对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及制备方法 技术领域 本发明涉及对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及其制备方法， 特别是涉 及用于检测生物组织中的淀粉样蛋白的试剂， 其可以在全身性淀粉样变性病和其他与淀粉 样蛋白蓄积有关的疾病的诊断中用于检测病灶部位中的淀粉样蛋白。
背景技术 由被称作淀粉样蛋白的纤维状蛋白质在体内各种器官或组织中沉积而引发的疾 病统称作淀粉样变性病。淀粉样变性病的共同特征是， 富含 β- 折叠结构的被称作淀粉样 蛋白的纤维状蛋白质在各种器官中系统性地或在位点局部性地沉积， 以至于在器官或组织 中触发了功能异常。 淀粉样蛋白一般是指生物体内各种淀粉样蛋白的前体蛋白例如淀粉样 蛋白 -β、 突变型转甲状腺素蛋白和 β2- 微球蛋白聚集形成的蛋白凝聚物。淀粉样蛋白尽 管是由任意的淀粉样蛋白的前体蛋白形成的， 但是它们具有富含 β- 折叠的特征性结构。 因此， 能与 β- 折叠结构结合的化合物例如刚果红和硫磺素 T 的特征在于， 它们与淀粉样蛋 白具有亲和性。
根据淀粉样蛋白的沉积模式， 淀粉样变性病分为全身性淀粉样变性病和局限性淀 粉样变性病。
全身性淀粉样变性病是淀粉样蛋白沉积发生在全身各个部分的疾病。 全身性淀粉 样变性病的例子包括 ： 家族性淀粉样变性病 ( 其中肝脏内产生的淀粉样蛋白沉积在全身的 各个器官而导致疾病 )、 老年性 TTR 淀粉样变性病 ( 其中淀粉样蛋白沉积在心脏和大关节 例如手关节中 )、 透析性淀粉样变性病 ( 发生在长期透析患者的骨和关节等部位 )、 反应性 AA 淀粉样变性病 ( 继发性淀粉样变性病， 是由血清淀粉样蛋白 A 产生的淀粉样蛋白沉积导 致的， 所述血清淀粉样蛋白 A 是慢性炎性疾病例如慢性风湿病之后继发的急性期蛋白 )、 和 免疫细胞性淀粉样变性病 ( 其中由免疫球蛋白产生的淀粉样蛋白沉积在全身的各个器官 中 )。
局限性淀粉样变性病是淀粉样蛋白沉积仅发生在某些器官中的疾病。 局限性淀粉 样变性病的例子包括 ： 脑淀粉样变性病例如阿尔茨海默病 ( 其中淀粉样蛋白沉积在脑中 )、 脑血管淀粉样变性病和克雅病、 内分泌淀粉样变性病 ( 其中淀粉样蛋白沉积在伴随 I I 型 糖尿病的胰岛和胰岛素瘤中、 或者沉积在心房中 )、 皮肤淀粉样变性病 ( 其中淀粉样蛋白 沉积在皮肤中 )、 和局限性结节性淀粉样变性病 ( 其中结节状淀粉样蛋白沉积在皮肤和肺 中 )。
在全身性淀粉样变性病的情况下， 如下进行淀粉样变性病的诊断 ： 首先从皮肤、 肾 和胃肠道等可活组织检查的部位采集组织 ； 并且用刚果红或硫磺素 T 将其染色。刚果红是 一种对淀粉样蛋白的 β- 折叠结构具有高度亲和性的荧光性化合物， 刚果红由于其定向性 而在偏光显微镜下显示双折射， 因此它可以选择性地染色组织中的淀粉样蛋白沉积物。同 样地， 硫磺素 T 也是对淀粉样蛋白具有亲和性的荧光性化合物， 并可与刚果红同样地使用。 在发现组织染色呈阳性后， 组合利用抗体的免疫染色， 进行确诊。然而， 用刚果红或硫磺素
T 染色即使是在偏光显微镜下观察也往往难以判定为阳性。
另一方面， 人们考虑用近年来广泛发展的图像诊断装置例如 PET、 SPECT 和 MRI 来 进行全身性淀粉样变性病的图像诊断。
然而， 当刚果红和硫磺素 T 是被标记的、 并且用作图像诊断的探针时， 它们的存在 问题是， 与淀粉样蛋白的结合特异性较差， 以至于不能获得良好的检测灵敏度。
此外， 由于刚果红具有致癌性， 它不适用于人体的诊断。
因此， 已经提出， 将作为刚果红衍生物的双 -(3- 羟基羰基 -4- 羟基 ) 苯乙烯基苯 (BSB) 及其衍生物用作检测淀粉样蛋白的荧光试剂， 它对全身性淀粉样蛋白具有高度的亲 和性和检测灵敏度， 可以用于体内检测 ( 非专利文献 14， 专利文献 7)。据报道， BSB 与由脑 淀粉样变性病和全身性淀粉样变性病产生的淀粉样蛋白具有高度亲和性， 并且其结构中没 有联苯胺结构， 因此它几乎不存在致癌问题， 并且可以是放射性标记的， 用作图像诊断的探 针。
另一方面， 对于作为典型的脑淀粉样变性病的阿尔茨海默病 ( 以下称作 AD)， 因为 不能采集活检标本， 因此已经尝试使用与淀粉样蛋白具有高度亲和性的化合物作为标记物 来在体内检测 AD。 用于脑内淀粉样蛋白的图像诊断的这样的探针大多是疏水性的低分子量化合 物， 其与淀粉样蛋白具有高度的亲和性， 且脑转移性很高， 并且用各种放射性核素例如 11C、 18 11 F 和 123I 标记。例如， 有报告指出， C 或放射性卤素标记的化合物包括各硫磺素衍生 物例如 6- 碘 -2-[4 ′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 苯并噻唑 ( 以下称作 TZDM) 和 6- 羟 基 -2-[4′ -(N- 甲基氨基 ) 苯基 ] 苯并噻唑 ( 以下称作 6-OH-BTA-1)( 专利文献 1， 非专利文 献 3) ； 均二苯乙烯化合物例如 (E)-4- 甲基氨基 -4′ - 羟基均二苯乙烯 ( 以下称作 SB-13) 和 (E)-4- 二甲基氨基 -4′ - 碘代均二苯乙烯 ( 以下称作 m-I-SB)( 专利文献 2， 非专利文献 4， 非专利文献 5) ； 苯并噁唑衍生物例如 6- 碘 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 苯并噁 唑 ( 以下称作 IBOX) 和 6-[2-( 氟 ) 乙氧基 ]-2-[2-(2- 二甲基氨基噻唑 -5- 基 ) 乙烯基 ] 苯并噁唑 ( 非专利文献 6， 非专利文献 7) ； DDNP 衍生物例如 2-(1-{6-[(2- 氟乙基 )( 甲基 ) 氨基 ]-2- 萘基 } 亚乙基 ) 丙二腈 ( 以下称作 FDDNP)( 专利文献 4， 非专利文献 8) ； 和咪唑 并吡啶衍生物例如 6- 碘 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ]- 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 以 下称作 IMPY)( 专利文献 3， 非专利文献 9)。此外， 对用于图像诊断的某些探针， 已经进行了 人体图像研究， 并且报道了与正常人相比， 在 AD 患者的脑中有显著的放射性蓄积 ( 非专利 文献 10， 非专利文献 11， 非专利文献 12， 非专利文献 13)。
国际公开 WO2007/002540 号小册子公开了一系列具有与淀粉样蛋白有亲和性的 基团的化合物， 该基团通过乙二醇或聚乙二醇与放射性核素标记的位点连接 ( 专利文献 5)。
国际公开 WO2007/063946 号小册子公开了一系列化合物， 其与五元芳香杂环基相 连以防止它们在脑内代谢 ( 专利文献 6)。
[ 专利文献 1]JP-T-2004-506723
[ 专利文献 2]JP-T-2005-504055
[ 专利文献 3]JP-T-2005-512945
[ 专利文献 4]JP-T-2002-523383
[ 专利文献 5] 国际公开 WO2007/002540 小册子
[ 专利文献 6] 国际公开 WO2007/063946 小册子
[ 专利文献 7] 国际公开 WO2005/016888 小册子
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[ 非专利文献 13]Christopher M.Clark 等人， “Imaging Amyloidwith I123 IMPY SPECT” ， Alzheimer′ s & Dementia ： The Journal ofthe Alzheimer′ s Association， 2006， 2， Sup.1， S342
[ 非专利文献 14]D.M.Skovronsky 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.， 2000， 97， 7609发明内容 发明要解决的课题
如上所述， 公开了各种化合物可以作为以淀粉样蛋白为对象的图像诊断的探针， 并探索了其临床用途。
在正常小鼠中的实验结果表明， 用 [125I] 标记的 TZDM、 IBOX 和 m-I-SB 都会在施 用 2 分钟后转移到脑内。但是， 这些化合物从正常组织中的清除是不充分的， 并且会随着施 用后时间的推移而在脑中逐渐蓄积 (JP-T-2005-512945 ； Zhi-Ping Zhuang 等人， Nuclear Medicine and Biology， 2001， 28， p.887-894 ； H.F.Kung 等人， J.Am.Chem.Soc.， 2001， 123， p.12740-12741)。 当从正常组织中的清除不充分时， 就出现了一个问题 ： 在淀粉样蛋白蓄积 11 位点不能获得足够的对比度。用 [ C] 标记的 SB-13 在大鼠的实验中显示了其具有从正常 组织中的清除性能， 但清除速率还谈不上足够快 (Masahiro Ono 等人， Nuclear Medicine and Biology， 2003， 30， p.565-571)。
同时， 据披露， 如用 [125I] 标记的化合物的实验结果所示， 具有咪唑并吡啶骨架的 化合物例如 IMPY 具有在施用后转移到脑中并在淀粉样蛋白上蓄积的性质， 其也具有与上 述化合物不同的从正常组织中迅速消除的优良性质。但是， IMPY 是一种在回复突变试验中 呈阳性的化合物。为了将这种化合物用作图像诊断的探针， 必须充分考虑剂量和给药方式 ( 国际公开 WO 03/106439 号小册子 )。
据报道， FDDNP 在回复突变试验中也是呈阳性的。( 国际公开 WO 03/106439 号小册子 )。 靶向淀粉样蛋白的图像诊断探针优选是与淀粉样蛋白的亲和性优良并且像 IMPY 同样从正常组织中清除足够迅速， 但是又能抑制毒性例如诱变性的化合物。 但是， 还没有公 开过具有这种性质的化合物。
本发明正是鉴于上述情况而完成的， 其目的在于通过提供与淀粉样蛋白具有亲和 性并抑制毒性例如诱变性的化合物， 使得体内或体外高灵敏度地检测淀粉样蛋白成为可 能。
解决课题的方法
本发明人发现， 具有咪唑并吡啶 - 苯基骨架并且该骨架具有与羟基相连的碳原子 的特定的新化合物与淀粉样蛋白具有亲和性， 且毒性例如诱变性低， 并且通过使用一系列 这样的化合物作为探针， 在体内或体外以高灵敏度检测淀粉样蛋白。由此完成了本发明。
即， 根据本发明的一个方面， 提供了用于检测沉积在生物组织上的淀粉样蛋白的 试剂， 其包含下述式 (1) 所示的化合物 ：
或其盐。
生物组织可以是已知在淀粉样变性病中淀粉样蛋白沉积在其中的各种组织。 这些 生物组织的典型例子包括脑、 心、 肺、 胰脏、 骨和关节， 作为最典型的生物组织， 可举出脑。 在 脑为对象的情况下， 典型的淀粉样变性病包括阿尔茨海默病和 Lewy 体痴呆。
在式 (1) 中， R3 如下式所示 ：
R1 是放射性卤素取代基， m 是 0-4 的整数， n 是 0 或 1。作为放射性卤素， 可以使用 18 75 76 123 124 125 131 各种核素， 优选， 可以使用选自 F、 Br、 Br、 I、 I、 I 和 I 的卤素， 更优选地可以使用 18 123 125 选自 F、 I 和 I 的卤素。此外， 在式 (1) 中， 当 n ＝ 0 时， 优选 m ＝ 0-4， 当 n ＝ 1 时， 优 选 m ＝ 1-4。
A1， A 2， A3 和 A4 独立地表示碳或氮， 必要的是， 它们中的至少 1 个表示碳。优选地， 1 2 3 4 A， A， A 和 A 中的 3 个以上表示碳， 更优选地， 它们全部表示碳。在式 (1) 中， R3 与 A1， A2， A3 或 A4 所表示的碳键合。当 A1， A2， A3 和 A4 分别表示不与 R3 键合的碳时， 与其键合的氢原
子是未取代的。式 (1) 中所示的羟基可以与构成苯基骨架的任意碳键合， 但是优选羟基与 3 1 2 3 4 苯基骨架的 4′ - 位的碳键合。R 的键合位置可以是 A ， A， A 或 A 中的任一个， 只要它是 3 碳即可， 但是优选是 A 所表示的碳， 即， 是 6- 位的碳。
上式 (1) 的化合物是新化合物， 根据本发明的另一个方面， 提供一种放射性卤素 标记的有机化合物的制备方法， 其包括 ：
制备反应溶液的步骤， 所述反应溶液包含下式 (2) 所示的化合物或其盐与放射性 卤离子 ：
其中， A1， A2， A3 和 A4 独立地表示碳或氮， R4 是下式所表示的基团 ：m 是 0-4 的整数，
n 是 0 或 1 的整数， 且 2
当 m ＝ n ＝ 0 时， R 是非放射性卤素取代基、 硝基取代基、 具有 3-12 个碳原子的三 烷基铵取代基、 具有 3-12 个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基， 当 2 m ≠ 0 和 / 或 n ≠ 0 时， R 是非放射性卤素取代基、 甲磺酰氧基取代基、 三氟甲磺酰氧基取 代基或芳香族磺酰氧基取代基，
条件是， A 1， A2， A3 和 A4 中的至少 1 个表示碳， R4 与 A1， A 2， A3 或 A4 所表示的碳键合，
和 向上述反应溶液赋予反应条件， 以合成下式 (1) 所示的化合物或其盐的步骤 ：
其中 A1， A2， A3 和 A4 与式 (2) 中相同， R3 是下式所表示的基团 ：
R1 是放射性卤素取代基， m 和 n 与式 (2) 中相同， 条件是， A 1， A2， A3 和 A4 中的至少 1 个表示碳， R3 与 A1， A 2， A3 或 A4 所表示的碳键合，在式 (2) 中， A 1， A2， A3 和 A4 独立地表示碳或氮， 必要的是， 它们中的至少 1 个表示 1 2 3 4 碳。优选地， A， A， A 和 A 中的 3 个以上表示碳， 更优选地， 它们全部表示碳。在式 (2) 中， 4 1 2 3 4 1 2 3 4 R 与A， A， A 或 A 所表示的碳键合。当 A ， A， A 和 A 分别表示不与 R4 键合的碳时， 与其 键合的氢原子是未取代的。式 (2) 中所示的羟基可以与构成苯基骨架的任意碳键合， 但是 4 1 优选羟基与苯基骨架的 4′ - 位的碳键合。R 的键合位置没有特别限制， 只要它是 A ， A2， A3 或 A4 所表示的碳即可， 但是优选是 A3 所表示的碳， 即， 是 6- 位的碳。
进行制备包含上式 (2) 所示的前体化合物或其盐和放射性卤离子的反应溶液的 步骤， 例如， 包括将该前体化合物或其盐溶解于惰性有机溶剂， 并向其中加入由已知方法获 得的包含放射性卤离子的溶液。
作为惰性有机溶剂， 可以使用与该前体化合物或其盐和放射性卤离子不具有反应 性的各种溶剂， 例如， 当所使用的放射性卤离子是放射性碘时， 优选可以使用甲醇， 当所使 用的放射性卤离子是放射性氟时， 优选可以使用乙腈。
在合成上式 (1) 所示的化合物或其盐的步骤中， 对赋予反应溶液的反应条件没有 2 特殊限制， 只要它是允许其中式 (2) 化合物的取代基 R 与加入到该反应溶液的放射性卤离 子发生置换反应的条件即可， 可以使用适合放射性卤离子的种类的已知反应条件。
在本发明的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法中， 作为放射性卤离子， 可 18 75 76 123 124 125 131 1 以使用例如 F、 Br、 Br、 I、 I、 I 或 I。当制备其中 R 所示的放射性卤素取代基是 123 124 125 124 125 I、 I、 I 或 131I 的式 (1) 化合物时， 分别使用 123I 离子、 I 离子、 I 离子或 131I 离子作 为放射性卤离子。作为式 (2) 的化合物， 优选使用的是 ： 其中当 m ＝ n ＝ 0 时， R2 是碘、 溴、 具有 3-12 个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基的化合物， 其中当 2 2 m ≠ 0 和 / 或 n ≠ 0 时， R 是碘的化合物 ； 特别优选其中当 m ＝ n ＝ 0 时， R 是碘、 三甲基甲 锡烷基取代基、 三丁基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基取代基的化合物。
当制备其中 R1 所示的放射性卤素取代基是 18F 的式 (1) 化合物时， 使用 18F 离子作 为放射性卤离子， 作为式 (2) 的化合物， 优选使用其中当 m ＝ n ＝ 0 时， R2 是硝基取代基或具有 3-12 个碳原子的三烷基铵取代基的化合物、 和其中当 m ≠ 0 和 / 或 n ≠ 0 时， R2 是甲 磺酰氧基取代基、 三氟甲磺酰氧基取代基或芳香族磺酰氧基取代基的化合物， 特别优选当 2 m ≠ 0 和 / 或 n ≠ 0 时， R 是三氟甲磺酰氧基取代基或甲苯磺酰氧基取代基的化合物。当 1 制备其中 R 所示的放射性卤素取代基是 75Br 或 76Br 的式 (1) 化合物时， 分别使用 75Br 离子 或 76Br 离子作为放射性卤离子， 作为式 (2) 的化合物， 优选使用其中 R2 是溴的化合物。
另外， 根据本发明的另一个方面， 提供用于制备放射性卤素标记的有机化合物的 前体化合物或其盐， 该前体化合物如下式 (2) 所示 ：
其中， A1， A2， A3 和 A4 独立地表示碳或氮， R4 是下式所表示的基团 ：m 是 0-4 的整数，
n 是 0 或 1 的整数，
当 m ＝ n ＝ 0 时， R2 是非放射性卤素取代基、 硝基取代基、 具有 3-12 个碳原子的三 烷基铵取代基、 具有 3-12 个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基， 当 2 m ≠ 0 和 / 或 n ≠ 0 时， R 是非放射性卤素取代基、 甲磺酰氧基取代基、 三氟甲磺酰氧基取 代基或芳香族磺酰氧基取代基，
条件是， A 1， A2， A3 和 A4 中的至少 1 个表示碳， R4 与 A1， A 2， A3 或 A4 所表示的碳键合。
作为式 (2) 中的 R2 所示的非放射性卤素取代基， 可以使用能在使用放射性氟的亲 核取代反应中作为靶标的卤素或能在与放射性碘的同位素交换反应中作为靶标的卤素， 优 选可以使用碘、 溴或氯。作为三烷基甲锡烷基取代基， 可以使用各种取代基， 优选可以使用 2 三甲基甲锡烷基取代基和三丁基甲锡烷基取代基。在式 (2) 中， 优选的 R 选自碘、 溴、 三甲 基甲锡烷基取代基、 三丁基甲锡烷基取代基、 三氟甲磺酰氧基取代基和三苯基甲锡烷基取 代基。同时， 在式 (2) 中， 当 n ＝ 0 时， 优选 m ＝ 0-4 ； 当 n ＝ 1 时， 优选 m ＝ 1-4。
在式 (2) 中， A 1， A2， A3 和 A4 独立地表示碳或氮， 必要的是， 它们中的至少 1 个表示 1 2 3 4 碳。优选地， A， A， A 和 A 中的 3 个以上表示碳， 更优选地， 它们全部表示碳。在式 (2) 中， 4 1 2 3 4 1 2 3 4 R 与A， A， A 或 A 所表示的碳键合。当 A ， A， A 和 A 分别表示不与 R4 键合的碳时， 与其 键合的氢原子是未取代的。式 (2) 中所示的羟基可以与构成苯基骨架的任意碳键合， 但是 4 1 2 3 4 优选羟基与苯基骨架的 4′ - 位的碳键合。R 的键合位置只要是 A ， A， A 或 A 所表示的 3 碳， 就没有特殊限定。但是优选是 A 所表示的碳， 即， 6- 位的碳。
发明效果
根据本发明， 可以得到淀粉样蛋白检测试剂及其制备方法以及制备用中间体， 该 淀粉样蛋白检测试剂与淀粉样蛋白具有亲和性并且能够抑制毒性例如诱变性， 因此可用于
广泛的与淀粉样变性病有关的淀粉样蛋白的体外和体内检测。 附图说明
图 1 是 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路 图 2 是 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。 图 3 是 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。 图 4 是 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的合成路线。 图 5 是 6-(3′ - 氟丙氧基 )-2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
线。 图 6 是 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的合成路线。
图 7 是 6- 氟 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
图 8 是 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 硝基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
图 9(a) 是注射化合物 6 后的脑切片的放射自显影图， 图 9(b) 是硫磺素 T 染色的 样品的荧光显微图像 ( 注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图 )。
图 10 是 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的合成路 图 11 是 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪的合成路 图 12 是 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪的合成路线。 图 13 是 8- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
线。
线。 图 14(a) 是注射化合物 60 后的脑切片的放射自显影图， 图 14(b) 是硫磺素 T 染色 的样品的荧光显微图像 ( 注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图 )。
图 15(a) 是注射化合物 61 后的脑切片的放射自显影图， 图 15(b) 是硫磺素 T 染色 的样品的荧光显微图像 ( 注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图 )。
图 16 是显示化合物 6 与淀粉样蛋白结合能力的图。
具体实施方式
( 放射性卤素标记化合物的前体化合物的合成方法 )
下面， 以 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶为例， 描述 本发明的一个方面的用于制备放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物的合成方法。
首先， 将 4′ - 羟基苯乙酮与溴化铜反应， 制备 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1， 步 骤 1)。此时， 可以根据常规方法来进行该反应， 例如在文献 King， L.Carroll and Ostrum， G.Kenneth， Journal of Organic Chemistry， 1964， 29(12)， p.3459-3461 中所述的方法。
然后， 将上述制备的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮与 2- 氨基 -5- 溴吡啶反应， 以制备 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1， 步骤 2)。可以根据下述方法来进 行该步骤。
首先， 将 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于惰性溶剂例如乙腈中， 然后在回流温度下使它们彼此反应 2-6 小时， 以制备呈白色沉淀的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基 苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的氢溴酸盐。此时所使用的溶剂可以是乙腈或通常用于类似反 应的其他溶剂， 例如甲醇和丙酮。 反应温度可以是允许回流的温度， 例如当溶剂是乙腈时是 90℃。所使用的溶剂的量可以是足以实现反应的量， 但应当注意的是， 如果溶剂过多， 则难 以获得反应产物的沉淀。例如， 当在该反应中使用的是相当于 10mmol 量的 2- 溴 -4′ - 羟 基苯乙酮时， 所使用的溶剂的量可以是约 40-50mL。
接着， 过滤反应溶液以回收沉淀。 将该白色沉淀混悬于甲醇 / 水 (1 ∶ 1) 的混合液 中。 然后， 将饱和碳酸氢钠水溶液以相对于沉淀物非常大地过量的量加入其中， 以释放作为 沉淀的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。 将新产生的沉淀过滤， 以回收作为 本步骤目标化合物的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1， 步骤 2)。水 / 甲醇的混合液的量没有特殊限制， 只要它足以实现反应即可。 但是， 应当注意的是， 如果混 合液的量过多， 则会干扰产物的析出。例如， 当使用的是相当于 10mmol 量的 2- 溴 -4′ - 羟 基苯乙酮时， 可以使用的水 / 甲醇的混合液的量是约 40-100mL。 另外， 对碳酸氢钠的量也没 有特殊限制， 只要它相对于作为反应底物的上述沉淀为非常大地过量即可。 例如， 当在上述 条件下进行反应时， 加入到反应溶液中的饱和碳酸氢钠水溶液的量可以是约 25mL。
然后， 将上述制备的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶充分干燥， 并 溶解于二噁烷， 在加入三乙胺后， 加入双 ( 三丁基锡 ) 和催化剂量的四 ( 三苯膦 ) 钯。将该 反应混合物在约 90℃下加热， 并反应约 24 小时， 然后蒸馏除去溶剂， 进行色谱精制， 以得到 作为目标化合物的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1， 步骤 3)。此时所使用的双 ( 三丁基锡 ) 的量可以是满足相对于反应底物为过量条件的量， 具体地， 优选它的摩尔比是相对于反应底物 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡 啶的约 1.5 倍。
当获得 6- 位的取代基是三丁基甲锡烷基取代基以外的三烷基甲锡烷基取代基的 化合物时， 可以在步骤 3 中使用适合目的的各种双 ( 三烷基锡 ) 来代替双 ( 三丁基锡 )。例 如， 当合成在 6- 位具有三甲基甲锡烷基取代基作为取代基的化合物时， 可以在步骤 3 中用 双 ( 三甲基锡 ) 进行与上述同样的反应。
为了得到 6 位取代基是非放射性卤素取代基的化合物， 可以将步骤 2 获得的化合 物本身用作含有溴作为卤素取代基的化合物， 对于 6 位的卤素取代基是氟、 氯和碘的化合 物， 进行与步骤 2 相同的反应， 除了在步骤 2 中分别使用 2- 氨基 -5- 氟吡啶、 2- 氨基 -5- 氯 吡啶和 2- 氨基 -5- 碘吡啶代替 2- 氨基 -5- 溴吡啶。
为了得到 6 位上通过氧原子连接有取代基的化合物， 在步骤 2 中， 可以用 2- 氨 基 -5- 羟基吡啶代替 2- 氨基 -5- 溴吡啶来进行反应， 以合成 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 羟基 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶， 可以在碱的存在下， 将含有希望引入的取代基的溴化物与其反应。例 如， 为了获得 6 位具有 3- 氟丙氧基取代基的化合物， 可以在碳酸钾的存在下将 2-(4′ - 羟 基苯基 )-6- 羟基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶与 1- 溴 -3- 氟丙烷反应。
此外， 为了得到 6 位上通过烷基链连接有取代基的化合物， 可以进行下列操作。 例如， 对于 6 位取代基是 3 ′ - 溴丙基的化合物， 可以将步骤 2 得到的 2-(4 ′ - 羟基苯 基 )-6- 溴咪唑并 [1， 2-a] 吡啶与烯丙基三丁基锡反应， 转化成 6- 烯丙基 -2-(4 ′ - 羟 基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。然后进行硼氢化和氧化反应， 以转化成 2-(4 ′ - 羟基苯基 )-6-(3′ - 羟基丙基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。此外， 可以在三苯膦的存在下， 通过四溴甲 烷进行羟基的溴化。
除了在图 1 的步骤 2 中使用 2- 氨基 -5- 溴嘧啶代替 2- 氨基 -5- 溴吡啶以外， 根 1 2 3 4 1 据上述方法， 可以制备其中 A ， A， A 和 A 中的 A 是氮的上式 (1) 所示的化合物， 和其中 A5， A6， A7 和 A8 中的 A5 是氮的上式 (2) 所示的化合物。
除了在图 1 的步骤 2 中使用 6- 氨基 -3- 溴 -1， 2， 4- 三嗪代替 2- 氨基 -5- 溴吡啶 1 2 3 4 2 以外， 根据上述方法， 可以制备其中 A ， A， A 和 A 中的 A 和 A4 是氮的上式 (1) 所示的化合 物， 和其中 A5， A6， A7 和 A8 中的 A6 和 A8 是氮的上式 (2) 所示的化合物。
( 放射性卤素标记的有机化合物的合成方法 )
接着， 以 2-(4′ - 羟基苯基 )-6-[123I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶为例， 描述根据本发 明另一个方面的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法。
在 2-(4′ - 羟基苯基 )-6-[123I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的制备中， 首先得到作为 123 标记用的放射性卤离子的 [ I] 碘化钠溶液。可以通过例如将氙气用作靶标并暴露于质子 轰击的已知方法来获得 [123I] 放射性碘。使用已知方法将该 [123I] 放射性碘制入到 [123I] 碘化钠溶液中， 并用于标记。
然后， 将标记前体 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 123 溶解于惰性有机溶剂， 向其中加入 [ I] 碘化钠溶液、 酸和氧化剂， 使它们反应， 得到作为目 123 标化合物的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。作为溶解前体化合物的 123 惰性有机溶剂， 可以使用与标记前体和 [ I] 碘化钠之间不具有反应性的各种溶剂， 优选可 以使用甲醇。
作为酸， 可以使用各种酸， 优选盐酸。
对于氧化剂没有特殊限制， 只要它能在反应溶液中氧化碘即可， 优选过氧化氢或 过氧乙酸。所加入的氧化剂的量可以是足以在反应溶液中氧化碘的量。
用碘以外的放射性卤素标记的化合物， 可以通过用适合目的的放射性卤素标记适 合合成目的的标记前体来合成。例如， 为了合成 6-[18F] 氟丙氧基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪 唑并 [1， 2-a] 吡啶， 可以在相转移催化剂和碳酸钾的存在下， 将标记前体 2-(4′ - 羟基苯 基 )-6-(3′ - 对甲苯磺酰氧基丙氧基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶与 [18F] 氟离子反应。
( 本发明检测试剂的制备方法和使用方法 )
根据前体蛋白的种类不同， 淀粉样蛋白具有多种不同结构， 但它们的共同点是具 有 β- 折叠结构。已知以淀粉样蛋白为对象的许多染色试剂例如硫磺素 T 和刚果红靶向该 β- 折叠结构， 并且对不同种类的淀粉样蛋白具有同等的染色能力。
本发明的式 (1) 的化合物对以淀粉样蛋白 β- 蛋白 ( 下文称作 Aβ) 为前体化合 物的淀粉样蛋白具有亲和性， 并且还具有抑制已知能结合广泛的淀粉样蛋白的硫磺素 T 与 淀粉样蛋白结合的活性。
因此， 认为本发明的式 (1) 的化合物与硫磺素 T 同样， 对淀粉样蛋白的 β- 折叠结 构具有亲和性。这启示本发明式 (1) 的化合物对各种淀粉样蛋白具有相同的亲和性。
即， 本发明的淀粉样蛋白检测试剂可以与硫磺素 T 和刚果红同样地， 用于诊断全 身性淀粉样变性病和局限性淀粉样变性病。 全身性淀粉样变性病包括免疫球蛋白性淀粉样 变性病、 反应性 AA 淀粉样变性病、 家族性淀粉样变性病、 透析淀粉样变性病、 老年性淀粉样变性病等。 局限性淀粉样变性病包括脑淀粉样变性病、 内分泌淀粉样变性病、 皮肤淀粉样变 性病和局限性结节性淀粉样变性病等。
本发明的淀粉样蛋白检测试剂不仅可以用作体外活组织检查使用的试剂， 也可以 作为放射性诊断剂， 用作体内使用的试剂。
本发明的淀粉样蛋白检测试剂， 可以与其他一般公知的放射性诊断剂同样地， 配 制成将上述式 (1) 的放射性卤素标记的化合物根据期望混入任选调节至适当 pH 的水、 生理 盐水或林格液等而成的溶液。此时， 应将本发明化合物的浓度调节至不超过确保本发明化 合物稳定性的浓度。对本发明化合物的剂量没有特殊限制， 只要它足以得到所给予试剂的 123 分布图像即可。例如， 就碘 -123( I) 标记的化合物和氟 -18(18F) 标记的化合物而言， 可以 通过静脉内或局部给予约 50-600MBq/60kg 成人体重。可以通过公知方法使所给予的试剂 分布显像。例如， 可以通过该柱 PECT 装置使碘 -123(123I) 标记的化合物显像， 另外可以通 18 过 PET 装置使氟 -18( F) 标记的化合物显像。
通过对生物体给予本发明的淀粉样蛋白检测试剂， 可以使沉积在生物组织例如 脑、 心脏、 肺、 消化道、 血管、 肝、 胰脏、 肾、 关节和骨中的淀粉样蛋白显像， 并且用于使难以活 检采集的生物组织例如脑、 心脏、 肺、 胰脏、 骨和关节中的淀粉样蛋白沉积显像。 实施例 以下， 通过实施例、 比较例和参考例更详细地描述本发明。然而， 以下的例子决不 限制本发明的范围。
在以下实施例中， 用于实验的各化合物的名称如表 1-1 中所定义。
表1： 实施例中使用的评价化合物的化合物名称
化合物名 化合物 1 化合物 2 化合物 3 化合物 4 化合物 5 化合物 6 化合物 7 化合物 8通用名 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 6-(3′ - 氟丙氧基 )-2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 [125I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 [123I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪化合物 9 化合物 10 化合物 11
[123I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 [123I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪 [123I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-8- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶( 实施例 I-1)6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成 将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中加入 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 从乙 酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1， 步骤 1)。
将 2.15g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 1.74g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于 50mL 乙腈中。 将所得溶液在油浴中在 105℃下加热 回流 6 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减 压干燥。将所得粗结晶混悬在 20mL 水和 20mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中加入约 25mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 2.41g( 相当于 8.32mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1， 步骤 2)。
将 138mg( 相当于 0.476mmol) 的 6- 溴 -2-(4 ′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡 啶溶解于 20mL 的二噁烷中， 向其中加入 2mL 的三乙胺。然后， 向其中加入 360μL( 相当于 0.713mmol) 的双 ( 三丁基锡 ) 和 20mg( 催化剂量 ) 的四 ( 三苯膦 ) 钯。在将反应混合物在 90℃下搅拌 22 小时后， 减压蒸馏除去溶剂。通过制备型 TLC( 洗脱溶剂 ： 己烷 / 乙酸乙酯＝ 1/4) 精制残余物， 再通过再循环制备型 HPLC(HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工业公 司制 ) ； 色谱柱 ： 2 根 JAIGEL 2H( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 ) 精制 所得粗产物， 得到 47mg( 相当于 94.9μmol) 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪 唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1， 步骤 3)。
所得 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结 果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -dl， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.01-7.94(m， 1H)， 7.71-7.67(m， 2H) ， 7.70-7.67(m ， 1H) ， 7.64-7.60(m ， 1H) ， 7.20-7.11(m ， 1H) ， 6.89-6.85(m ， 2H) ， 1.62-1.46(m， 6H)， 1.34(sext， J ＝ 7.3Hz， 6H)， 1.18-1.03(m， 6H)， 0.90(t， J ＝ 7.3Hz， 9H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -dl， 共振频率 ： 125MHz) ： δ157.85， 145.11， 144.72， 131.90， 129.93， 127.62， 124.02， 122.59， 116.14， 116.09， 106.19， 28.96， 27.27， 13.62， 9.81。 125
( 实施例 I-2)[ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
向 53μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的甲 125 醇溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加入 75μL 的 1mol/L 盐酸， 136MBq 的 [ I] 碘化钠 ( 体积为 40μL) 和 10μL 的 10％ (W/V) 过氧化氢。将该混合液在 50℃下静置 10 分钟后， 在下述条 125 件下将该溶液进行 HPLC， 以获得 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶级 分。
HPLC 条件 ：
色谱柱 ： Phenomenex Luna C18( 商品名 ； 由 Phenomenex 公司制 ； 规格 ： 4.6x150mm)
流动相 ： 含 0.1％三氟乙酸的水 / 含 0.1％三氟乙酸的乙腈＝ 80/20 → 0/100(17 分钟， 线性梯度 )
流速 ： 1.0mL/ 分钟
检测器 ： 紫外可见吸光光度计 ( 检测波长 ： 282nm) 和放射性计数器 (Raytest 公司 制； 型号 ： STEFFI)
将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收 125 集 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 125 乙醇通过， 以洗脱 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。在合成刚结束 时， 所得化合物的放射性活度是 37.5MBq。此外， 在下述条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合 物的放射化学纯度是 96.5％。
TLC 分析条件 ：
TLC 板 ： RP-18F254( 商品名 ； 由默克公司制 )
流动相 ： 甲醇 / 水＝ 20/1
检测器 ： 生物图像分析仪， BAS-2500( 型号 ： BAS-2500 ； 由富士胶片株式会社制 ) 123
( 实施例 I-3)[ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
向 70μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的甲 醇溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加入 75-100μL 的 1mol/L 盐酸、 236-454MBq 的 [123I] 碘化钠 ( 体积为 15-120μL)、 7.5-10μL 的 1mmol/L 碘化钠溶液和 10-15μL 的 10％ (W/V) 过氧化 氢。将该混合物在 50℃下加热 10 分钟后， 在与实施例 I-2 相同的条件下进行 HPLC， 以获得 123 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶级分。
将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收 123 集 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 123 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。在合成刚结束 时， 所得化合物的放射性活度是 21-180MBq。此外， 在与实施例 I-2 相同的条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 99.5％。
( 实施例 I-4)6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中加入 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮的 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混 合液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减压浓缩 所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 2， 步骤 1)。
将 2.15g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 1.74g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于 50mL 乙腈中。 将所得溶液在油浴中在 105℃下加热 回流 6 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减 压干燥。将所得粗结晶混悬在 20mL 水和 20mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中加入约 25mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 2.41g( 相当于 8.32mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 2， 步骤 2)。
所得 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结果 ( 内标物 ： 二甲亚砜 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶 剂 ：二 甲 亚 砜 -d6，共 振 频 率 ： 500MHz) ： δ9.54(br.s， 1H)， 8.83-8.81(m， 1H)， 8.17(s， 1H)， 7.79-7.74(m， 2H)， 7.51(d， J ＝ 9.6Hz， 1H)， 7.30(dd， J＝ 9.6， 1.8Hz， 1H)， 6.86-6.81(m， 2H)。 13
C-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 125MHz) ： δ158.15， 146.40， 143.79， 127.82， 127.67， 127.14， 125.01， 117.87， 116.15， 108.60， 106.05。
( 实施例 I-5)2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中加入 8.18g( 相当于 60.0mmol)4′ - 羟基苯乙酮的 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合液。 然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减压浓缩所得滤 液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓缩所得溶液。 通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 从乙酸乙酯 / 石油 醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 3， 步骤 1)。
将 441mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 449mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 碘吡啶溶解于 15mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加热回流 5 小 时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。 将所得粗结晶混悬在 10mL 水和 10mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中加入约 10mL 饱和碳酸 氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀， 用水充 分洗涤， 减压干燥， 得到 526mg( 相当于 1.56mmol) 的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 3， 步骤 2)。
所得 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结果 ( 内标物 ： 二甲亚砜 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.86-8.84(m， 1H)， 8.14(s， 1H)， 7.78-7.74(m， 2H)， 7.40-7.35(m， 2H)， 6.86-6.82(m， 2H)。 13
C-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 125MHz) ： δ158.08， 145.87， 143.87， 132.48， 131.72， 127.67， 124.99， 118.14， 116.14， 108.02， 75.85。( 实施例 I-6)2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的合成
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中加入 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮的 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混 合液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减压浓缩 所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓缩所得 溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 4， 步骤 1)。
将 646mg( 相当于 3.0mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 668mg( 相当于 3.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 碘嘧啶溶解于 20mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加热回流 8 小 时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。 将所得粗结晶混悬在 10mL 水和 10mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中加入约 15mL 饱和碳酸 氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 3 分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀， 用水充 分洗涤， 减压干燥， 得到 737mg( 相当于 2.19mmol) 的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 ( 图 4， 步骤 2)。
所得 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的 NMR 测定结果 ( 内标物 ： 二甲基甲酰胺 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 二甲基甲酰胺 -d7， 共振频率 ： 500MHz) ： δ9.80(br.s， 1H)， 9.35(d， J ＝ 2.3Hz， 1H)， 8.60(d， J ＝ 2.3Hz， 1H)， 8.23(s， 1H)， 7.94-7.90(m， 2H)， 6.98-6.94(m， 2H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 二甲基甲酰胺 -d7， 共振频率 ： 125MHz) ： δ158.87， 154.00， 147.18， 146.77， 139.07， 127.68， 124.50， 115.85， 106.10， 73.46。
( 实施例 I-7)6-(3′ - 氟丙氧基 )-2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合 成
将 31.11g( 相当于 178.88mmol) 的 2- 溴 -3- 羟基吡啶溶解于 95.8mL 的二甲亚砜 中， 向其中加入 89.9mL( 相当于 89.9mmol) 的 1mol/L 的甲醇钠 - 甲醇溶液。然后加热该 反应溶液至 90℃， 以蒸馏除去甲醇。在将反应溶液冷却至 5℃以下后， 加入 29.2g( 相当于 205.62mmol) 的碘甲烷， 然后在室温下搅拌 17 小时。反应结束后， 将反应溶液倒入冰水中， 用氯仿萃取 2 次。用 1mol/L 的氢氧化钠溶液洗涤合并的氯仿层， 再用饱和氯化钠溶液洗 涤 2 次， 用无水硫酸钠干燥。在减压蒸馏除去溶剂后， 得到 20.74g( 相当于 110.31mmol) 的 2- 溴 -3- 甲氧基吡啶 ( 图 5， 步骤 1)。
将 83mL 的浓硫酸冷却至 -5℃， 向其中小心加入 83mL 的 90％硝酸。随后， 向其中 小心加入 20.69g( 相当于 110.04mmol) 的 2- 溴 -3- 甲氧基吡啶。在将反应混合物在冰浴 中搅拌 5 分钟后， 将该混合物在室温下搅拌 10 分钟， 然后加热至 55℃， 再搅拌 1 小时。在 反应溶液冷却至室温后， 将反应溶液一点一点地倒入碎冰中以产生沉淀。过滤沉淀并用水 洗涤， 然后在减压下用五氧化二磷干燥， 得到 17.41g( 相当于 74.71mmol) 的 2- 溴 -3- 甲氧 基 -6- 硝基吡啶 ( 图 5， 步骤 2)。
将 17.36g( 相当于 74.50mmol) 的 2- 溴 -3- 甲氧基 -6- 硝基吡啶溶解于 520mL 的 乙醇中， 在氩气流下向其中加入 11.63g(50％湿度 ) 的 10％钯碳。然后向该混合物中滴加88.4mL 的一水合肼。在将反应混合物加热回流 45 分钟后， 将反应溶液冷却至室温。然后， 在滤除钯碳后， 用乙醇洗涤残余物， 合并洗液和滤液。减压浓缩合并的溶液。然后向该浓缩 物中加入 402mL 水和 38mL 浓氨水， 将所得混合物用氯仿萃取 8 次。用无水硫酸钠干燥合 并的氯仿层， 减压浓缩。减压蒸馏出所得粗产物， 得到 8.14g( 相当于 65.57mmol) 的 2- 氨 基 -5- 甲氧基吡啶 ( 图 5， 步骤 3)。
将 13.50g( 相当于 59.66mmol) 的 4′ - 苯甲酰氧基苯乙酮溶解于 1100mL 的甲醇 中， 向其中加入 34.52g( 相当于 71.59mmol) 的四正丁基三溴化铵。将混合物在室温下搅拌 过夜， 减压蒸馏以除去溶剂。将残余物溶解于乙酸乙酯， 用水洗涤 2 次， 然后用饱和氯化钠 溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层， 减压浓缩后， 通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 己烷 / 二氯甲烷＝ 1/1) 精制所得粗产物， 得到 13.38g( 相当于 43.84mmol) 的 4′ - 苯甲酰 氧基 -2- 溴苯乙酮 ( 图 5， 步骤 4)。
将 13.33g( 相当于 43.68mmol) 的 4′ - 苯甲酰氧基 -2- 溴苯乙酮和 5.67g( 相当 于 45.67mmol) 的 2- 氨基 -5- 甲氧基吡啶溶解于 481mL 的乙醇。将所得溶液加热回流 2 小 时。在反应溶液冷却后， 向其中加入 6.64g( 相当于 79.09mmol) 的碳酸氢钠。再将所得反 应混合物加热回流 4 小时。反应结束后， 减压浓缩溶剂。将所得残余物溶解于氯仿， 然后用 水洗涤。用无水硫酸钠干燥氯仿层后， 蒸馏除去溶剂。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯 仿 / 乙酸乙酯＝ 20/1) 精制所得粗产物， 得到 10.20g( 相当于 30.87mmol) 的 2-(4′ - 苯甲 酰氧基苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 5， 步骤 5)。
将充分干燥除去水分的 4.90g( 相当于 14.83mmol) 的 2-(4 ′ - 苯甲酰氧基苯 基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 245mL 的氯仿中并冷却至 -15℃。向该溶液中 滴加将 12.62mL( 相当于 133.48mmol) 三溴化硼溶解于 134mL 二氯甲烷中而成的溶液。在 将所得溶液的温度升高至室温后， 将所得溶液搅拌 17 小时。反应结束后， 用冰冷却反应溶 液， 并补充 668mL 的甲醇， 在室温下再搅拌 3 小时。然后减压浓缩反应混合物。向所得粗产 物补充 290mL 的氯仿和 29mL 的甲醇以获得浆液， 然后过滤回收沉淀。用氯仿洗涤回收的沉 淀， 然后减压干燥， 得到 3.00g( 相当于 13.28mmol) 的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 羟基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 5， 步骤 6)。
将 560mg( 相 当 于 2.48mmol) 的 2-(4 ′ - 羟 基 苯 基 )-6- 羟 基 咪 唑 并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 21mL 的二甲基甲酰胺中， 向其中加入 1.37g( 相当于 9.90mmol) 的碳酸钾和 349mg( 相当于 2.48mmol) 的 1- 溴 -3- 氟丙烷。将该溶液在室温下搅拌 24 小时。减压浓 缩反应溶液， 然后补充 10mL 的氯仿和 10mL 的甲醇以获得浆液。过滤该浆液， 浓缩滤液。通 过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 得到 151mg( 相当于 0.527μmol) 的 6-(3′ - 氟丙氧基 )-2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 5， 步 骤 7)。
所得 6-(3′ - 氟丙氧基 )-2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定 结果 ( 内标物 ： 二甲亚砜 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-GSX-270( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 二甲亚砜 -d6 ； 共振频率 ： 270MHz) ： δ9.52(s， 1H)， 8.22(d， J ＝ 2.2Hz， 1H)， 8.08(s， 1H)， 7.75-7.65(m， 2H)， 7.44(d， J ＝ 9.6Hz， 1H)， 6.99(dd， J ＝ 9.6， 2 2.2Hz， 1H)， 6.85-6.75(m， 2H)， 4.62(dt，JHF ＝ 47.0Hz， J ＝ 6.0Hz， 2H)， 4.05(t， J ＝3 6.0Hz， 2H)， 2.13(dquint， JHF ＝ 25.9Hz， J ＝ 6.0Hz， 2H)。
( 实施例 I-8)6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的合成
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中加入 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮的 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减压浓缩所 得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓缩所得溶 液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 再从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 6， 步骤 1)。
将 748mg( 相当于 3.5mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 605mg( 相当于 3.5mmol) 的 2- 氨基 -5- 溴嘧啶溶解于 30mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加热回流 5 小 时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。 将所得粗结晶混悬在 10mL 水和 15mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中加入约 10mL 饱和碳 酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀， 用 水充分洗涤， 减压干燥， 将所得粗产物从 N， N- 二甲基甲酰胺中重结晶， 得到 289mg( 相当于 0.997mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 ( 图 6， 步骤 2)。
所得 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的 NMR 测定结果 ( 内标物 ： 二甲亚砜 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 二甲亚砜 -d6， 共振频率 ： 500MHz) ： δ9.56(br.s， 1H)， 9.21(d， J ＝ 2.5Hz， 1H)， 8.46(d， J ＝ 2.5Hz， 1H)， 8.09(s， 1H)， 7.79-7.75(m， 2H)， 6.83-6.79(m， 2H)。 13
C-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 125MHz) ： δ158.63， 149.99， 147.68， 146.88， 134.78， 127.93， 124.52， 116.23， 106.83， 103.94。
( 实施例 I-9)6- 氟 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
将 70mL 乙酸乙酯加入到 40.0g( 相当于 179mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其中 加入 11.6g( 相当于 85.3mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 70mL 乙酸乙酯和 70mL 氯仿的混合液 中的溶液。然后加热回流所得混合物。5.5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 从乙 酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 10.2g( 相当于 47.3mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 7， 步骤 1)。
将 439mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 224mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 氟吡啶溶解于 20mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加热回流 5 小 时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。 将所得粗结晶混悬在 8mL 水和 8mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中加入约 10mL 饱和碳酸氢 钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀， 用水充分 洗涤， 减压干燥， 得到 302mg( 相当于 1.32mmol) 的 6- 氟 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 7， 步骤 2)。
所得 6- 氟 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结果 ( 内标物 ：二甲亚砜 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 500MHz) ： δ9.45(br.s， 1H)， 8.65(ddd， 3 JHF ＝ 4.6Hz， J ＝ 2.5， 0.7Hz， 1H)， 8.16-8.15(m， 1H)， 7.75-7.69(m， 2H)， 7.56-7.51(m， 1H)， 3 7.23(ddd， JHF ＝ 8.4Hz， J ＝ 9.9， 2.5Hz， 1H)， 6.82-6.76(m， 2H)。 13 1
C-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 125MHz) ： δ157.82， 152.81(d， JCF ＝ 3 2 232.3Hz)， 146.58， 142.92， 127.35， 124.99， 117.19(d，JCF ＝ 9.6Hz)， 116.40(d，JCF ＝ 2 25.9Hz)， 115.89， 113.66(d， JCF ＝ 41.8Hz)， 109.48。 19
F-NMR( 溶剂 ： 二甲亚砜 -d6， 共振频率 ： 470MHz) ： δ141.93(br.s)。
( 实施例 I-10)2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 硝基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
将 70mL 乙酸乙酯加入到 40.0g( 相当于 179mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其中 加入 11.6g( 相当于 85.3mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 70mL 乙酸乙酯和 70mL 氯仿的混合液 中的溶液。然后加热回流所得混合物。5.5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 从乙 酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 10.2g( 相当于 47.3mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 8， 步骤 1)。
将 432mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 279mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 硝基吡啶溶解于 20mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加热回流 6 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。 将所得粗结晶混悬在 8mL 水和 8mL 甲醇的混合液中。 然后， 向其中加入约 8mL 饱和碳酸氢钠 溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 3 分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀， 用水充分洗 涤， 减压干燥， 得到 148mg( 相当于 0.580mmol) 的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 硝基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 8， 步骤 2)。
所得 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 硝基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结果 ( 内标物 ： 二甲亚砜 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 二甲亚砜 -d6， 共振频率 ： 500MHz) ： δ9.74-9.72(m， 1H)， 9.59(br. s， 1H)， 8.39(s， 1H)， 7.87(dd， J ＝ 9.9， 2.3Hz， 1H)， 7.79-7.74(m， 2H)， 7.65-7.61(m， 1H)， 6.84-6.80(m， 2H)。 13
C-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 125MHz) ： δ158.47， 148.51， 145.25， 136.63， 127.93， 127.81， 124.06， 118.92， 116.09， 115.92， 110.37。
( 实施例 II-1)6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的 合成
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中加入 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮的 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减压浓缩所 得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓缩所得溶 液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 从乙酸乙酯 /石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 10， 步骤 1)。
将 748mg( 相 当 于 3.48mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 605mg( 相 当 于 3.48mmol) 的 5- 溴 -2- 氨基嘧啶溶解于 30mL 乙腈中。 将所得溶液在油浴中在 110℃下加热 回流 5 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减 压干燥。将所得粗结晶混悬在 10mL 水和 15mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中加入约 10mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀， 用水充分洗涤， 减压干燥。从 DMF 中重结晶所得固体， 得到 289mg( 相当于 1.00mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 ( 图 10， 步骤 2)。
将 75.4mg( 相当于 0.260mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧 啶溶解于 10.0mL 的二噁烷中， 向其中加入 2.0mL 的三乙胺。然后， 向其中加入 0.20mL( 相 当于 0.39mmol) 的双 ( 三丁基锡 ) 和 20.1mg( 催化剂量 ) 的四 ( 三苯膦 ) 钯。在将反应 混合物在 90℃下搅拌 10 小时后， 减压蒸馏除去溶剂。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 己 烷 / 乙酸乙酯＝ 1/1) 精制残余物， 得到 24.0mg( 相当于 0.048mmol) 的 6- 三丁基甲锡烷 基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 ( 图 10， 步骤 3)。
所得 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的 NMR 测定结 果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -dl， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.41(s， 1H)， 8.23(s， 1H)， 7.80(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 7.63(s， 1H)， 6.93(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 1.57-1.51(m， 6H)， 1.37-1.23(m， 6H)， 1.16-1.12(m， 6H)， 0.88(d， J ＝ 7.3Hz， 9H)
( 实施例 II-2)6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪的 合成
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中加入 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮的 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减压浓缩所 得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓缩所得溶 液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 11， 步骤 1)。
将 4.66g( 相 当 于 21.6mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 2.53g( 相 当 于 14.5mmol) 的 5- 溴 -2- 氨基吡嗪溶解于 100mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加 热回流 3.5 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉 淀， 减压干燥。将所得粗结晶混悬在 10mL 水和 10mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中加入约 20mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 10 分钟。 从所得混合物中过滤回 收沉淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 1.32g( 相当于 4.55mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯 基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪 ( 图 11， 步骤 2)。
将 1.00g( 相当于 3.45mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪 溶解于 50.0mL 的二噁烷中， 向其中加入 20.0mL 的三乙胺。 然后， 向其中加入 4.5mL( 相当于5.18mmol) 的双 ( 三丁基锡 ) 和 239mg( 催化剂量 ) 的四 ( 三苯膦 ) 钯。在将反应混合物在 90℃下搅拌 24 小时后， 减压蒸馏除去溶剂。 通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 己烷 / 乙酸乙 酯＝ 1/1) 精制残余物， 得到 314mg( 相当于 0.628mmol) 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟 基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪 ( 图 11， 步骤 3)。
所得 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪的 NMR 测定结 果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -dl， 共振频率 ： 500MHz) ： δ9.21(s， 1H)， 7.95(s， 1H)， 7.79(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 7.77(s， 1H)， 6.91(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 1.70-1.55(m， 6H)， 1.38-1.31(m， 6H)， 1.18-1.15(m， 6H)， 0.89(d， J ＝ 7.3Hz， 9H) 13
C-NMR( 溶 剂 ： 氯 仿 -dl，共 振 频 率 ： 125MHz) ： δ157.3， 146.4， 143.5， 140.3 128.0， 124.9， 123.6， 116.1， 106.9， 29.0， 27.3， 13.7， 10.0。
( 实施例 II-3)2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪的合成
将 实 施 例 II-2 所 得 的 314mg( 相 当 于 0.628mmol) 的 6- 三 丁 基 甲 锡 烷 基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪溶解于 5.0mL 二氯甲烷中， 向其中加入溶解于 5.0mL 二氯甲烷的 114mg( 相当于 0.942mmol) 碘。将该反应混合物在 0℃的温度下搅拌 10 分钟， 在室温下搅拌 30 小时。然后向其中加入饱和碳酸氢钠水溶液和饱和硫代硫酸钠水溶 液。过滤回收沉淀， 依次用水和乙酸乙酯洗涤， 减压干燥， 得到 131mg( 相当于 0.389mmol) 的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪 ( 图 12， 步骤 1)。
所得 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪的 NMR 测定结果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 基 甲 酰 胺 -d7， 共振频率 ： 500MHz) ： δ9.89(s， 1H)， 9.01(s， 1H)， 8.82(s， 1H)， 8.42(s， 1H)， 7.92(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 6.93(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)。
( 实施例 II-4)8- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 合成
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中加入 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮的 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减压浓缩所 得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓缩所得溶 液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 13， 步骤 1)。
将 432mg( 相 当 于 2.01mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 348mg( 相 当 于 2.01mmol) 的 3- 溴 -2- 氨基吡啶溶解于 20mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加 热回流 6 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。将所得粗结晶混悬在 8mL 水和 8mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中加入约 8mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 368mg( 相当于 1.27mmol) 的 8- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 )咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 13， 步骤 2)。
将 75.2mg( 相当于 0.260mmol) 的 8- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡 啶溶解于 10.0mL 的二噁烷中， 向其中加入 2.0mL 的三乙胺。然后， 向其中加入 0.20mL( 相 当于 0.39mmol) 的双 ( 三丁基锡 ) 和 20.1mg( 催化剂量 ) 的四 ( 三苯膦 ) 钯。在将反应 混合物在 90℃下搅拌 11 小时后， 减压蒸馏除去溶剂。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 己 烷 / 乙酸乙酯＝ 1/1) 精制残余物， 得到 62.5mg( 相当于 0.125mmol) 的 8- 三丁基甲锡烷 基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 13， 步骤 3)。
所得 8- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结 果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -dl， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.01(d， J ＝ 6.4Hz， 1H)， 7.87(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 7.70(s， 1H)， 7.17(d， J ＝ 6.4Hz， 1H)， 6.87(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 6.68-6.66(m， 1H)， 1.69-1.56(m， 6H)， 1.38-1.30(m， 6H)， 1.28-1.16(m， 6H)， 0.88(t， J ＝ 7.3Hz， 9H) 13
C-NMR( 溶 剂 ： 氯 仿 -dl，共 振 频 率 ： 125MHz) ： δ145.2， 141.0， 139.2， 132.4， 131.8， 127.7， 127.3， 125.0， 115.4， 112.2， 106.4， 29.2， 27.4， 13.7， 10.2。 123
( 实施例 II-5)[ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的合成
向 100μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4 ′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的 123 甲醇溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加 入 100μL 的 2mol/L 盐 酸， 621MBq 的 [ I] 碘 化 钠 ( 体 积为 150μL)， 20μL 的 1mmol/L 碘化钠溶液和 20μL 的 10 ％ (W/V) 过氧化氢。在将该混 合物在 50℃下静置 10 分钟后， 将该溶液在与实施例 I-2 相同的条件下进行 HPLC， 以获得 123 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶级分。
进行与上段所述相同的操作， 得到 [123I]-2-(4 ′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 ( 试剂的添加量 ： 150μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑 并 [1， 2-a] 嘧啶的甲醇溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL)， 75μL 的 2mol/L 盐酸， 487MBq 的 [123I] 碘化 钠 ( 体积为 150μL)， 20μL 的 1mmol/L 碘化钠溶液和 30μL 的 10％ (W/V) 过氧化氢 )。
混合上述两段操作获得的两种级分， 向其中加入 10mL 水。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 123 145mg)， 以使得该柱吸附收集 [ I]-2-(4 ′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶。用 123 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶。在合成刚结束时， 所得化合物的放射性活度是 67MBq。此外， 在下述条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 92.5％。
TLC 分析条件 ：
TLC 板 ： 硅胶 60 F254( 商品名 ； 由默克公司制 )
流动相 ： 氯仿 / 甲醇 / 三乙胺＝ 100/1/2
检测器 ： Rita Star( 商品名 ； 由 raytest 制 ) 123
( 实施例 II-6)[ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪的合成
向 100μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4 ′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪的 123 甲醇溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加入 75μL 的 2mol/L 盐酸， 469MBq 的 [ I] 碘化钠 ( 体积 为 100μL)， 20μL 的 1mmol/L 碘化钠溶液和 20μL 的 10 ％ (W/V) 过氧化氢。在将该混合物在 50℃下静置 10 分钟后， 将该溶液在与实施例 I-2 相同的条件下进行 HPLC， 以获得 123 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪级分。
将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 145mg)， 以使得该柱吸附收 123 集 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 123 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪。在合成刚结束 时， 所得化合物的放射性活度是 133MBq。此外， 在与实施例 II-5 相同的条件下进行 TLC 分 析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 99.0％。
( 实施例 II-7)[123I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-8- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
向 70μL 的 8- 三丁基甲锡烷基 -2-(4 ′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡嗪的 123 甲醇溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加入 50μL 的 2mol/L 盐酸， 454MBq 的 [ I] 碘化钠 ( 体积 为 100μL)， 20μL 的 1mmol/L 碘化钠溶液和 20μL 的 10 ％ (W/V) 过氧化氢。在将该混 合物在 50℃下静置 10 分钟后， 将该溶液在与实施例 I-2 相同的条件下进行 HPLC， 以获得 123 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-8- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶级分。
将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收 123 集 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-8- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 123 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-8- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。在合成刚结束 时， 所得化合物的放射性活度是 185MBq。此外， 在与实施例 II-5 相同的条件下进行 TLC 分 析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 91.7％。
( 参考例 1)[125I]-IMPY 的合成
根 据 下 述 步 骤 来 合 成 在 用 于 评 价 logP 辛 醇 的 比 较 例 ( 比 较 例 I-6) 中 使 用 的 125 [ I]-IMPY。
根据在文献 (Zhi-Ping Zhuang 等人， J.Med.Chem， 2003， 46， p.237-243) 中所述的 方法， 合成 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶， 并溶解于甲醇 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中。向 53μL 所得溶液中， 加入 75μL 的 1mol/L 盐酸， 20μL 125 的 13.5MBq 的 [ I] 碘化钠和 10μL 的 10％ (W/V) 过氧化氢。在将混合液在 50℃下静置 10 分钟后， 将该溶液在与实施例 I-2 相同的条件下进行 HPLC， 以得到 [125I]-IMPY 级分。
将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收 125 125 集 [ I]-IMPY。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 乙醇通过， 以洗脱 [ I]-IMPY。在合成刚 结束时， 所得化合物的放射性活度是 2.6MBq。此外， 在与实施例 I-2 相同的条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 98.0％。
( 参考例 2)[123I]-IMPY 的合成
根据下述步骤来合成在用于评价脑中蓄积性的比较例 ( 比较例 I-7) 中使用的 123 [ I]-IMPY。
根据在文献 (Zhi-Ping Zhuang 等人， J.Med.Chem， 2003， 46， p.237-243) 中所述 的方法， 合成 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡 啶， 并溶解于甲醇 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中。向 53μL 所得溶液中， 加入 100μL 的 1mol/L 盐酸，20-50μL 的 190-240MBq 的 [123I] 碘化钠、 10μL 的 1mmol/L 碘化钠溶液和 10μL 的 10 ％ (W/V) 过氧化氢。将该混合液在 50℃下静置 10 分钟后， 将该溶液在与实施例 I-2 相同的条 123 件下进行 HPLC， 以得到 [ I]-IMPY 级分。
向该级分中加入 10mL 水。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商标 ) Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收集 123 123 [ I]-IMPY。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-IMPY。在合成刚结束 时， 所得化合物的放射性活度是 47-56MBq。 进而， 在与实施例 I-2 相同的条件下进行 TLC 分 析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 98.0％。
( 实施例 I-11 至 I-14， 比较例 I-1 至 I-5) 与淀粉样蛋白的结合性的测定
通过下述的体外结合试验检验本发明的化合物与淀粉样蛋白的亲和性。
(1) 将 Aβ1-40( 肽研究所制 ) 溶解于磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)， 在 37℃下振荡 62-72 小时， 以获得凝集 Aβ 混悬液 ( 浓度 ： 相当于 1mg/mL， 以下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋白 混悬液 )。
(2) 根据文献 (Naiki， H. 等人， Labeled Investigation， 74， p.374-383(1996)) 所述的方法， 基于使用硫磺素 T( 由 Fluka 公司制 ) 的荧光分光光度法， 进行该淀粉样蛋白 混悬液的定性实验， 以证实在 (1) 中获得的凝集 Aβ 是淀粉样蛋白 ( 测定条件 ： 激发波长 446nm， 荧光波长 490nm)。 (3) 根 据 文 献 (Wang， Y. 等 人， J.Labeled CompoundsRadiopharmaceut.44， S239(2001)) 中 所 述 的 方 法，由 标 记 前 体 2-(4 ′ - 氨 基 苯 基 ) 苯 并 噻 唑 制 备 [125I]2-(3′ - 碘 -4′ - 氨基苯基 ) 苯并噻唑 ( 以下称作 [125I]3′ -I-BTA-0)， 将其溶解于 125 乙醇中。使用 12-71MBq 的 [ I] 碘化钠 ( 体积为 10-30μL) 进行制备， 以得到合成刚结束 125 时 1-22MBq 的 [ I]3′ -I-BTA-0。将刚果红、 硫磺素 T 和 6- 甲基 -2-[4′ -(N， N- 二甲基 氨基 ) 苯基 ] 苯并噻唑 ( 以下称作 6-Me-BTA-2)， 直接以市售试剂的形式称重并使用。
(4) 分别根据文献 (Wang， Y. 等人， J.Labeled Compounds Radiopharmaceut.44， S239(2001)) 和文献 (Zhuang， Z.P. 等人， J.Med.Chem.46， 237(2003)) 中所述的方法来合成 2-(3′ - 碘 -4′ - 氨基苯基 ) 苯并噻唑 ( 以下称作 3′ -I-BTA-0) 和 IMPY。
(5) 制备将 [125I]3′ -I-BTA-0、 各评价化合物和淀粉样蛋白溶解于含有 0.1％牛 血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中、 并使它们的最终浓度如表 2 所示的样品。将所得 样品填充在 96 孔微量培养板的各孔 ( 体积约 0.3mL) 中。
表2： 在样品溶液中各化合物的最终浓度
(6) 将填充有样品溶液的微量培养板以指定速度 (400rpm) 在 22℃下振荡 3 小时。 然后让各样品溶液通过玻璃纤维过滤器 ( 商品名 ； MulutiscreenTM-FC， 由 Millipore 制造 ) 125 125 过滤， 以从游离的 [ I]3′ -I-BTA-0 中分离出与淀粉样蛋白结合的 [ I]3′ -I-BTA-0。
(7) 用含有 0.1 ％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (pH7.4) 洗涤 (0.5mL×5) 用于 过滤各样品溶液的玻璃纤维过滤器， 用 Autowell Gamma 系统 ( 由 Aloka 公司制， 型号 ： ARC-301B) 测定该玻璃纤维过滤器的放射性。将该放射性作为与淀粉样蛋白结合的各样品 溶液的放射性水平， 用于计算抑制率 ( 以下， A 表示各评价化合物的浓度为零 (0) 时样品中 的放射性水平， B 表示各评价化合物的浓度为 0.001nmol/L 以上时样品中的放射性水平 )。
(8) 另 外， 制 备 在 含 有 0.1 ％ 牛 血 清 白 蛋 白 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (pH7.4) 中 含 有 15μmol/L 的 6-Me-BTA-2， 400pmol/L 的 [125I]3′ -I-BTA-0 和 1μmol/L 的 Aβ1-40 的溶液， 进行与上文 (6) 和 (7) 中所述相同的操作来测定放射性水平。将所测定的放射性水平定义 为背景放射性水平， 用于计算抑制率 ( 以下称作 BG)。
(9) 使用在上述 (7) 和 (8) 中所测定的放射性水平， 通过下述式 (1) 来求出抑制 率。
绘制相对于评价化合物浓度的对数的由所获得的抑制率通过概率单位 (probit) 变换的值的图， 以通过最小二乘法获得近似的直线。 使用这条线， 评价当放射性水平是不含 各评价化合物样品的一半时的各评价化合物的浓度， 将其定义为各化合物的 50％抑制浓度 ( 以下称作 IC50％值 )。 使用该值作为指标， 评价各评价化合物与淀粉样蛋白 ( 凝集 Aβ1-40) 的亲和性。
各评价化合物的 IC50％值如表 3 所示。化合物 1 ～ 4 都显示了小于 100 的 IC50％值，
与刚果红和硫磺素 T 相比， 与淀粉样蛋白 ( 凝集 Aβ1-40) 具有更高的亲和性。结果显示， 化 合物 1 ～ 4 与淀粉样蛋白 ( 凝集 Aβ1-40) 具有良好的亲和性。特别地， 与 3′ -I-BTA-0 和 6-Me-BTA-2 相比， 化合物 1 与淀粉样蛋白 ( 凝集 Aβ1-40) 具有更高的亲和性， 且其亲和性与 IMPY 相当。
表3： 本发明化合物的 IC50％
实验 比较例 I-1 比较例 I-2 比较例 I-3 比较例 I-4 比较例 I-5 实施例 I-11 实施例 I-12 实施例 I-13 实施例 I-14
评价化合物 3′ -I-BTA-0 刚果红 硫磺素 T 6-Me-BTA-2 IMPY 化合物 1 化合物 2 化合物 3 化合物 4IC50％值 (nmol/L) 10.1 ＞ 1000 ＞ 1000 25.4 4.0 4.4 46.0 54.4 54.1( 实施例 I-15， 实施例 II-8 至 II-10， 比较例 I-6) 基于辛醇萃取法的分配系数的测定 测定采用一般已知作为化合物渗透通过血脑屏障 ( 以下称作 BBB) 指标的辛醇萃 取法的分配系数 ( 以下称作 logP 辛醇 )。
用包含 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液分别稀释实施例 I-2 制备的化合物 5 的 乙醚溶液 ( 实施例 I-15)， 实施例 II-5 制备的化合物 9 的乙醚溶液 ( 实施例 II-8)， 实施例
II-6 制备的化合物 10 的乙醚溶液 ( 实施例 II-9)， 实施例 II-7 制备的化合物 11 的乙醚溶 123 液 ( 实施例 II-10) 和参考例 1 制备的 [ I]-IMPY 的乙醚溶液 ( 比较例 I-6)， 调节放射性 浓度至 20-30MBq/ml。分别向 2mL 的辛醇中加入各 10μL 所制备的样品溶液， 再加入 2mL 的 10mmol/L 磷酸盐缓冲液 (pH7.4)， 然后搅拌 30 秒。在用低速离心机离心分离 (2000rpmx60 分钟 ) 该混合物后， 分别取样各 1mL 的辛醇层和水层， 并且用 Autowell Gamma 系统 ( 型号 ： ARC-301B， 由 Aloka 制造 ) 测定各自的放射性计数。使用所获得的放射性计数， 根据公式 (2) 计算 logP 辛醇。
结果如表 4 所示。化合物 5 显示的 logP 辛醇值为 1.6， [125I]-IMPY 显示的 logP 辛醇 值为 2.1。已知能渗透通过 BBB 的化合物的 logP 辛醇值在 1 ～ 3 之间 (Douglas D.Dischino 等人， J.Nucl.Med.， (1983)， 24， p.1030-1038)。因此， 这表明， 这两种化合物都具有与 IMPY 同等的 BBB 渗透性。
表4： 本发明化合物的 logP 辛醇值
实验 比较例 I-6 实施例 I-15 实施例 II-8 实施例 II-9 实施例 II-10
化合物 [125I]-IMPY 化合物 5 化合物 9 化合物 10 化合物 11logP 辛醇值 2.1 1.6 1.7 2.3 3.0( 实施例 I-16， 比较例 I-7) 脑中转移性和清除性的测定
使用化合物 6， 测定在雄性 Wistar 大鼠 (7 周龄 ) 的脑中放射性蓄积的经时变化。
在硫喷妥钠麻醉下， 将化合物 6( 实施例 I-16) 溶解于包含 10mg/mL 抗坏血酸的 生理盐水溶液中的 0.05mL 溶液 ( 放射性浓度为 20-30MBq/mL) 和将上述参考例 2 制备的 [123I]-IMPY( 比较例 I-7) 溶解于包含 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液中的 0.05mL 溶液 ( 放射性浓度为 20-30MBq/mL)， 分别注射到各 Wistar 大鼠 (7 周龄 ) 的尾静脉中。注射 2， 5， 30 和 60 分钟后， 通过从腹部大动脉放血来处死这些大鼠， 移取脑， 用 autowell gamma 系 统 ( 型号 ： ARC-301B， 由 Aloka 制造 ) 测定脑的放射性 ( 以下， 在本实施例中， 称作 A)， 此外 在注射后 2， 5， 30 和 60 分钟后， 测定脑的质量。另外， 按照与上述相同的方式测定 0.05mL 所注射溶液的 1000 倍稀释溶液的放射性 ( 以下， 在本实施例中， 称作 B)。使用这些测定结 果， 根据下式 (3) 计算在各个时间点每单位脑重量的放射性分布 (％ ID/g)。
在各个时间点， 各两只动物用于实施例 I-16 和比较例 I-7。
结果如表 5 所示。如表 5 所示， 在注射后 2 分钟的时间点， 化合物 6 显示的蓄积与 I-IMPY 相当， 随后显示出在 60 分钟内迅速清除的趋势。这些结果启示， 化合物 6 具有与 123 I-IMPY 同样的优良的脑转移性和从脑中的迅速清除性。
表5： 化合物 6 在静脉注射后在脑中的放射性蓄积 ( 大鼠 )
123
( 实施例 I-17) 脑中淀粉样蛋白的显像确认
进行下述实验以检验通过本发明的化合物是否可以使脑中的淀粉样蛋白显像。
(1) 将 Aβ1-40( 肽研究所制 ) 溶解于磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)， 在 37℃下振荡 72 小 时， 以获得凝集 Aβ 混悬液 (Aβ 浓度 ： 相当于 1mg/mL， 以下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋 白混悬液 )。
(2) 将 25μL( 相当于 25μg) 的淀粉样蛋白混悬液注射到雄性 Wistar 大鼠 (7 周 龄 ) 一侧的杏仁核中。作为对照， 将 25μL 的磷酸盐缓冲生理盐水溶液 (pH 7.4) 注射到该 大鼠另一侧的杏仁核中。在注射淀粉样蛋白混悬液和磷酸盐缓冲生理盐水溶液 (pH 7.4)1 天后检查该大鼠。
(3) 将化合物 6 溶解于包含 10mg/mL 的抗坏血酸的生理盐水溶液中， 得到样品溶液 ( 放射性浓度为 32MBq/mL)。将该溶液通过尾静脉注射到大鼠中 ( 剂量 ： 0.5mL， 给予的放射 性活度 ： 相当于 16MBq)。
(4) 在注射后 60 分钟移取脑， 用切片机 ( 型号 ： CM3050S， 由 LEICA 制造 ) 制成厚度 10μm 的脑切片。将该脑切片在成像板上曝光 20 小时， 然后通过使用生物图像分析仪 ( 型 号： BAS-2500 ； 由富士胶片株式会社制 ) 进行图像分析。
(5) 在用生物图像分析仪进行图像分析后， 用硫磺素 T 进行病理学染色， 通过使用 荧光显微镜 ( 型号 ： TE2000-U 型 ； 由尼康公司制 ； 激发波长 ： 400-440nm ； 检测波长 ： 470nm) 进行显像。从而证明了淀粉样蛋白沉积在该切片上 ( 图 9b)。
图 9 显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠脑切片的放射自显影图和硫磺素 T 染色的 图像。如图 9 所示， 在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到明显的放射性蓄积。 由硫磺素 T 在放射性蓄积位点染色的结果， 证明了在该蓄积位点上存在着淀粉样蛋白。另 一方面， 与其他位点相比， 在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到明显的放射性 蓄积。
这些结果启示， 化合物 6 具有在脑内的淀粉样蛋白上蓄积的性质， 并具有使脑内 淀粉样蛋白显像的能力。
( 实施例 I-18 至 I-20) 回复突变试验
为了检验化合物 1、 2 和 4 的基因诱变性， 使用鼠伤寒沙门氏菌 TA98 和 TA100 进行 回复突变试验 ( 以下称作 Ames 试验 )。
本试验在添加 S9mix 和不添加 S9mix 的条件下进行。将二甲亚砜作为阴性对照。 阳性对照在不添加 S9mix 的情况下使用 2-(2- 呋喃基 )-3-(5- 硝基 -2- 呋喃基 ) 丙烯酰胺， 在添加 S9mix 的情况下使用 2- 氨基蒽。
加入到试验平板上的各样品的量是 7 个剂量 ( 几何比 ： 4)， 最大剂量是 5000μg/ 板。将各受试样品溶液和试验菌株 (TA98 或 TA100)、 或者将受试样品、 S9mix 和试验菌株混
合在一起， 然后用软琼脂在试验平板的培养基上将混合物重叠成多层， 然后在 37℃下培养 48 小时。通过在培养后对平板上的回复突变菌落数计数来进行判断， 当回复突变的菌落数 是阴性对照的 2 倍以上、 且表现出浓度依赖性增加时， 判定诱变性为阳性。
结果如表 6 所示。在用化合物 1、 2 和 4 处理的组中的各试验菌株回复突变菌落 数均小于用阴性对照物处理的组中回复突变菌落数的 2 倍， 而不论各菌株中是否加入了 S9mix 以及受试样品的添加量是多少。从上述结果可以判定， 化合物 1， 2 和 4 在 Ames 试验 中呈阴性， 没有基因诱变性。
表6： Ames 试验的结果
( 实施例 II-11， II-12， 比较例 II-1) 脑中转移性和清除性的测定 使用化合物 10 和 11， 测定在雄性 Wistar 大鼠 (7 周龄 ) 的脑中放射性蓄积的经时变化。 在硫喷妥钠麻醉下， 将化合物 10( 实施例 II-11)， 化合物 11( 实施例 II-12) 和上 123 述参考例 2 制备的 [ I]-IMPY 分别溶解于包含 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液中而得 到的各 0.05mL 溶液 ( 放射性浓度为 20-31MBq/mL) 注射到各 Wistar 大鼠的尾静脉中。注 射 2， 5， 30 和 60 分钟后， 通过从腹部大动脉放血来处死这些大鼠， 移取脑， 测定脑质量， 再用 单通道分析仪 ( 检测器型号 ： SP-20， 应用光研株式会社制 ) 测定脑的放射性 ( 以下， 在本实 施例中， 称作 A)。此外， 按照与上述相同的方式测定全身其余部分的放射性 ( 以下， 在本实 施例中， 称作 B)。 使用这些测定结果， 根据下式 (4) 计算在各解剖时间点的每单位脑重量的 放射性蓄积 (％ ID/g)。
在各个时间点使用 3 只动物进行实验。
结果如表 7 所示。如表 7 所示， 在注射后 2 分钟的时间点， 化合物 10 和 11 与 [ I]-IMPY 同样， 显示出显著的放射性蓄积， 随后在 60 分钟内显示出迅速消除的趋势。这 些结果启示， 化合物 10 和 11 与 [123I]-IMPY 同样， 具有优良的脑内转移性以及从脑中的迅 速清除性。
表7： 本发明化合物在静脉注射后在脑中的放射性蓄积 ( 大鼠 )
123
( 实施例 II-13) 使用注射淀粉样蛋白的大鼠模型进行的化合物 10 的离体放射自显影图 (1) 将 Aβ1-42( 株式会社肽研究所制 ) 溶解于磷酸盐缓冲液 (pH7.4)， 在 37℃下振 荡 72 小时， 以获得 1mg/mL 的凝集 Aβ 混悬液 ( 以下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋白混悬 液 )。
(2) 将 2.5μL( 相当于 25μg) 的淀粉样蛋白混悬液注射到雄性 Wistar 大鼠 (7 周 龄 ) 一侧的杏仁核中。 作为对照， 将 2.5μL 的磷酸盐缓冲生理盐水溶液 (pH 7.4) 注射到该 大鼠另一侧的杏仁核中。在注射淀粉样蛋白混悬液和磷酸盐缓冲生理盐水溶液 (pH 7.4)1 天后检查该大鼠。
(3) 将化合物 10 溶解于包含 10mg/mL 的抗坏血酸的生理盐水溶液中， 得到样品溶 液 ( 在该样品溶液中， 放射性浓度为 31MBq/mL)。在硫喷妥钠麻醉下， 将该溶液通过尾静脉 注射到大鼠中 ( 剂量 ： 0.5mL， 给予的放射性活度 ： 相当于 15MBq)。
(4) 在注射 60 分钟后移取脑， 用切片机 ( 型号 ： CM3050S， 由 LEICA 制造 ) 制成厚度 10μm 的脑切片。将该脑切片在成像板上曝光 20 小时， 然后通过使用生物图像分析仪 ( 型 号： BAS-2500 ； 由富士胶片株式会社制 ) 进行图像分析。
(5) 在用生物图像分析仪进行图像分析后， 用硫磺素 T 进行病理学染色， 通过使用 荧光显微镜 ( 由尼康公司制 ； 型号 ： TE2000-U 型 ； 激发波长 ： 400-440nm ； 检测波长 ： 470nm) 进行显像。从而证明了淀粉样蛋白沉积在该切片上 ( 图 14b)。
图 14 显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠脑切片的放射自显影图和硫磺素 T 染色 的图像。如图 14 所示， 在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到明显的放射性蓄 积。 另一方面， 与其他位点相比， 在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到显著的放 射性蓄积。在放射自显影图上， 在注射淀粉样蛋白的位点以外的位置几乎观察不到放射性 蓄积。由硫磺素 T 染色的结果， 确认了在该蓄积位点存在着淀粉样蛋白 ( 图 14b)。这些结 果启示， 化合物 10 具有在脑内淀粉样蛋白上蓄积的性质， 并具有使脑内淀粉样蛋白显像的 能力。
( 实施例 II-14) 使用注射淀粉样蛋白的大鼠模型进行的化合物 11 的离体放射自 显影图
进行与实施例 II-13 同样的操作， 除了使用将化合物 11 溶解在 10mg/mL 抗坏血酸 溶液中而成的溶液 ( 在样品溶液中的放射性浓度为 30MBq/mL) 作为样品溶液。
图 15 显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠脑切片的放射自显影图和硫磺素 T 染色 的图像。如图 15 所示， 在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到明显的放射性蓄 积。由硫磺素 T 染色的结果， 确认了在该蓄积位点存在着淀粉样蛋白 ( 图 15b)。另一方面，
与其他位点相比， 在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到显著的放射性蓄积。这 些结果启示， 化合物 11 具有在脑内淀粉样蛋白上蓄积的性质， 并具有使脑内淀粉样蛋白显 像的能力。
( 实施例 II-15) 回复突变试验
为了检验化合物 8 的基因诱变性， 使用鼠伤寒沙门氏菌 TA98 和 TA100 进行回复突 变试验 ( 以下称作 Ames 试验 )。
本试验在没有添加 S9mix 和添加 S9mix 的情况下进行。将二甲亚砜用作阴性对 照。阳性对照在不添加 S9mix 的情况下使用 2-(2- 呋喃基 )-3-(5- 硝基 -2- 呋喃基 ) 丙烯 酰胺， 在添加 S9mix 的情况下使用 2- 氨基蒽。
加入到试验平板上的化合物 8 的量是 7 个剂量 ( 几何比 ： 3)， 最大剂量是 5000μg/ 板。在将化合物 8 和试验菌株 (TA98 或 TA100)、 或者将化合物 8、 S9mix 和试验菌株混合 在一起后， 用软琼脂在试验平板的培养基上将混合物重叠成多层， 然后在 37℃下培养 48 小 时。通过在培养后将板上的回复突变的菌落数计数来进行判断， 当回复突变的菌落数不小 于阴性对照的 2 倍以上、 且显示浓度依赖性增加时， 判定诱变性呈阳性。
结果如表 8 所示。在用化合物 8 处理的组中各试验菌株的回复突变菌落数均小于 用阴性对照物处理的组中回复突变菌落数的 2 倍， 而不论各菌株中是否加入了 S9mix 以及 受试样品的添加量是多少。另一方面， 在用阳性对照物处理的组中观察到了突变回复菌落 数显著增加。从上述结果可以判定， 化合物 8 在 Ames 试验中呈阴性， 没有基因诱变性。
表8： Ames 试验的结果
( 实施例 III-1 至实施例 III-2) 与淀粉样蛋白结合性的确认
为了研究本发明化合物的结合机制， 使用以糊精作为前体化合物产生的淀粉样蛋 白进行抑制与硫磺素 T 结合的实验。 糊精是在 I I 型糖尿病中蓄积在胰脏中的淀粉样蛋白。
方法
(1) 将糊精 ( 人 )( 由 Wako 公司制 ) 溶解于磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中， 在 37℃振 荡 72 小时， 以获得 1mg/mL 的凝集糊精混悬液 ( 以下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋白混悬 液 )。
(2) 根据文献 (Naiki， H. 等人， Labeled Investigation， 74， p.374-383(1996)) 所述的方法， 基于使用硫磺素 T( 由 Fluka 公司制 ) 的荧光分光光度法， 进行该淀粉样蛋白 混悬液的定性实验， 以证实在 (1) 中获得的凝集糊精是淀粉样蛋白 ( 测定条件 ： 激发波长 446nm， 荧光波长 490nm)。
(3) 将该淀粉样蛋白混悬液以糊精浓度为 15μM 溶解于 50mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中。同时， 将硫磺素 T 以 15μM 的浓度溶解于 50mM 甘氨酸 -NaOH 缓冲液 (pH 8.5) 中。
(4) 配制将各评价化合物和淀粉样蛋白溶解于 50mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中、 且 最终浓度分别如表 9 所示的样品。将 (3) 中制备的各 50μL 的淀粉样蛋白溶液和硫磺素 T 溶液、 以及 50μL 的样品溶液填充在 96 孔微量培养板的各孔中 ( 体积约 0.3mL)。
表9： 样品溶液中各化合物的最终浓度
(5) 制备混合了 100μL 的 50mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 和 50μL 的 50mM 甘氨 酸 -NaOH 缓冲液 (pH 8.5) 的样品作为空白， 进行与 (4) 同样的操作， 用于计算抑制率 ( 以 下称作 BG)。
(6) 将填充有样品溶液的微量培养板在室温下静置 30 小时。然后， 用微量培养板 读板器 ( 型号 ： SPECTRA MAX GEMINI XS， 由 Molecular Devices 公司制 ) 测定各样品溶液 的荧光强度 ( 测定条件 ： 激发波长 446nm， 荧光波长 490nm)( 以下， A 表示各评价化合物的浓 度为零 (0) 的样品中的荧光强度， B 表示各评价化合物的浓度为 1.5μmol/L 以上的样品中 的荧光强度 )。
(7) 使用在上述 (6) 中测定的荧光强度， 通过下式 (5) 求出抑制率 ：
各评价化合物的抑制率如表 10 所示。任意浓度的化合物 1 和 2 都抑制了硫磺素 T 的结合。该结果表明， 化合物 1 和 2 竞争性地抑制硫磺素 T 的结合。一般已知， 硫磺素 T 通过识别淀粉样蛋白的 β- 折叠结构而与之结合。因此， 这启示， 化合物 1 和 2 具有与硫磺 素 T 相同的与淀粉样蛋白结合的机制， 即， 识别 β- 折叠结构而与之结合。
表 10 ： 本发明化合物对硫磺素 T 与淀粉样蛋白 ( 糊精 ) 结合的抑制率 (％ )
( 实施例 III-3) 与淀粉样蛋白亲和性的测定
通过以下体外结合试验评价本发明化合物的淀粉样蛋白亲和性。
方法
(1) 使用实施例 III-1 和 III-2 所述的方法， 制备 1mg/mL 的凝集糊精的混悬液 ( 以 下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋白混悬液 )。
通过以下操作 (2) 和 (3) 制备具有交联 β- 折叠结构的胰岛素， 操作 (2) 和 (3)
是对已知的文献 (Burke， M.J. 等人， Biochemistry.11， p.2435-2439(1972)) 中所述的方法 进行了少许变更的方法。
(2) 将 5mg 胰岛素 ( 由 Sigma Aldrich Japan 制 ) 溶解于用盐酸调节至 pH 2 的 1mL 去离子水中， 将该反应混合物在 90℃下加热 10 分钟， 然后在干冰 / 乙醇中急速冷却。
(3) 将 (2) 的样品溶液在 90℃下加热 5 分钟， 然后在干冰 / 乙醇中急速冷却。在 重复同样的操作 10 次后， 目测确认样品溶液变成凝胶形式。
(4) 将 (3) 的样品离心分离 (16000g×15 分钟 )， 然后除去上清液， 用 1mL 的去离 子水溶解沉淀， 得到凝集胰岛素的混悬液 ( 以下， 在本实施例中， 称作胰岛素淀粉样蛋白混 悬液 )。
通过以下操作 (5) 和 (6) 制备具有交联 β- 折叠结构的 β2- 微球蛋白， 操作 (5) 和 (6) 是在已知文献 (Ohhashi， Y. 等人， Biochemistry. 等人， Journal of Biological Chemistry.280， p.32843-32848(2005)) 中所述的方法， 但对其进行了少许变更。
(5) 向 β2- 微球蛋白 ( 由 Oriental Yeast Co.， 1td. 制 ) 的 1mg/mL 溶液添加包 含 100mM NaCl 的 50mM 甘氨酸 -HCl 缓冲液 (pH 2.5)， 然后在超声热水槽中、 在 37℃下超声 处理 1 分钟， 然后在没有超声波处理的情况下在 37℃加热 9 分钟
(6) 在重复 (5) 的操作 17 次后， 对该样品溶液进行与上述 (2) 同样的处理。将样 品溶液离心分离 (16000g×15 分钟 )， 然后除去上清液， 将沉淀物溶解于 0.5mL 的包含 100mM NaCl 的 50mM 甘氨酸 -HCl 缓冲液 (pH 2.5) 中， 得到凝集 β2- 微球蛋白的混悬液 ( 以下， 在 本实施例中， 称作 β2-m- 淀粉样蛋白混悬液 )。
(7) 根据实施例 III-1 和实施例 III-2 所述的基于使用硫磺素 T( 由 Fluka 公司 制 ) 的荧光分光光度法进行的定性实验， 确认了在 (4) 和 (6) 中得到的凝集胰岛素和凝集 β2 微球蛋白是淀粉样蛋白。
(7) 制备通过上述实施例 I-3 的方法合成的化合物 6 的溶液 ( 放射性浓度为 500MBq/mL)， 用包含 0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 稀释， 制备 2-(4′ - 羟 基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的总量为 1.0-101.0pM 溶液。
(8) 向 96 孔微量培养板的各孔中添加 50μL 上述 (7) 制备的溶液 ( 最终浓度为 0.2-20.2pM) 和将糊精淀粉样蛋白混悬液、 胰岛素淀粉样蛋白混悬液或 β2-m- 淀粉样蛋白 混悬液用含有 0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (pH7.4) 稀释而成的 50μL 溶液 ( 最终 浓度为 0.8μg/mL)， 然后加入 150μL 相同的缓冲液。
(9) 将该微量培养板在 22℃以指定速率 (400rpm) 振荡 3 小时。然后让各孔的混 合液通过玻璃纤维过滤器 ( 商品名 ： MulutiscreenTM-FC， 由 Millipore 公司制 ) 过滤， 以从 游离的化合物 6 中分离出与淀粉样蛋白结合的化合物 6。
(10) 将过滤混合液后的玻璃纤维过滤器用含有 0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓 冲液洗涤 (0.2mL×5 次 )， 然后用 Autowell Gamma 系统 (Aloka 公司制， 型号 ： ARC-7001) 测 定该玻璃纤维过滤器的放射性。
(11) 由 (10) 的测定结果评价化合物 6 与淀粉样蛋白的结合量与淀粉样蛋白的添 加量之间的关系。由在上述 (8) 中没有添加淀粉样蛋白混悬液的样品， 确定非特异性结合 ( 实施例 I-3)。
样品溶液中的化合物 6 的浓度与上述 (11) 测定的玻璃纤维过滤器的放射性计数(CPM) 之间的关系如图 16 所示。在添加淀粉样蛋白混悬液的组 ( 图 16， 添加糊精淀粉样 蛋白的组、 添加胰岛素淀粉样蛋白的组和添加 β2-m- 淀粉样蛋白的组 ) 中， 放射性活度全 部高于不添加淀粉样蛋白混悬液的组 ( 图 16， 没有添加淀粉样蛋白的组 )， 且玻璃纤维过滤 器上的放射性活度随化合物 6 的添加浓度呈比例地增加。在本实验的条件中， 所有的淀粉 样蛋白 ( 以及与化合物 6 结合的淀粉样蛋白 ) 都大于玻璃纤维的孔径。因此， 淀粉样蛋白 被保持在玻璃纤维上， 玻璃纤维的放射性计数是反映与淀粉样蛋白结合的化合物 6 的量的 值。因为玻璃纤维的放射性计数的数值随化合物 6 的浓度的增加而增加、 并且其放射性活 度比没有添加淀粉样蛋白的组高， 因此表明化合物 6 是具有与淀粉样蛋白特异性结合的性 质的化合物。
( 实施例 IV) 各器官中放射性分布率的测定
为了证明本发明化合物能分布于靶器官中并具有良好的清除到体外的性质， 使用 化合物 6 在 SD 大鼠 (8 周龄 ) 中测定向各器官的放射性蓄积的经时变化。
向 400μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的乙 腈溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加入 400μL 的 1mol/L 硫酸、 10μL 的 1mmol/L 碘化钠、 270μL 123 的 1074MBq 的 [ I] 碘化钠和 10μL 的 30％ (W/V) 过氧化氢。 将该混合液在 40℃下静置 10 123 分钟后， 在下述条件下进行 HPLC， 以获得 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶级分。
HPLC 条件 ：
色谱柱 ： YMC-Pack Pro C8( 商品名 ； YMC 公司制 ； 规格 ： 4.6x150mm)
流动相 ： 10mM 甲酸 (pH 3.0)/ 乙腈＝ 80/20 → 80/20 → 10/90(0 分钟 -20 分钟 -30 分钟 )
流速 ： 1.0mL/ 分钟
检测器 ： 紫外可见吸光光度计 ( 检测波长 ： 254nm) 和放射性计数器 (Raytest 公司 制； 型号 ： STEFFI)
向该级分中加入 10mL 水。 让所得溶液通过 Sep-Pak C18 柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注 册商标 )Light C8 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附 123 收集 [ I]-2-(4 ′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 123 1mL 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 化合物 6)。 在合成刚结束时， 所得化合物的放射性活度是 470MBq。此外， 在下述条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 98％。
TLC 分析条件 ：
TLC 板 ： 硅胶 60F254( 商品名 ； 由默克公司制 )
流动相 ： 乙酸乙酯 / 甲醇 / 二乙胺＝ 100/4/1
检测器 ： Rita Star( 商品名 ； raytest 公司制 )
用包含 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液稀释化合物 6 的乙醚溶液， 并调节放射 性浓度至 8-12MBq/mL。在无麻醉下将 0.2mL 所制备的样品溶液给药于上述大鼠的尾静脉。 通过从腹部大动脉放血来处死这些大鼠， 在给药后 5， 30， 60 和 180 分钟移取表 11 所示的各 器官。采用与实施例 II-11 同样的方法， 测定各移取器官的质量和放射性。同时， 测定移取 器官后大鼠全身 ( 以下称作全身其余部分 ) 的放射性。使用这些测定结果， 根据下式 (6)计算各时间点的各器官每单位重量的放射性分布 (％ ID/g)
在各个时间点， 使用 3 只动物进行实验。
RT ： 靶器官的放射性 (cpm) S
R ： 所有器官的放射性总和 (cpm) R
R ： 全身其余部分的放射性 (cpm) T
M ： 靶器官的质量 (g)
结果如表 11 所示。如表 11 所示， 在给药后 5 分钟的时间点， 化合物 6 分布于各器 官， 随后大部分放射性分布于小肠和大肠。此外， 其放射性分布从小肠向大肠转移。因此我 们发现， 化合物 6 在给药后迅速经胆汁排泄， 并良好地清除到体外。
同时， 观察认为淀粉样蛋白蓄积于其中的脑、 心脏、 肺、 胰脏和骨， 在给药后 5 分钟 的时间点在所有这些器官中都发现了明显的放射性蓄积， 因此证实了化合物 6 的分布。此 外， 给药后 5 分钟的时间点与给药后 180 分钟的时间点之比 (( 给药后 5 分钟的时间点的％ ID/g)/( 给药后 180 分钟的时间点的％ ID/g)) 显示出了高值， 例如， 脑为 122， 心脏为 13， 肺 为 7， 胰脏为 14， 骨为 4。 因此表明， 在认为淀粉样蛋白会蓄积的器官中显示了迅速的放射性
分布和迅速的清除性。
由上述可见， 实现了对生物组织中的淀粉样蛋白检测试剂来说所需要的给药后早 期的放射性分布以及迅速的体外清除性。
表 11
产业实用性
本发明的用于检测生物组织中的淀粉样蛋白的试剂可用作淀粉样变性病例如全 身性淀粉样变性病中的淀粉样蛋白的体外和体内诊断剂。