源于桔青霉的penicitrinine A及其制备抗人胃癌药物的应用技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种源于桔青霉的penicitrinineA及其制备抗人胃癌药物的应用。
背景技术
生物碱是一类由生物次级代谢产生的含氮有机化合物，自然界中的生物碱种类较多，大多来源于植物，因此又有植物碱之称。生物碱对人和动物有重要的生理作用，包括平喘镇咳、降血糖、降血脂、抗菌、抗肿瘤、镇痛等，其中以抗菌、抗肿瘤活性最为突出。天然结构生物碱是创新药物研究中发现先导化合物的重要来源，目前应用于临床的生物碱药物已经近百种。研究发现，一些海洋真菌能够在次级代谢过程中产生结构新颖、活性好的生物碱,具有很好的药用和产业化前景。
本发明人研究得知，桔青霉(Penicilliumcitrinum)IBPT-5，(已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号是：CCTCCNO：M2013713)的发酵产物的粗提取物有很好的细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现所示生物碱类化合物具有抗人胃癌活性，目前尚未见该化合物对人胃癌细胞SGC-7901、BGC-823、HGC-27的增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种源于桔青霉的penicitrinineA及其制备抗人胃癌药物的应用。该化合物具有抑制人胃癌细胞增殖作用，具有抗人胃癌活性。其结构式为：
。
该化合物的制备方法，是通过发酵培养桔青霉(Penicilliumcitrinum)IBPT-5，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。具体步骤如下：
1发酵生产
培养微生物的常规方法，取桔青霉(Penicilliumcitrinum)IBPT-5接种到PDA固体斜面培养基上在28℃培养箱中培养4天，然后接种到培养液中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液；所述培养液组成：每升水含甘露醇20.0g、酵母膏3.0g、麦芽糖20.0g、味精10.0g、葡萄糖10.0g、KH2PO40.5g、MgSO40.3g、NaCl30.0g；
2浸膏的获得
用纱布将菌丝体和发酵液分离。将发酵液用乙酸乙酯1:2(v/v)萃取两次，萃取液减压蒸馏至干，得到发酵液的乙酸乙酯浸膏32.0g。
3化合物的分离精制
该浸膏通过100-200目硅胶拌样后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为洗脱液用减压硅胶色谱柱梯度洗脱，得到11个组分。组分7(4.2g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脱物)以二氯甲烷：甲醇为洗脱液，进一步通过加压硅胶柱层析梯度洗脱，得到的亚组分7-6(二氯甲烷：甲醇v/v=50:1的洗脱物)通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250mm，5μm)：分离流速为5mL/min，流动相为75%乙腈含0.1%TFA，得到所示化合物(97.9mg，tR19.3min)。
所述桔青霉(Penicilliumcitrinum)IBPT-5，已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号是：CCTCCNO：M2013713。
所述的化合物在制备抑制人胃癌细胞增殖药物中的用途，及该化合物在制备抗人胃癌药物中的用途。所述肿瘤细胞为人胃癌细胞SGC-7901、BGC-823、HGC-27。
本发明的显著优点：研究所示该生物碱化合物较为罕见，所述生物碱类化合物具有显著的抑制人胃癌细胞增殖活性，目前尚未见该化合物对人胃癌细胞SGC-7901、BGC-823、HGC-27增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
附图说明
图1PenicitrinineA主要的COSY，HMBC和NOESY信号。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的化合物的化学结构：
。
实施例1该化合物的发酵生产及分离精制
1发酵生产
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取桔青霉（Penicilliumcitrinum）IBPT-5(已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号是：CCTCCNO：M2013713)接种到PDA固体斜面培养基上在28℃培养箱中培养4天。
取斜面培养4天的桔青霉（Penicilliumcitrinum）IBPT-5接种到装有400mL培养液[培养液组成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麦芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，KH2PO40.5，MgSO40.3，NaCl30.0定容]的1000mL锥形瓶中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液。
2浸膏的获得
用纱布将菌丝体和发酵液分离。将发酵液用乙酸乙酯1:2(v/v)萃取两次，萃取液减压蒸馏至干，得到发酵液的乙酸乙酯浸膏32.0g。
3化合物的分离精制
该浸膏通200目硅胶拌样后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为洗脱液用减压硅胶色谱柱梯度洗脱，得到11个组分。组分7(4.2g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脱物)以二氯甲烷：甲醇为洗脱液，进一步通过加压硅胶柱层析梯度洗脱，得到的亚组分7-6(二氯甲烷：甲醇v/v=50:1的洗脱物)通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250mm，5μm)：分离流速为5mL/min，流动相为75%乙腈含0.1%TFA，得到所示化合物(97.9mg，tR19.3min)。
化合物黄色油状，高分辨质谱HRESI-MS在m/z484.2711处给出分子离子峰[M–H]–，(calcd.forC28H38NO6,484.2705)，提示分子量为485，结合波谱信息推测分子式为C28H39NO6。1H和13C-NMR数据见表1，主要的COSY，HMBC和NOESY信号见图1。
表1NMR化合物的1H和13C-NMR数据(500MHz1Hand125MHz13C，inCDCl3)
实施例2体外抗肿瘤活性的测试
1实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制测试样品为上述实施1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养采用肿瘤细胞系，肿瘤细胞用含10%FBS的RPMI1640培养基，在37℃于通入5%CO2的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法
WST-1法取对数生长期的肿瘤细胞，将细胞密度调至每毫升5×104个细胞，按每孔100μL接种于96孔细胞培养板中，于37℃通入5%CO2的培养箱中培养过夜。吸去上清液，加入含样品的培养基100μL，继续培养48h。每孔加入10μLWST-1液，培养4h。利用Bio-Rad公司产680型酶标仪测定每孔在450nm处的吸光值(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置五孔，另设五孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取五孔平均OD值按IR(%)=(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100%式计算每个浓度下细胞增殖抑制率(IR%)。
2.实验结果
细胞增殖抑制活性测试结果
在WST-1法测试中，根据不同浓度的该化合物的肿瘤细胞增殖抑制率，应用SPSS16.0软件进行数据处理并计算半数抑制浓度IC50值。结果见表2。
表2化合物对人胃癌细胞增殖的抑制活性
3.结论
该化合物对人胃癌细胞SGC-7901、BGC-823、HGC-27具有较好的抗肿瘤活性。可作为制备人胃癌细胞增殖抑制药物或抗肿瘤药物用于人胃癌的研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。