子量误差<0.02%。
步骤2）所述的标准化处理包括归一化、基线修正、平滑、去噪、峰筛选，具体参数如下：最大范方法数标准化，Savitsky-Golay平滑,帧幅25Da;基线修正采用Multipolygon法，5个搜索窗口，执行数目2；最大峰数100，阈值0.001，最小信噪比3；
步骤3）所述的统计学处理包括通过设定MSP参数，质量偏差小于0.02%、信噪比大于3、峰出现频率最小值25%，最多峰数目70，构建质谱模型的钩端螺旋体每个样本由20张谱图构建标准参考谱；并由MSP内置的统计学功能提取特征蛋白。
本发明提供了用于致病性钩端螺旋体检测的试剂盒，含有以下特征蛋白质荷比的图谱：
23个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9。
本发明提供了用于非致病性钩端螺旋体检测的试剂盒，含有以下特征蛋白质荷比的图谱：
19个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5， 7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3。
进一步地，本发明还提供了用于钩端螺旋体检测的试剂盒，含有：含有以下两组特征蛋白质荷比的图谱：
（1）23个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9；
（2）19个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3。
本发明提供的上述试剂盒中，还含有：
1）菌体洗涤液A：其1L配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mL，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；
2）菌体洗涤液B：18.2兆欧超纯水；
3）菌体洗涤液C：100%色谱级乙醇；
4）蛋白提取液A：70%色谱级甲酸；
5）蛋白提取液B：色谱级乙腈；
6）基质：α-氰基-4羟基肉桂酸，基质溶解液：50%18.2兆欧超纯水，50%色谱级乙腈，2.5%色谱级三氟乙酸。
进一步地，本发明的上述试剂盒，其工作步骤为：
1）制备待测钩端螺旋体蛋白样品：收集液体培养至对数生长期的钩端螺旋体菌株，12000g离心5min，弃上清；将沉淀用菌体洗涤液A洗涤，12000g离心5min，弃上清；沉淀菌体用菌体洗涤液B和C混合后洗涤，16000g离心2min，弃上清洗涤液；将沉淀菌体加入蛋白提取液A和B进行抽提，16000g离心2min，高速离心，取上清；
2）将上述待检钩端螺旋体蛋白样品分别上质谱仪样品靶，采集2000-20000Da范围内的肽图谱；肽图谱结果与权利要求1所述质谱模型的图谱进行比对，若得到的蛋白质谱图中含有以下23个特征蛋白的质荷比：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9中的至少15个，则待测钩端螺旋体为致病性钩端螺旋体。
若得到的蛋白质谱图中含有以下19个特征蛋白的质荷比：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3中的至少12个，则待测钩端螺旋体为非致病性钩端螺旋体。
在应用本发明试剂盒进行钩端螺旋体致病性检测的操作中，待测的钩端螺旋体可以是液体培养，也可以固体培养。
本发明采用钩端螺旋体ATCC国际标准株构建了钩端螺旋体参考谱库，从而构建了钩端螺旋体特征蛋白的质谱模型，在此基础上开发的检测试剂盒能快速准确地对临床分离的钩端螺旋体进行致病性检测。采用本发明的方法，样品经预提取处理后，菌体全部死亡，可在普通分子生物学实验室进行操作，消除了对人员及环境的危害。
利用本发明检测了35份钩端螺旋体样本，检测结果显示，35份样本中28份致病性钩端螺旋体、7份非致病性钩端螺旋体全部被准确检出，检出率（敏感性）达100%，特异性为100%。与钩端螺旋体致病性的其它检测方法比较，本发明在2小时内可完成96个样本的检测、每个样本检测成本为一元人民币，相对于目前使用的核酸检测技术单个样本几个小时及十元以上的成本，极大地节省了检测时间及检测成本，真正意义上实现了高通量、快速、经济的理想病原检测标准，完全适用于临床确诊、疾病监测、流行病学调查、公共卫生应急处理，具有十分重要的现实意义。
附图说明
图1为样本前处理优化肽谱图，其中A为菌株56603未经菌体洗涤预提取蛋白的肽谱图；B为菌株56603经过菌体洗涤预提取蛋白的肽谱图；图中，横坐标为质荷比，纵坐标为相对强度。
图2为部分钩端螺旋体2000～20000Da范围内肽质量图谱；图中横坐标为质荷比，纵坐标为相对强度；57602、56601、57616为模型构建样本；57607、57622、56607、7751、J1为模型验证样本。
图3为钩端螺旋体基于肽质量谱的聚类图；图中星标致病性钩端螺旋体、非致病性钩端螺旋体分别是本发明特异蛋白构建的模拟致病性钩端螺旋体及非致病性钩端螺旋体参考谱。
图4～图7为部分致病性钩端螺旋体与质谱模型匹配图。图中横坐标为质荷比，纵坐标为相对强度，*表示匹配峰；致病性钩体样本标号依次为7751、8202、9069、9075；各图上部为致病性钩体样本实际质谱检测峰；下部为本发明所构建的特征蛋白峰值质谱模型，从左至右峰值依次为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9。
图8～图11为部分非致病性钩端螺旋体与质谱模型匹配图；图中横坐标为质荷比，纵坐标为相对强度，*表示匹配峰；非致病性钩体样本标号依次为57607、57614、57621、57622；各图上部为非致病性钩体样本实际质谱检测峰；下部为本发明所构建的特征蛋白质谱模型，从左至右峰值依次为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的试剂为市售。
实施例1液体培养钩端螺旋体样本前处理优化
由于液体培养基成分复杂，有众多影响质谱谱图质量的因素，因此样本在菌体蛋白提取前培养基成分的有效去除非常关键。菌体的洗涤是有效降低培养基成分影响的有效途径。
本实施例所用的菌体洗涤液A配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mL，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌。
细菌主要洗涤步骤是通过菌体洗涤液A完成的，本实施例分别将钩端螺旋体不经过洗涤液A洗涤，经洗涤液A洗涤1次进行肽指纹图谱分析，每次洗涤后需12000g，离心5min。
（1）不洗涤菌体直接离心处理，谱图采集困难（激光强度需提高50%，谱图叠加数量增加100%），信号噪音大，峰数目少。信噪比6以上的峰数目不超过10个，不能用于致病性鉴定（图1中的A）；
（2）洗涤1次后离心处理，谱图采集顺利，且信噪比、分辨率均满足需求，可获得理想的肽质量指纹图谱，信噪比6以上的峰数目超过100，没有离子及血清等杂信号的影响，可以用于致病性鉴定（图1中的B）；
因此，液体培养的细菌，采用洗涤一次后预提取蛋白，即可完全可以达到质谱检测的要求。
实施例2钩端螺旋体质谱模型的构建
1、样本和仪器
采用致病性钩端螺旋体43株，非致病性钩端螺旋体22株，各随机抽取15株ATCC国际标准株用于构建质谱模型（表1）。其余35株用于模型测试。所有菌株都已采用G1/G2、B64-I/B64-II作为引物的PCR及16SrRNA进行致病性确认。
表1.模型构建菌株列表

2、菌体预处理
分别取5mL培养至对数生长期的钩端螺旋体菌悬液，12000g离心5min，弃上层液体培养基；菌体沉淀用菌体洗涤液A洗涤后12000g，离心5min，弃上清；菌体沉淀加入200μL菌体洗涤液B，混匀，加入600μL菌体洗涤液C，混匀；16000g，离心2min，弃上清。加入50μL蛋白提取液A，混匀，再加入50μL蛋白提取液B，混匀，16000g离心2min，上清液体即为制备好的蛋白样品，用于后续质谱检测。
菌体洗涤液A配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mL，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；菌体洗涤液B为18.2兆欧超纯水，菌体洗涤液C为100%色谱级乙醇；所述蛋白提取液A为70%色谱级甲酸，所述蛋白提取液B为色谱级乙腈。
3、质谱数据采集
取1μL蛋白样品点于样品靶上，干燥后，覆盖1μL基质(α-氢基-4-羟基肉桂酸饱和液，基质溶解液：50%18.2兆欧超纯水，50%乙腈，2.5%三氟乙酸)，放干后采集数据，模型构建菌株每个样本采集20张谱图。
基质辅助激光解析飞行时间质谱为美国布鲁克公司的MicroflexLT。数据采集采用布鲁克公司的FlexControlTM(version3.0)软件。采集的质量范围为2000-20000Da，参数设定为：源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV;延时提取,320ns;激光频率,20.0Hz.80shots采集一个样品结晶点，平均每个样本结晶点收集8次，共计640shots形成一张谱图。采用大肠杆菌ATCC8739做为仪器校正用标准品，校正后分子量平均偏差小于200ppm。
4、特征蛋白质谱模型构建
部分钩端螺旋体原始谱图参见图2。采用布鲁克Biotyper标准处理方法(version1.5)处理原始谱图，对谱图进行基线校正、平滑、去噪、峰筛选，具体参数如下：最大范方法数标准化，Savitsky-Golay平滑,帧幅25Da;基线修正采用Multipolygon法，5个搜索窗口，执行数目2；最大峰数100，阈值0.001，最小信噪比3。采用Biotyper2.0的MSP功能分别对致病性和非致病性建模菌株构建的共性参考谱，并加入到Biotyper MSP数据库。采用MSP创建功能构建特异肽谱系列。参数如下：MSP质量偏差,200；信噪比大于3，峰出现频率最小值,25%; MSP最大峰数目:70。
对所得数据采用MSP内置的统计学功能进行统计学处理，致病性钩端螺旋体，存在23个特征蛋白，其质荷比分别为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9。MSP分析显示至少15个特征蛋白质，即可正确判定致病性钩端螺旋体。
非致病性钩端螺旋体，存在19个特征蛋白，其质荷比分别为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3。MSP分析显示至少12个特征蛋白质，即可正确判定非致病性钩端螺旋体。
实施例3钩端螺旋体质谱模型验证
灵敏度（sensitivity），又称真阳性率（true positive rate），即实际上是该病原并按照该检测方法的标准被正确地判为该病原体的百分比。特异度（specificity），又称真阴性率（true negative rate），即实际上不是该病原体而按照该检测方法的标准被正确地判为该病原体的百分比。
应用实施例2所构建的致病性与非致病性钩端螺旋体特征蛋白质谱模型，对35例菌株，其中14株ATCC国际标准株，21株临床分离株，菌株名称见表2，*标识的菌株为ATCC菌株。进行检测分析。检测步骤为：
1）35份钩端螺旋体菌株样本，分别取5mL培养至对数生长期的菌体悬液，12000g离心5min，弃上层液体培养基；菌体沉淀用菌体洗涤液A洗涤后12000g，离心5min，弃上清；菌体沉淀加入200μL菌体洗涤液B，混匀，加入600μL菌体洗涤液C，混匀；16000g，离心2min，弃上清。加入50μL蛋白提取液A，混匀，再加入50μL蛋白提取液B，混匀，16000g离心2min，上清液体即为制备好的蛋白样品，用于后续质谱检测。
菌体洗涤液A配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mL，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；菌体洗涤液B为18.2兆欧超纯水，菌体洗涤液C为100%色谱级乙醇；所述蛋白提取液A为70%色谱级甲酸，所述蛋白提取液B为色谱级乙腈。
2）取1μL蛋白样品点于样品靶上，干燥后，覆盖1μL基质(α-氢基-4-羟基肉桂酸饱和液，基质溶解液：50%18.2兆欧超纯水，50%乙腈，2.5%三氟乙酸)，放干后采集数据，每个样本采集3张谱图。
基质辅助激光解析飞行时间质谱为美国布鲁克公司的Microflex LT。数据采集采用布鲁克公司的FlexControlTM(version3.0)软件。采集的质量范围为2000-20000Da，参数设定为：源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV;延时提取,320ns;激光频率,20.0Hz.80shots采集一个样品结晶点，平均每个样本结晶点收集8次，共计640shots形成一张谱图。采用大肠杆菌ATCC8739做为仪器校正用标准品，校正后分子量平均偏差小于200ppm。
3）采用布鲁克Biotyper标准处理方法(version1.5)处理原始谱图，对谱图进行基线校正、平滑、去噪；得到的蛋白质谱图与本发明构建的特征蛋白质谱模型进行比对（23个致病性钩端螺旋体特征蛋白，其质荷比分别为：3209.1，3715.6，4279.9，5262.6，5656.5，5777.5，5802.8，6008.7，6189.0，6215.6，6280.5，6350.9，6994.4，7066.1，7432.1，8057.9，8252.7，8734.3，9909.4，10100.5，10274.9，10520.73，11307.9；19个非致病性钩端螺旋体特征蛋白，其质荷比分别为：4389.3，5442.3，5690.3，5731.6，6003.5，6203.8，6392.6，6697.9，7192.2，7224.1，7289.5，7321.9，7368.7，7390.7，8088.1，8417.6，9571.3，11830.0，11876.3），结果显示，28份致病性钩端螺旋体、7份非致病性钩端螺旋体均被正确识别，与G1/G2、B64-I/B64-II两对引物的PCR及16SrRNA结果一致。采用肽质纹谱进行的聚类分析明确地显示基于肽质量谱可将致病性钩端螺旋体及非致病性钩端螺旋体精确地分开,且用本发明的特异性模型蛋白构建的参考谱与其相应的致病性与非致病性完全符合(图3)。部分钩端螺旋体原始谱图参见图2。35例验证样本的与上述模型特征蛋白的匹配情况如表2、图4～图11所示。
表2钩端螺旋体菌株样本质谱模型鉴定结果

本方法检测的致病性与非致病性钩端螺旋体准确率高，检测结果与现有的鉴定方法结果一致率为100%。可见，采用本发明的方法检测钩端螺旋体菌株样本的致病性，灵敏度（准确率）为100%。
采用本发明的特征蛋白通过Biotyper MSP功能构建模拟谱图，并与Biotyper原有1600余种的3995个参考谱（不含钩端螺旋体）进行比对，没有非特异性的错误匹配，表明本发明提供的特征蛋白为致病性与非致病性钩端螺旋体所特有。同时，将验证的35个样本谱图与Biotyper的3995个参考谱进行比对，没有非特异性的错误匹配。可见，采用本发明的方法检测钩端螺旋体致病性特异性为100%。
另外,本发明同时构建了致病性、非致病性钩端螺旋体的质谱模型，参见实施例2构建得到的致病性钩端螺旋体的质谱模型的23个特征蛋白质荷比和非致病性钩端螺旋体的19个特征蛋白质荷比，如待测样本质谱峰值与本发明构建的致病性钩端螺旋体质谱模型中的23个特征蛋白匹配个数少于15个,只表明样本不是致病性钩端螺旋体,必须与非致病性钩体质谱模型中的19个特征蛋白进行匹配，若匹配的特征蛋白个数不少于12个，才能确定其为非致病性钩端螺旋体,反之亦然。这种方法可完全避免非钩端螺旋体样本的假阳性识别。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。