吡咯并嘧啶基 AXL 激酶抑制剂 本申请要求 2009 年 2 月 9 日提交的美国专利申请 No. 61/207,292 的权益。技术领域 本发明一般地涉及抑制蛋白激酶活性的稠合的 5,6 杂环化合物及相关的组合物 和方法。具体地说， 本发明涉及 7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨基化合物， 该化合物抑制 蛋白激酶 ( 例如 Axl) 活性， 可用于治疗癌症和增殖过度性疾病。
背景技术 癌症 ( 及其它增殖过度性疾病 ) 的特征是细胞增殖失控。细胞增殖的正常控制的 这种丧失常常是由于通过细胞周期控制进展的细胞通道的遗传性损伤造成的。 细胞周期由 DNA 合成 (S 期 )、 细胞分裂或有丝分裂 (M 期 ) 和被称作间隙 1(G1) 和间隙 2(G2) 的非合成 阶段组成。M 期由有丝分裂和胞质分裂构成 ( 分裂成两个细胞 ) 细胞周期中的所有阶段均 由有序级连的蛋白质磷酸化控制。几个蛋白激酶家族参考与了这些磷酸化步骤的进行。此 外， 人类肿瘤中的很多蛋白激酶的活性都比正常组织内的增高， 这种增高的活性可由很多 因素造成， 包括 ： 1) 激酶浓度增高， 或 2) 辅激活蛋白或抑制蛋白的表达改变。
细胞具有控制细胞周期从一个时相向另一时相转换的蛋白质。例如， 周期蛋白是 这样的一族蛋白质， 其浓度在整个细胞周期中增高和降低。周期蛋白在合适时启动不同的 周期蛋白依赖性蛋白激酶 (CDK)， 它们将细胞周期进展所必需的底物磷酸化。 特定的 CDK 在 特定时间的活性对于细胞周期的起动和协调进行都是至关重要的。例如， CDK1 是调节 M 期 活性的最主要的细胞周期调节物。然而， 已经确定了参与 M 期的很多其它的有丝分裂蛋白 激酶， 包括 Polo、 aurora 和 NIMA(Never-In-Mitosis-A) 家族的成员， 以及与有丝分裂关卡、 有丝分裂出口和胞质分裂有牵连的激酶。
Axl 是一种受体酪氨酸激酶 ( 配体 ： 生长停滞特异蛋白 6， Gas6)， 其特点在于有两 个串联的免疫球蛋白样重复单元和两个 III 型纤连蛋白重复单元， 这是细胞粘着分子的共 同特性。 为此， 它有自己的家族 ： 酪氨酸激酶的 Axl/Ufo 亚族。 Axl/Gas6 的表达已经显示在 许多人类恶性肿瘤中， 包括卵巢癌、 黑素瘤、 肾细胞癌、 子宫平滑肌瘤、 子宫内膜癌、 甲状腺 癌、 胃癌、 乳腺癌、 非小细胞肺癌 (NSCLC)、 慢性髓性白血病 (CML)、 急性髓性白血病 (AML)、 结肠直肠癌、 前列腺癌、 各种淋巴瘤以及食管癌、 因此， Axl 原癌基因对于新治疗药物的发现 和研制是有吸引力和有价值的目标。
Axl 还与炎性通道， 包括类风湿性关节炎有关。例如参见 ：
因此， Axl 的抑制会影响以下病痛， 例如哮喘， 慢性支气管炎， 慢性阻塞性肺 病， 成人呼吸窘迫综合症， 婴儿呼吸窘迫综合症， 咳嗽， 动物的慢性阻塞性肺病， 溃疡性结肠 炎， 克罗恩病， 胃酸分泌过多， 细菌、 真菌或病毒诱发的脓毒症或脓毒性休克， 内毒素性休 克， 马的蹄叶炎或绞痛， 脊髓创伤， 头损伤， 神经源性炎症， 疼痛， 脑的再灌注损伤， 银屑病关节炎， 类风湿性关节炎， 强直性脊柱炎， 骨关节炎， 炎症， 或与细胞因子活性有关的细胞因子 介导的慢性组织变性。Axl 的抑制对于非恶性肿瘤例如卡斯尔曼病的治疗也会有好处。
国际专利出版物 No. WO 2007089768 描述了作为 JAK-2 调节剂的 4- 芳基 -2- 氨 基嘧啶或 4- 芳基 -2- 氨基烷基嘧啶化合物及其制备、 药物组合物和在治疗疾病中的应用。
以下化合物在某些化合物库中是已知的 ：。
国际专利出版物 No. WO 2006055351 描述了可用于鉴别化合物的响应天然奎 宁的核糖开关的原子结构， 包括次黄嘌呤结合口袋的原子结构。国际专利出版物 No. WO 2004042029 描述了可用于调节靶核酸的表达的组合物， 包括能与靶核酸和第二低聚体杂交 的第一低聚体， 和第二低聚体。由于 Axl 激酶与许多人类恶性肿瘤和炎症有关， 因此需要设计特异的和选择性的 抑制剂， 用于治疗由 Axl 激酶介导的和 / 或与其有关的癌症、 炎症和其它病况。本发明满足 了这些需要并提供了其它的相关优点。
发明概述 本发明一般地涉及具有以下通式 (I) 的化合物 ：
该化合物可用于治疗由 Axl 激酶介导的或与其有关 ( 至少是部分地 ) 的疾病， 例如癌 症。它们可以被配制成用于对有需要的治疗对象给药的可药用的组合物。
本发明化合物还可用于治疗或预防以下疾病 ： 哮喘， 慢性支气管炎， 慢性阻塞性 肺病， 成人呼吸窘迫综合症， 婴儿呼吸窘迫综合症， 咳嗽， 动物的慢性阻塞性肺病， 溃疡性结 肠炎， 克罗恩病， 胃酸分泌过多， 细菌、 真菌或病毒诱发的脓毒症或脓毒性休克， 内毒素性休 克， 马的蹄叶炎或绞痛， 脊髓创伤， 头损伤， 神经源性炎症， 疼痛， 脑的再灌注损伤， 银屑病关 节炎， 类风湿性关节炎， 强直性脊柱炎， 骨关节炎， 炎症， 或与细胞因子活性有关的细胞因子介导的慢性组织变性。本发明化合物对于非恶性肿瘤例如卡斯尔曼病的治疗也会有好处。
本发明的这些方面和其它方面在参考以下的详细说明时将会显而易见。为此， 在 本文中引用了一些专利及其它文献， 以便更具体地阐明本发明的各个方面。这些文献都以 参考引用的方式全文并入本文中。
发明详述 本发明一般地涉及具有以下式 (I) 通用结构的化合物 ：及其可药用盐， 其中 ： X 是 -NH-， S， 或直接键 ； Y 是 -NH- 或 S ； A 是芳基或杂芳基 ； B 是 -O-C1-4 烷基 -N(C0-4 烷基 )(C0-4 烷基 )， 或任选被 -CN 取代的 C1-4 烷基， 或者 B 是杂环基， -C(O)- 杂环基， -NH- 杂环基， 或 -O-C0-4 烷基杂环基 ； 1a R 是 C0-4 烷基 ； R1 是卤素， -CN， -OH， C0-4 烷基， 卤素取代的 C1-4 烷基， -COOH， 或 -CONH2 ； 2 R 在每种情形均独立地是 -CN， 卤素， C0-4 烷基， -O-C1-4 烷基， -O-C1-4 卤烷基， 或 -N(Rb) (Ra) ； 或任选被卤素、 -CN、 -O-C1-4 烷基或 -O-C1-4 卤烷基取代的 C1-4 烷基 ； Ra 和 Rb 在每种情 形均独立地是 C0-4 烷基或 -C(O)-C3-6 环烷基 ； R3 在每种情形均独立地是 -CN， C0-4 烷基， 卤素， C0-4 烷基 -N-(C0-4 烷基 )(C0-4 烷基 )， C3-8 环烷基， -S(O)2-CH3 或 -C(O)-O-C1-4 烷基芳基 ； 或任选被 1-6 个独立地卤素或 OH 取代基取 代的 C1-4 烷基 ； R4 是 C0-4 烷基， 卤素， 或卤素取代的 C1-4 烷基 ； m 是 0、 1、 2或3； 和 n 是 0、 1、 2或3； 条件是， 该化合物不是。在本发明的一个方面， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用盐， 其中 X 是 -NH-， 其它变量与以上对式 (I) 的定义相同。
在这方面的一项实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的一项实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是芳基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是任选被 -CN 取代的 C1-4 烷基， 其它变量同以上 对式 (I) 的定义。
在这方面的又一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用的 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是 -C(O)- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定 义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是 -O-C1-4 烷基 -N(C0-4 烷基 )(C0-4 烷基 )， 其它变 量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是 -NH- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定 义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是 -O-C0-4 烷基杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是 -C(O)- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定 义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是任选被 -CN 取代的 C1-4 烷基， 其它变量同以上 对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用
盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是 -C(O)- 杂环基， R1 是 H， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是杂环基， R1 是 H， 其它变量同以上对式 (I) 的定 义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是任选被 -CN 取代的 C1-4 烷基， R1 是 H， 其它变量 同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是 -O-C1-4 烷基 -N(C0-4 烷基 )(C0-4 烷基 )， 其它变 量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是 -NH- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定 义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是 -NH-， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是 -O-C0-4 烷基杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是芳基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是任选被 -CN 取代的 C1-4 烷基， 其它变量同以上 对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是 -C(O)- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的 定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是 -O-C1-4 烷基 -N(C0-4 烷基 )(C0-4 烷基 )， 其它 变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是 -NH- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定 义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是芳基， B 是 -O-C0-4 烷基杂环基， 其它变量同以上对式 (I)的定义。 在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是 -C(O) 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的 定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是任选被 -CN 取代的 C1-4 烷基， 其它变量同以上 对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是 -C(O)- 杂环基， R1 是 H， 其它变量同以上对 式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是杂环基， R1 是 H， 其它变量同以上对式 (I) 的 定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是任选被 -CN 取代的 C1-4 烷基， R1 是 H， 其它变 量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是 -O-C1-4 烷基 -N(C0-4 烷基 )(C0-4 烷基 )， 其它 变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -NH-， A 是苯基， B 是 -NH- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定 义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是苯基， B 是 -O-C0-4 烷基杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是芳基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是芳基， B 是任选被 -CN 取代的 C1-4 烷基， 其它变量同以上 对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是芳基， B 是 -C(O)- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的 定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是芳基， B 是杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是芳基， B 是 -O-C1-4 烷基 -N(C0-4 烷基 )(C0-4 烷基 )， 其它变 量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是芳基， B 是 -NH- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定 义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是芳基， B 是 -O-C0-4 烷基杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是苯基， B 是 -C(O)- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的 定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是苯基， B 是杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是苯基， B 是任选被 -CN 取代的 C1-4 烷基， 其它变量同以上 对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是苯基， B 是 -C(O)- 杂环基， R1 是 H， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是苯基， B 是杂环基， R1 是 H， 其它变量同以上对式 (I) 的 定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是苯基， B 是任选被 -CN 取代的 C1-4 烷基， R1 是 H， 其它变量 同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是苯基， B 是 -O-C1-4 烷基 -N(C0-4 烷基 )(C0-4 烷基 )， 其它变 量同以上对式 (I) 的定义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是苯基， B 是 -NH- 杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定 义。
在这方面的另一实施方案中， 本发明化合物是式 (I) 描述的化合物及其可药用 盐， 其中 X 是直接键， Y 是 -S-， A 是苯基， B 是 -O-C0-4 烷基杂环基， 其它变量同以上对式 (I) 的定义。
这些化合物具有范围广阔的治疗用途， 可用于治疗由 Axl 激酶介导和 / 或与其有 关 ( 至少是部分地 ) 的疾病， 例如癌症。因此， 在本发明的一个方面， 本文所述的化合物被 配制成可药用的组合物， 用于向有需要的治疗对象施用。
在另一方面， 本发明提供用于治疗或预防 Axl 激酶介导的疾病 ( 例如癌症 ) 的方法， 该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本文描述的化合物或含有所述化 合物的可药用的组合物。
另一方面涉及抑制生物样本中的 Axl 激酶活性， 该方法包括使生物样本与本文所 述的化合物或含有该化合物的可药用组合物接触。
再一方面涉及抑制患者中 Axl 激酶活性的方法， 该方法包括对患者施用本文所述 的化合物或含有该化合物的可药用的组合物。
本发明的这些方面和其它方面在参考以下的详细说明时将会显而易见。为此， 本 文中引用了一些专利及其它文献， 以便更具体地阐明本发明的各个方面。这些文献均以参 考引用的方式全文并入本文。
除非另外说明， 在说明书和权利要求中使用的以下术语具有下面讨论的含义 ： “烷基” 指 1 至 6 个碳原子、 优选 1 至 4 个碳原子的饱和的直链或支链烃基， 例如甲基、 乙基、 丙基、 2- 丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁基、 戊基、 己基等， 优选甲基、 乙基、 丙基或 2- 丙 基。 代表性的饱和的直链烷基包括甲基、 乙基、 正丙基、 正丁基、 正戊基、 正己基等 ； 而饱和的 支链烷基包括异丙基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 异戊基等。环形的烷基在本文中被称作 “环 烷基” 。 不饱和的烷基在相邻的碳原子之间含有至少一个双键或三键 ( 分别称为 “烯基” 或 “炔基” )。代表性的直链和支链烯基包括乙烯基、 丙烯基、 1- 丁烯基、 2- 丁烯基、 异丁烯 基、 1- 戊烯基、 2- 戊烯基、 3- 甲基 -1- 丁烯基、 2- 甲基 -2- 丁烯基、 2,3- 二甲基 -2- 丁烯基 等； 而代表性的直链和支链炔基包括乙炔基、 丙炔基、 1- 丁炔基、 2- 丁炔基、 1- 戊炔基、 2- 戊 炔基、 3- 甲基 -1- 丁炔基等。
“C0-4 烷基” 指具有 0、 1、 2、 3 或 4 个碳原子的烷基。有 0 个碳原子的 C0-4 烷基在末 端时是一个氢原子， 在连接时是一个直接键。
“亚烷基” 是指 1 至 6 个碳原子的直链饱和二价烃基， 或 3 至 6 个碳原子的支链饱 和二价烃基， 例如， 亚甲基、 亚乙基、 2,2- 二甲基亚乙基、 亚丙基、 2- 甲基亚丙基、 亚丁基、 亚 戊基等， 优选亚甲基， 亚乙基或亚丙基。
“环烷基” 指 3 至 8 个碳原子的饱和的环形烃基， 例如环丙基、 环丁基、 环戊基或环 己基。
“烷氧基” 指基团 -ORa， 其中 Ra 是如上定义的烷基， 例如， 甲氧基、 乙氧基、 丙氧基、 丁氧基等。
“卤素” 是指氟、 氯、 溴或碘， 优选氟和氯。
“卤烷基” 指被一个或多个， 优选 1、 2 或 3 个相同或不同的卤原子取代的烷基， 例 如 -CH2Cl、 -CF3、 -CH2CF3、 -CH2CCl3 等。
“卤代烷氧基” 是指基团 -ORb， 其中 Rb 是如上定义的卤烷基， 例如三氟甲氧基、 三氯 乙氧基、 2,2- 二氯丙氧基等。
“酰基” 指基团 -C(O)Rc， 其中 Rc 是氢、 烷基或如上定义的卤烷基， 例如甲酰基、 乙酰 基、 三氟乙酰基、 丁酰基等。
“芳基” 指 6 至 12 个碳原子的全碳单环或稠合多环 ( 即， 共享相邻的碳原子对的 多个环 ) 基团， 它具有完全共轭的 π 电子体系。芳基的实例 ( 但不是限制 ) 是苯基、 萘基 和蒽基。芳基可以是取代的或未取代的。除非另外专门指出， “取代的芳基” 指被一个或多
个， 更优选 1、 2 或 3 个， 甚至更优选 1 或 2 个取代基取代的芳基， 所述取代基独立地选自 ： 烷 基 ( 其中该烷基可任选地被一个或二个取代基取代 )， 卤烷基， 卤素， 羟基， 烷氧基， 巯基， 烷 硫基， 氰基， 酰基， 硝基， 苯氧基， 杂芳基， 杂芳氧基， 卤烷基， 卤代烷氧基， 羧基， 烷氧羰基， 氨 基， 烷氨基， 二烷基氨基， 芳基， 杂芳基， 碳环或杂环 ( 其中芳基、 杂芳基、 碳环或杂环可任选 地被取代 )。
“杂芳基” 指 5 至 12 个环原子的单环或稠环 ( 即， 共享相邻原子对的多个环 ) 基 团， 其含有 1、 2、 3 或 4 个选自 N、 O 或 S 的环杂原子， 其余的环原子是碳， 另外， 还具有完全共 轭的 π 电子体系。未取代的杂芳基的实例 ( 但不是限制 ) 是吡咯、 呋喃、 噻吩、 咪唑、 唑、 噻唑、 吡唑、 吡啶、 嘧啶、 喹啉、 异喹啉、 嘌呤、 三唑、 四唑、 三嗪和咔唑。杂芳基可以是取代的 或未取代的。除非另外专门指出， “取代的杂芳基” 是指被一个或多个， 更优选 1、 2 或 3 个， 甚至更优选被 1 或 2 个取代基取代的杂芳基， 所述取代基独立地选自 ： 烷基 ( 其中该烷基可 以任选地被 1 或 2 个取代基取代 )， 卤烷基， 卤素， 羟基， 烷氧基， 巯基， 烷硫基， 氰基， 酰基， 硝 基， 卤烷基， 卤代烷氧基， 羧基， 烷氧羰基， 氨基， 烷氨基， 二烷基氨基， 芳基， 杂芳基， 碳环或 杂环 ( 其中芳基、 杂芳基、 碳环或杂环可任选地被取代 )。
“碳环” 指有 3 至 14 个环碳原子的饱和、 不饱和或芳族环系。术语 “碳环” ， 不管是 饱和的或部分不饱和的， 还表示任选被取代的环。术语 “碳环” 包括芳基。 “碳环” 一词还包 括与一个或多个芳族或非芳族环稠合的脂族环， 例如在十氢萘基或四氢萘基的情形， 其中 连接的基团或点是在脂族环上。碳环基团可以是取代的或未取代的。除非另外专门指出， “取代的碳环” 是指被一个或多个， 更优选被 1、 2 或 3 个， 甚至更优选被 1 或 2 个取代基取 代的碳环基团， 所述取代基独立地选自 ： 烷基 ( 其中该烷基可以任选地被 1 或 2 个取代基 取代 )， 卤烷基， 卤素， 羟基， 烷氧基， 巯基， 烷硫基， 氰基， 酰基， 硝基， 卤烷基， 卤代烷氧基， 羧 基， 烷氧羰基， 氨基， 烷氨基， 二烷基氨基， 芳基， 杂芳基， 碳环或杂环 ( 其中芳基、 杂芳基、 碳 环或杂环可任选地被取代 )。
“杂环” 指有 3 至 14 个环原子的饱和、 不饱和或芳族环系， 其中 1、 2 或 3 个环原子 是选自 N、 O 或 S(O)m( 其中 m 是从 0 到 2 的整数 ) 的杂原子， 其余的环原子是碳， 其中一或 二个 C 原子可任选地被羰基代替。 “杂环” 一词包括杂芳基。除非另外专门指出， “取代的 杂环基” 指的是被一个或多个， 优选 1、 2 或 3 个取代基独立取代的杂环基环， 所述取代基选 自： 烷基 ( 其中该烷基可任选地被 1 或 2 个取代基取代 )， 卤烷基， 环烷基氨基， 环烷基烷基， 环烷基氨基烷基， 环烷基烷基氨基烷基， 氰烷基， 卤素， 硝基， 氰基， 羟基， 烷氧基， 氨基， 烷氨 基， 二烷基氨基， 羟烷基， 羧烷基， 氨基烷基， 烷氨基烷基， 二烷氨基烷基， 芳烷基， 杂芳烷基， 芳基， 杂芳基， 碳环， 杂环 ( 其中芳基、 杂芳基、 碳环或杂环可任选地被取代 )， 芳烷基、 杂芳 烷基、 饱和或不饱和的杂环氨基， 饱和或不饱和的杂环氨基烷基， 以及 -CORd( 其中 Rd 是烷 基 )。更具体地说， 术语杂环基包括， 但不限于， 四氢吡喃基、 2,2- 二甲基 -1,3- 二氧杂环戊 烷、 哌啶基、 N- 甲基哌啶 -3- 基、 哌嗪基、 N- 甲基吡咯烷 -3- 基、 吡咯烷基、 吗啉基、 4- 环丙 基甲基哌嗪基、 硫吗啉基、 硫吗啉基 -1- 氧化物、 硫吗啉基 -1,1- 二氧化物， 4- 乙氧羰基哌嗪 基、 3- 氧代哌嗪基、 2- 咪唑烷酮、 2- 吡咯烷酮、 2- 氧代高哌嗪基、 四氢嘧啶 -2- 酮及它们的 衍生物。在一些实施方案中， 杂环基可任选地被 1 或 2 个取代基取代， 该取代基独立地选自 卤素、 烷基、 被羧基取代的烷基、 酯、 羟基、 烷氨基、 饱和或不饱和的杂环氨基、 饱和或不饱和 的杂环氨基烷基， 或二烷基氨基。“任选的” 或 “任选地” 意味着随后描述的事件或情况可以但不必须发生， 并且该描 述包括事件或情况发生以及不发生两种情形。例如， “任选地被烷基取代的杂环基团” 意味 着烷基可以但不必须存在， 该描述包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团被烷基取代 的情形。
最后， 除非另外说明， 本文中使用的术语 “取代的” 指的是以上任何基团 ( 例如， 烷基、 芳基、 杂芳基、 碳环、 杂环等 )， 其中至少一个氢原子被一个取代基代替。在氧代取代 基 (“=O” ) 的情形， 两个氢原子被代替。在本发明上下文中的 “取代基” 包括卤素、 羟基、 氧、 氰基、 硝基、 氨基、 烷氨基、 二烷基氨基、 烷基、 烷氧基、 硫烷基、 卤烷基 ( 例如 -CF3)、 羟烷 基、 芳基、 取代的芳基、 芳烷基、 取代的芳烷基、 杂芳基、 取代的杂芳基、 杂芳基烷基、 取代的 杂芳基烷基、 杂环、 取代的杂环、 杂环烷基、 取代的杂环烷基、 -NReRf、 -NReC(=O)Rf、 -NReC(=O) NReRf、 -NReC(=O)ORf、 -NReSO2Rf、 -ORe、 -C(=O)Re、 -C(=O)ORe、 -C(=O)NReRf、 -OC(=O)NReRf、 -S H、 -SRe、 -SORe、 -S(=O)2Re、 -OS(=O)2Re、 -S(=O)2ORe， 其中 Re 和 Rf 相同或不同， 独立地是氢、 烷 基、 卤烷基、 取代的烷基、 芳基、 取代的芳基、 芳烷基、 取代的芳烷基、 杂芳基、 取代的杂芳基、 杂芳基烷基、 取代的杂芳基烷基、 杂环、 取代的杂环、 杂环烷基或取代的杂环烷基。
具有相同的分子式， 但其原子键合的本质或顺序或者其原子在空间中的排列不同 的化合物被称作 “异构体” 。原子在空间中的排列不同的异构体被称作 “立体异构体” 。彼此 不为镜像的立体异构体被称作 “非对映异构体” ， 而彼此是不能重叠的镜像的则称作 “对映 异构体” 。当化合物有不对称中心时， 例如它与四个不同的基团结合， 则可能有一对对映异 构体。对映异构体可通过其不对称中心的绝对构型表征， 并用 Cahn 和 Prelog 的 R 和 S 顺 序规则描述 (Cahn, R., Ingold, C., and Prelog, V. Angew. Chew. 78:413-47, 1966; Angew. Chem. Internat. Ed. Eng. 5:385-415, 511, 1966) 或者根据分子使偏振光的平 面旋转的方式区分为右旋或左旋 ( 即， 分别为 (+) 或 (-) 异构体 )。手性化合物可以以个别 对映体的形式或以其混合物的形式存在。含等比例的对映异构体的混合物被称作 “外消旋 物” 。
本发明化合物可具有一个或多个不对称中心， 因此这些化合物可被制成个别的 (R) 或 (S) 立体异构体或其混合物。 除非另外指出， 在说明书和权利要求中具体化合物的描 述或命名准备包括个别对映体及其混合物 ： 外消旋物或非外消旋物。测定立体异构体的立 体化学结构及其分离方法是本领域熟知的 ( 参见 Advanced Organic Chemistry 第四版， 第 4 章的讨论， March, J., John Wiley and Sons, New York City, 1992)。
本发明化合物可显示互变异构和结构同分异构化现象。本发明包括具有调节 Axl 激酶活性的能力的任何互变异构形式或结构同分异构形式及其混合物， 不限于任何一种互 变异构或结构同分异构形式。
本发明化合物被认为会被有机体 ( 例如人 ) 内的酶代谢， 产生能够调节蛋白激酶 的活性的代谢物。这些代谢物是在本发明的范围之内。
本发明化合物或其可药用盐可以原样施用给人类患者， 或者以药物组合物的形式 施用， 在组合物中上述物质与合适的载体或赋形剂混合。配制和施用药物的技术可以在例 如 Remington’ s Pharmacological Sciences， Mack Publishing Co., Easton PA， 最新版 本中查到。
“药物组合物” 是指一种或多种本文所述的化合物或其可药用盐或前药与其它化学组分 ( 例如可药用的赋形剂 ) 的混合物。药物组合物的用途是使化合物对有机体的施用 更容易。
“可药用的赋形剂” 指的是加到药物组合物中进一步改善化合物的施用的惰性物 质。赋形剂的实例 ( 不是限制 ) 包括碳酸钙、 磷酸钙、 各种糖和淀粉、 纤维素衍生物、 明胶、 植物油和聚乙二醇。
“可药用的盐” 指的是保持母体化合物的生物效力和性质的那些盐。此类盐可以 包括 ： (1) 酸加成盐， 它通过母体化合物的游离碱与酸反应得到， 例如无机酸， 比如盐酸、 氢 溴酸、 硝酸、 磷酸、 硫酸和高氯酸等 ； 或有机酸， 例如乙酸、 草酸、 (D)- 或 (L)- 苹果酸、 马来 酸、 甲磺酸、 乙磺酸、 对甲苯磺酸、 水杨酸、 酒石酸、 柠檬酸、 琥珀酸或丙二酸等， 优选盐酸或 (L)- 苹果酸 ； 或 (2) 当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子 ( 例如碱金属离子、 碱土 离子或铝离子 ) 取代或者与有机碱 ( 例如乙醇胺、 二乙醇胺、 三乙醇胺、 氨丁三醇、 N- 甲基 葡糖胺等 ) 配位时形成的盐。
本发明化合物可以作为或设计成作为前药起作用。 “前药” 指的是在体内转化成母 体药物的试剂。前药常常是有用的， 因为在一些情形， 它们可能比母体药物更容易施用。例 如， 它们可能是通过口服可生物利用的， 而母体药物则否。 前药还可能比母体药物在药物组 合物中有更高的溶解度。前药的一个实例 ( 不是限制 ) 是以酯 (“前药” )、 磷酸盐、 酰胺、 氨基甲酸酯或脲形式服用的本发明化合物。
“治疗有效量” 指的是所施用的化合物的数量会在某种程度上缓解所治疗疾病的 一种或多种症状。就治疗癌症而言， 治疗有效量指的是具有以下效果的数量 ： (1) 减小肿瘤 的尺寸 ； (2) 抑制肿瘤转移 ； (3) 抑制肿瘤生长 ； 和 (4) 缓解与该癌症有关的一种或多种症 状。
术语 “蛋白激酶介导的病症” 或 “疾病” ， 在本文中使用时， 指的是已知蛋白激酶在 其中起某种作用的任何疾病或其它有害的状况。术语 “蛋白激酶介导的病症” 或 “疾病” 还 指通过用蛋白激酶抑制剂治疗得到减轻的疾病或症状。 这些病症包括， 但不限于， 癌症和其 它增殖过度性疾病。在某些实施方案中， 所述癌症是结肠、 乳腺、 胃、 前列腺、 胰腺或卵巢组 织的癌。
本文中使用的术语 “Axl 激酶介导的病症” 或 “疾病” ， 指的是其中 Axl 激酶被超量 表达、 活性过高和 / 或已知起某种作用的任何疾病或其它的有害状况。术语 “Axl 激酶介导 的病症” 还表示通过用 Axl 激酶抑制剂治疗得到缓解的疾病或症状。
在本文中使用时， “施用” 或 “给药” 指的是为了预防或治疗与蛋白激酶相关的疾病 而向生物体递送本发明化合物或其可药用盐或含有本发明化合物或其可药用盐的本发明 的药物组合物。
给药的合适途径可以包括 ( 但不限于 ) 口服、 直肠、 透粘膜或肠道给药， 或者肌内、 皮下、 髓内、 鞘内、 直接在心室内、 静脉内、 玻璃体内、 腹膜内、 鼻内或眼内注射。在某些实施 方案中， 优选的给药途径是口服和静脉内。 或者是， 可以以局部而非全身的方式施用本发明 化合物， 例如将化合物直接注射到实体肿瘤中， 经常是以贮库制剂或缓释制剂的形式。另 外， 可以用靶向释药系统施用药物， 例如， 以用肿瘤特异性抗体包覆的脂质体的形式。用这 种方式， 脂质体可以对准目标并被肿瘤选择性吸收。
本发明的药物组合物可以用本领域熟知的方法制备， 例如， 利用常规的混合、 溶解、 粒化、 成糖衣药丸、 粉碎混匀、 乳化、 胶囊化、 包埋或冷却干燥方法。
根据本发明使用的药物组合物可以按照任何常规的方式使用一种或多种生理上 可接受的载体配制， 所述载体中含有使活性化合物便于加工成能够药用的制剂的赋形剂和 辅剂。合适的制剂取决于所选择的给药途径。
为了注射， 本发明化合物可以配制成水溶液， 优选在生理上相容的缓冲液中， 例如 Hanks 溶液， Ringer 溶液或生理盐水缓冲液。对于透粘膜给药， 在制剂中使用适合要透过的 屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的。
对于口服给药， 化合物可以通过将活性化合物与本领域熟知的可药用载体组合来 配制。 这些载体使本发明化合物能被配制成片剂、 丸剂、 锭剂、 糖衣丸剂、 胶囊剂、 液体制剂、 凝胶剂、 糖浆剂、 浆剂、 混悬剂等， 用于患者口服摄入。 用于口服的药物制剂可以用固体赋形 剂制备， 需要时加入其它合适的辅剂， 然后任选地研磨形成的混合物， 并对该颗粒混合物进 行加工， 以得到片剂或糖衣药丸核心。适用的赋形剂特别是填料， 例如糖， 包括乳糖、 蔗糖、 甘露醇或山梨醇， 纤维素制品， 例如玉米淀粉、 小麦淀粉、 大米淀粉和土豆淀粉， 及其它材 料， 例如明胶、 黄蓍胶、 甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠及 / 或聚乙烯吡咯 烷酮 (PVP)。需要时可以加入崩解剂， 例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、 琼脂或藻酸。也可以使 用盐， 例如藻酸钠。
糖衣药丸核心要形成合适的包衣。 为此， 可以使用浓缩的糖溶液， 其中可以任选地 含有阿拉伯树胶、 滑石粉、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚羧乙烯凝胶、 聚乙二醇和 / 或二氧化钛、 漆料 溶液、 以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣丸剂包衣中加入染料或颜料 以便区别和表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推合式胶囊， 以及由明胶和增塑剂 ( 例如甘油或山梨醇 ) 制成的密封的软胶囊。推合式胶囊可装有活性成分和与其混合的填 料， 如乳糖， 粘合剂如淀粉， 以及 / 或润滑剂， 例如硬脂酸镁或滑石， 并任选地含有增塑剂。 在软胶囊中， 活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体中， 例如在脂肪油、 液体石蜡或液体 聚乙二醇中。增塑剂也可以加到这些制剂中。还可以使用的药物组合物包括硬明胶胶囊。 胶囊剂或丸剂可以包装在棕色玻璃瓶或塑料瓶中以保护活性化合物避光。 装有活性化合物 胶囊剂的容器优选在受控的室温 (18-30℃ ) 下储存。
对于吸入给药， 用于本发明的化合物可以使用压力容器或喷雾器及合适的推进 剂， 例如但不限于， 二氯二氟甲烷、 三氯一氟甲烷、 二氯四氟乙烷或二氧化碳， 以气溶胶喷雾 的形式方便地递送。在加压气溶胶的情形， 剂量单位可以通过提供阀门以释放计量数量来 控制。 例如， 可以配制用在吸入器或吹药器中的明胶胶囊和药筒， 其中含有化合物和合适的 粉末基料例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本发明化合物还可以配制成用于非肠道给药， 例如通过推注或连续输注给药。注 射用的制剂可以是单位剂型， 例如在安瓿瓶中或多剂量容器中， 并加入防腐剂。 组合物可采 取在油质或水基载液中的混悬剂、 溶液剂或乳剂的形式， 并可含有配制材料， 例如悬浮剂、 稳定剂和 / 或分散剂。
用于非肠道给药的药物组合物包括活性化合物的水溶形式， 例如 ( 但不限于 ) 盐， 的水溶液。另外， 活性化合物的悬浮液可以在亲脂性载液中制备。合适的亲脂性载液包括 脂肪油 ( 例如芝麻油 )、 合成的脂肪酸酯 ( 例如油酸乙酯和甘油三酯 ) 或例如脂质体等材料。 水基注射混悬剂可以含有增加混悬剂粘度的物质， 例如羧甲基纤维素钠、 山梨醇或葡聚 糖。任选地， 混悬剂中还可以含有合适的稳定剂和 / 或提高化合物溶解度的试剂， 以便能制 备高度浓缩的溶液。
或者是， 活性成分可以是粉末形式， 用于在使用前与合适的载液 ( 例如无菌的无 热源水 ) 组合。
化合物也可以使用例如常规的栓剂基料， 例如可可脂或其它甘油酯， 配制成直肠 用组合物， 例如栓剂或滞留型灌肠剂。
除了前述的制剂以外， 本发明化合物还可以被配制成贮库制剂。这类长效制剂可 以通过植入 ( 例如皮下或肌内植入 ) 或肌内注射施用。本发明化合物可以用合适的聚合或 疏水材料 ( 例如， 在含可药用油的乳状液的情形 )， 用离子交换树脂， 或以难溶衍生物 ( 例如 但不限于， 难溶的盐 ) 的形式， 配制成用于这种给药途径。
用于本发明疏水化合物的药物载体的一个非限制性实例是含有苯甲醇、 非极性表 面活性剂、 与水混溶的有机聚合物和水相的共溶剂体系， 例如 VPD 共溶剂体系。VPD 是由 3% w/v 苯甲醇、 8% w/v 非极性表面活性剂吐温 80 和 65% w/v 聚乙二醇 300、 其余的体积为无水 乙醇构成的溶液。VPD 共溶剂体系 (VPD:D5W) 由用 5% 的葡萄糖水溶液按 1:1 稀释的 VPD 构 成。此共溶剂体系对疏水化合物的溶解良好， 且其本身在全身给药时产生的毒性低。自然， 这样一种共溶剂体系的比例可以有相当大的变化而不会破坏其溶解度的毒性特点。另外， 共溶剂组分的本体可以改变 ： 例如， 可以用其它的低毒性非极性表面活性剂代替吐温 80， 聚乙二醇的级分大小可以变化， 可以用其它生物相容性聚合物代替聚乙二醇 ( 例如用聚乙 烯吡咯烷酮 )， 以及可以用其它的糖或多糖代替葡萄糖。
或者是， 可以采用用于疏水性药物组合物的其它递药系统。脂质体和乳状液是众 所周知的用于疏水性药物的递送载液或载体的实例。此外， 一些有机溶剂， 例如二甲基亚 砜， 也可以采用， 但常常毒性较大。
另外， 本发明化合物可以用缓释系统递送， 例如含有治疗药物的疏水性固体聚合 物的半透性基质。已经确立了各式各样的缓释材料， 这是本领域专业人员所熟知的。根据 其化学本性， 缓释胶囊可以释放化合物几周直至超过 100 天。根据治疗药物的化学本性和 生物稳定性， 可以采用使蛋白质稳定的其它方法。
本发明的药物组合物还可以含有合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。这些载体 或赋形剂的实例包括， 但不限于， 碳酸钙、 磷酸钙、 各种糖、 淀粉、 纤维素衍生物、 明胶和聚合 物， 例如聚乙二醇。
很多本发明的蛋白激酶调节化合物可以以可药用盐的形式提供， 其中所述化合物 可以形成带负电或带正电的物种。其中化合物形成带正电部分的盐的实例包括 ( 但不限 于 ) 季铵 ( 在文中另外定义 ) 盐， 例如盐酸盐、 硫酸盐、 碳酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 苹果酸 盐、 马来酸盐、 琥珀酸盐等， 其中季铵基团的氮原子是选定的与合适的酸发生反应的本发明 化合物的氮原子。本发明化合物在其中形成带负电物种的盐包括 ( 但不限于 ) 通过化合物 中的羧酸基团与合适的碱 ( 例如氢氧化钠 (NaOH)、 氢氧化钾 (KOH)、 氢氧化钙 (Ca(OH)2)， 等 ) 反应形成的钠、 钾、 钙和镁盐。
适合用于本发明的药物组合物包括其中活性成分的含量足以达到预定目的的组 合物， 例如， 调节蛋白激酶活性和 / 或治疗或预防与蛋白激酶相关的疾病。更具体地说， 治疗有效量指的是能够预防、 减轻或改善疾病的症状或者延长所治 疗的对象的存活期的化合物数量。
确定治疗有效量完全是在本领域专业人员的能力范围之内， 尤其是根据本文提供 的详细内容。
对于用在本发明方法中的任何化合物， 治疗有效量或剂量可以首先由细胞培养试 验估算。 然后， 可以配制用于动物模型的剂量， 以便使循环浓度范围包括在细胞培养中确定 的 IC50( 即， 实现对蛋白激酶活性半最大抑制时的试验化合物浓度 )。这些信息随后可用于 更准确地确定人类的适用剂量。
本文所述的化合物的毒性和疗效可以在细胞培养物中或实验动物中用标准的药 学步骤确定， 例如， 对试验化合物测定 IC50 和 LD50( 二者均在本文另处讨论 )。从这些细胞 培养和动物研究中得到的数据可用来配制用于人类的一个剂量范围。 剂量可以随所用的剂 型和采用的给药途径而变。准确的配方、 给药途径和剂量可以由各个医师根据患者的状况 选择 ( 例如参见， Goodman & Gilman’ s The Pharmacological Basis of Therapeutics， 第 3 章， 第 9 版， 编者 Hardman， J 和 Limbard， L.， MicGraw-Hill， New York City， 1996， p. 46.)。 用药量和间隔可以个别地调整， 以便使活性物种的血浆浓度足以保持调节激酶的 作用。这些血浆浓度指的是最小有效浓度 (MEC)。MEC 会随每种化合物而变， 但可从体外试 验数据估计， 例如， 利用本文描述的试验可以确定实现激酶的 50-90% 抑制所必需的浓度。 为实现 MEC 所需的剂量取决于个体特性和给药途径。可以使用 HPLC 分析或生物试验确定 血浆浓度。
用药间隔也可利用 MEC 值确定。化合物的施用方案应该使血浆浓度在 10-90% 的 时间， 优选 30-90% 的时间， 最优选 50-90% 的时间保持高于 MEC。
目前， 本发明化合物的治疗有效量可以是每天约 2.5 mg/m2 至 1500 mg/m2。其它 的示例性数量范围是 0.2-1000 mg/qid， 2-500 mg/qid， 和 20-250 mg/qid。
在局部施用或选择性摄入的情形， 药物的有效局部浓度可以与血浆浓度无关， 可 以采用本领域已知的其它步骤来确定正确的用药量和用药间隔。
施用的组合物的数量当然要视所治疗的对象、 病痛的严重程度、 给药方式、 开处方 医师的判断而定。
如果需要， 组合物可以是包装或者分配器的形式， 例如 FDA 批准的试剂盒， 其中可 包含一个或多个含活性成分的单位剂型。该包装可以例如包含金属或塑料箔， 例如泡罩包 装。包装或者分配器可以附有施用说明。包装或者分配器还可以附有一个附在容器上的符 合管理药物的制造、 使用或销售的政府机构规定的形式的通知， 该通知反映了政府机构对 组合物的形式以及人类或兽用给药的批准。例如， 此类通知可以是由美国食品和药物管理 局关于处方药物的审定标签或批准的产品内插页。 也可以制备含有配制在相容药物载体中 的本发明化合物的组合物， 放在合适的容器内， 用标签标明用于治疗所指出的病症。 示于标 签上的合适病症可以包括治疗肿瘤， 抑制血管发生， 治疗纤维化、 糖尿病等。
如上所述， 本发明的化合物和组合物在很多种被蛋白激酶介导的疾病和病症中会 有用途， 包括由 Axl 激酶介导的疾病和病症。作为实例， 这些疾病可以包括但不限于 ： 癌 症， 例如肺癌、 NSCLC( 非小细胞肺癌 )、 燕麦细胞癌、 骨癌、 胰腺癌、 皮肤癌、 隆凸性皮肤纤维
肉瘤、 头颈癌、 皮肤或眼内黑素瘤、 子宫癌、 卵巢癌、 结肠直肠癌、 肛区癌、 胃癌、 结肠癌、 乳腺 癌、 妇科肿瘤 ( 例如， 子宫肉瘤、 输卵管癌、 子宫内膜癌、 宫颈癌、 阴道癌或外阴癌 )、 霍奇金 病、 肝细胞癌、 食管癌、 小肠癌、 内分泌系统的癌症 ( 例如， 甲状腺癌、 胰腺癌、 甲状旁腺癌或 肾上腺癌 )、 软组织肉瘤、 尿道癌、 阴茎癌、 前列腺癌 ( 特别是激素难治型 )、 慢性和急性白 血病、 儿童的实体肿瘤、 嗜伊红细胞过多症、 淋巴细胞性淋巴瘤、 膀胱癌、 肾或输尿管癌 ( 例 如， 肾细胞癌、 肾盂癌 )、 儿科恶性肿瘤、 中枢神经系统肿瘤 ( 例如原发性 CNS 淋巴瘤、 脊椎 肿瘤、 成髓细胞瘤、 脑干胶质瘤或垂体腺瘤 )、 巴雷特综合症 ( 恶化前综合症 )、 肿瘤性皮肤 病、 银屑病、 蕈样肉芽肿病和良性前列腺肥大， 与糖尿病有关的疾病， 例如糖尿病视网膜病、 视网膜缺血和视网膜新血管生成， 肝硬化， 新血管生成， 心血管病如动脉粥样硬化， 免疫性 疾病， 例如自身免疫病， 以及肾病。
本发明化合物可以与一种或多种其它化疗药物联合使用。 本发明化合物的剂量可 依任何药物 - 药物反应而进行调节。在一项实施方案中， 化疗药物是选自有丝分裂抑制剂， 烷化剂， 抗代谢药， 细胞周期抑制剂， 酶， 拓扑异构酶抑制剂 ( 例如卡普特瑟 ( 伊立替康 ) 制 剂 )， 生物响应调节剂， 抗激素药， 抗血管形成剂 ( 例如 MMP-2、 MMP-9 和 COX-2 抑制剂 )， 抗 雄激素剂， 铂配位络合物 ( 顺铂等 )， 取代的脲例如羟基脲 ； 甲基肼衍生物， 例如丙卡巴肼 ； 肾上腺素皮质抑制剂， 例如， 米托坦、 氨鲁米特、 激素和激素拮抗剂， 例如肾上腺皮质类固醇 ( 例如泼尼松 )、 孕酮 ( 例如己酸羟孕酮 )， 雌激素 ( 例如己烯雌酚 )、 抗雌激素药例如他莫 昔芬， 雄激素例如丙酸睾酮， 和芳香酶抑制剂例如阿那曲唑， 以及阿诺新 ( 伊西美坦 )。
可以与以上方法联合施用的烷化剂的实例包括， 但不限于， 单独的或与亚叶酸联 合的 5- 氟尿嘧啶 (5-FU) ； 其它的嘧啶类似物， 例如 UFT、 卡培他滨、 吉西他滨和阿糖胞苷 ； 烷基碘酸盐， 例如白消安 ( 用于治疗慢性粒细胞白血病 )、 英丙舒凡和哌泊舒凡 ； 吖丙啶类， 例如苯佐替派、 卡波醌、 美妥替派和乌瑞替哌 ； 亚乙基亚胺和甲基密胺， 例如， 六甲蜜胺、 三 亚乙基蜜胺、 三亚乙基磷酰胺、 三亚乙基硫代磷酰胺、 和三羟甲蜜胺 ； 氮芥类， 例如苯丁酸氮 芥 ( 用于治疗慢性淋巴细胞性白血病、 原发性巨球蛋白血症和非霍奇金淋巴瘤 )、 环磷酰胺 ( 用于治疗霍奇金病、 多发性骨髓瘤、 成神经细胞瘤、 乳腺癌、 卵巢癌、 肺癌、 维尔姆斯瘤和横 纹肌肉瘤 )、 雌莫司汀、 异环磷酰胺、 新氮芥、 泼尼莫司汀和嘧啶氮芥 ( 用于治疗原发性血栓 碎裂、 非霍奇金淋巴瘤、 霍奇金病和卵巢癌 ) ； 以及三嗪类， 例如达卡巴嗪 ( 用于治疗软组织 肉瘤 )。
可以与以上方法联合施用的抗代谢药化疗剂的实例包括， 但不限于， 叶酸类似物， 例如甲氨蝶呤 ( 用于治疗急性淋巴细胞性白血病、 绒膜癌、 蕈样肉芽肿病、 乳腺癌、 头颈癌 和骨源性肉瘤 ) 和蝶罗呤 ； 以及嘌呤类似物， 例如巯嘌呤和硫鸟嘌呤， 它们可用于治疗急性 粒细胞白血病、 急性淋巴细胞白血病和慢性粒细胞白血病。
可以与以上方法联合施用的基于天然产物的化疗药物的实例包括， 但不限于， 长 春花生物碱， 例如， 长春碱 ( 用于治疗乳腺癌和睾丸癌 )、 长春新碱和长春地辛 ； 表鬼臼毒 素， 例如依托泊苷和替尼泊苷， 二者均可用于治疗睾丸癌和卡波西肉瘤 ； 抗生素类化疗药 物， 例如柔红霉素、 多柔比星、 表柔比星、 丝裂霉素 ( 用于治疗胃、 宫颈、 结肠、 乳腺、 膀胱和 胰腺癌 )、 放线菌素 D、 替莫唑胺、 普卡霉素、 博来霉素 ( 用于治疗皮肤、 食管和生殖泌尿道 癌)； 以及酶促化疗药物， 例如 L- 天冬酰胺酶。
可用的 COX-II 抑制剂的实例包括万络 (VIOXX)、 西乐葆 ( 塞来考昔 )、 伐地考昔、帕瑞考昔 (paracoxib)、 罗非考昔和 Cox 189。
在以下专利文献中描述了可用的间质金属蛋白酶抑制剂的实例 ： WO 96/33172， WO 96/27583， 欧洲专利申请 No. 97304971.1， 欧洲专利申请 No. 99308617.2， WO 98/07697， WO 98/03516， WO 98/34918， WO 98/34915， WO 98/33768， WO 98/30566， 欧洲专利出版 物 606,046， 欧 洲 专 利 出 版 物 931,788， WO 90/05719， WO 99/52910， WO 99/52889， WO 99/29667， PCT 国际专利申请 No. PCT/IB 98/01113， 欧洲专利申请 No. 99302232.1， 英国 专利申请 No. 9912961.1， 美国专利 No. 5,863,949， 美国专利 No. 5,861,510 和欧洲专利 出版物 780,386， 它们均以参考引用的方式全文并入本文。 优选的 MMP-2 和 MMP-9 抑制剂对 MMP-1 的抑制活性很小或没有。 更优选的是相对于其它间质金属蛋白酶 ( 即， MMP-1， MMP-3， MMP-4， MMP-5， MMP-6， MMP-7， MMP-8， MMP-10， MMP-11， MMP-12 和 MMP-13) 选择性抑制 MMP-2 和 / 或 MMP-9 的那些抑制剂。
可 用 于 本 发 明 的 MMP 抑 制 剂 的 一 些 具 体 实 例 是 AG-3340， RO 32-3555， RS 13-0830， 和选自以下的化合物 ： 3-[[4-(4- 氟苯氧基 ) 苯磺酰基 ]-(1- 羟基氨甲酰环戊基 ) 氨基 ] 丙酸 ； 3- 外 -3-[4-(4- 氟苯氧基 ) 苯磺酰氨基 ]-8- 氧杂双环 [3.2.1] 辛烷 -3- 羧 酸羟酰胺 ； (2R,3R)1-[4-(2- 氯 -4- 氟苄氧基 ) 苯磺酰基 ]-3- 羟基 -3- 甲基哌啶 -2- 羧 酸羟酰胺 ； 4-[4-(4- 氟苯氧基 ) 苯磺酰氨基 ] 四氢吡喃 -4- 羧酸羟酰胺 ； 3-[[4-(4- 氟苯 氧基 ) 苯磺酰基 ]-(1- 羟基氨甲酰环丁基 ) 氨基 ] 丙酸 ； 4-[4-(4- 氯苯氧基 ) 苯磺酰氨 基 ] 四氢吡喃 -4- 羧酸羟酰胺 ； (R)3-[4-(4- 氯苯氧基 ) 苯磺酰氨基 ] 四氢吡喃 -3- 羧酸 羟酰胺 ； (2R,3R)1-[4-(4- 氟 -2- 甲基苄氧基 ) 苯磺酰基 ]-3- 羟基 -3- 甲基哌啶 -2- 羧 酸羟酰胺 ； 3-[[(4-(4- 氟苯氧基 ) 苯磺酰氨基 )-(1- 羟基氨甲酰 -1- 甲基乙基 ) 氨基 ] 丙酸 ； 3-[[4-(4- 氟苯氧基 ) 苯磺酰基 ]-(4- 羟基氨甲酰四氢吡喃 -4- 基 ) 氨基 ] 丙酸 ； 3- 外 -3-[4-(4- 氯苯氧基 ) 苯磺酰氨基 ]-8- 氧杂双环 [3.2.1] 辛烷 -3- 羧酸羟酰胺 ； 3- 内 -3-[4-(4- 氟苯氧基 ) 苯磺酰氨基 ]-8- 氧杂双环 [3.2.1] 辛烷 -3- 羧酸羟酰胺 ； 和 (R)3-[4-(4- 氟苯氧基 ) 苯磺酰氨基 ] 四氢呋喃 -3- 羧酸羟酰胺 ； 及这些化合物的可药用 的盐和溶剂化物。
其它的抗血管生成剂、 其它的 COX-II 抑制剂和其它的 MMP 抑制剂， 也可以用于本 发明。
本发明化合物也可以与其它的信号转导抑制剂一起使用， 例如能抑制 EGFR( 表皮 生长因子受体 ) 响应的试剂， 如 EGFR 抗体、 EGF 抗体和作为 EGFR 抑制剂的分子 ； VFGF( 血管 内皮生长因子 ) 抑制剂 ； 和 erbB2 受体抑制剂， 例如与 erbB2 受体结合的有机分子或抗体， 比如赫赛汀 (Genentech, Inc., South San Francisco, CA)。EGFR 抑制剂描述于例如 WO 95/19970、 WO 98/14451、 WO 98/02434 和美国专利 No. 5,747,498 中， 这些物质能如本文所 述地用于本发明。
EGFR 抑 制 剂 包 括， 但 不 限 于， 单 克 隆 抗 体 C225 和 抗 EGFR 22Mab(ImClone Systems, Inc., New York, NY)，化 合 物 厄 洛 替 尼 (OSI Pharmaceuticals, Inc., Melville, NY) ，ZD-1839(AstraZeneca) ，BIBX-1382(Boehringer Ingelheim) ， MDX-447(Medarex Inc., Annandale, NJ)， 和 OLX-103(Merck & Co., Whitehouse Station, NJ)， 以及 EGF 融合毒素 (Seragen Inc., Hopkinton, MA)。
这 些 及 其 它 的 EGFR 抑 制 剂 可 用 于 本 发 明。VEGF 抑 制 剂， 例 如 SU-5416 和SU-6668(Sugen Inc., South San Francisco, CA) 也可以与本发明化合物联合使用。 VEGF 抑制剂描述于例如下列专利文献中 ： WO 01/60814 A3， WO 99/24440， PCT 国际申请 PCT/IB 99/00797， WO 95/21613， WO 99/61422， 美国专利 No. 5,834,504， WO 01/60814， WO 98/50356， 美国专利 No. 5,883,113， 美国专利 No. 5,886,020， 美国专利 No. 5,792,783， WO 99/10349， WO 97/32856， WO 97/22596， WO 98/54093， WO 98/02438， WO 99/16755 和 WO 98/02437， 这些文献都以参考引用的形式全文并入本文中。可用于本发明的一些具体 的 VEGF 抑制剂的其它实例是 IM 862(Cytran Inc., Kirkland, WA) ； 抗 VEGF 单克隆抗体 (Greentech, Inc.) ； 和 angiozyme， Ribozyme(Boulder, CO) 和 Chiron(Emeryville, CA) 生产的一种合成的核酶。这些及其它的 VEGF 抑制剂可以如本文所述地用于本发明。另外， pErbB2 受体抑制剂， 例如 GW-282974(Glaxo Wellcome plc)， 及单克隆抗体 AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc., The Woodlands, TX) 和 2B-1(Chiron)， 可以进一步与本发明化合 物联合， 例如在 WO 98/02434、 WO 99/35146、 WO 99/35132、 WO 98/02437、 WO 97/13760、 WO 95/19970、 美国专利 No. 5,587,458 和美国专利 No. 5,877,305 中指出的那些， 上述文献均 以参考引用的形式全文并入本文。在美国专利 No. 6,284,764 中也描述了可用于本发明的 ErbB2 受体抑制剂， 该专利以引用的方式全文并入本文中。在上述的 PCT 申请、 美国专利和 美国专利临时申请中描述的 erbB2 受体抑制剂化合物和物质， 以及抑制 erbB2 受体的其它 化合物和物质， 能够按照本发明与本发明化合物一起使用。
本发明化合物还可与用于治疗癌症的其它试剂一起使用， 这些试剂包括但不限 于， 能增强抗肿瘤免疫响应的试剂， 例如 CTLA4( 细胞毒性淋巴细胞抗原 4) 抗体及能够封阻 CTLA4 的其它试剂 ； 以及抗增殖剂， 例如其它的法呢基蛋白转移酶抑制剂， 比如在美国专利 No. 6,258,824 B1 的 “背景” 部分中引用的参考文献里描述的法呢基蛋白转移酶抑制剂。
以上方法也可以与放射疗法联合进行， 其中与放疗联合的本发明化合物的数量对 治疗以上疾病有效。施用放疗的技术是本领域已知的， 这些技术可用于本文所述的联合疗 法。在这一联合疗法中本发明化合物的施用能够如本文所述地确定。
如上所述， 本发明的化合物和组合物对于由 Axl 激酶介导的很多种疾病和病症有 用。作为非限制性实例， 这些疾病可以包括卡斯尔曼病、 动脉粥样硬化、 冠状动脉病、 外周 水肿、 外周血管病、 青光眼、 湿性或干性与年龄相关的黄斑变性 (AMD)、 哮喘、 慢性支气管炎、 慢性阻塞性肺病、 成年呼吸窘迫综合症、 婴儿呼吸窘迫综合症、 咳嗽、 动物中的慢性阻塞性 肺病、 溃疡性结肠炎、 克罗恩病、 胃酸分泌过多、 细菌、 真菌或病毒诱发的脓毒症或脓毒性休 克、 内毒素性休克、 马的蹄叶炎或绞痛、 脊髓创伤、 头损伤、 神经源性炎症、 疼痛、 脑的再灌注 损伤、 银屑病关节炎、 类风湿性关节炎、 强直性脊柱炎、 骨关节炎、 炎症或细胞因子介导的慢 性组织变性。
可以用细胞因子或趋化因子受体功能的抑制剂治疗的人类或其它物种的疾病 或病症包括， 但不限于 ： 炎性或变应性疾病或病症， 包括呼吸变应性疾病， 例如哮喘 ( 特 别是大支气管哮喘 )、 变应性鼻炎、 过敏性肺病、 过敏性肺炎、 嗜伊红细胞性肺炎 ( 例如， Loeffler 综合症、 慢性嗜伊红性肺炎 )、 迟发型超敏反应、 间质性肺病 (ILD)( 例如特发性 肺纤维化， 或与类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 强直性脊柱炎、 系统性硬化、 舍格仑综合 症、 多肌炎或皮肌炎相关的 ILD) ； 全身性过敏反应或超敏反应， 药物变态反应 ( 例如对青霉 素、 头孢菌素 )、 昆虫叮咬变态反应 ； 自身免疫病， 例如类风湿性关节炎、 银屑病、 多发性硬化、 系统性红斑狼疮、 重症肌无力、 幼年型糖尿病 ； 肾小球肾炎， 自身免疫性甲状腺炎， 贝赫 切特综合症 ； 移植物排斥 ( 例如在移植手术中 )， 包括异体移植物排斥或移植物抗宿主病 ； 炎性肠病， 例如克罗恩病和溃疡性结肠炎 ； 脊柱关节病 ； 硬皮病 ； 银屑病 ( 包括 T 细胞介导 的银屑病 ) 和炎性皮肤病， 例如皮炎、 痤疮、 特应性皮炎、 变应性接触性皮炎、 荨麻疹 ； 血管 炎 ( 例如， 坏死性、 皮肤和过敏性血管炎 ) ； 嗜伊红细胞性肌炎， 嗜伊红细胞性筋膜炎 ； 伴随 皮肤或器官白细胞浸润的癌症。其它要抑制其中不良的炎性反应的疾病和病症也可被治 疗， 包括但不限于， 再灌注损伤、 动脉粥样硬化、 某些血癌、 细胞因子引发的毒性 ( 例如脓毒 性休克、 内毒素性休克 )， 多肌炎， 皮肌炎。
可以用趋化因子受体功能调节剂治疗的人类或其它物种的疾病或病症包括， 但 不限于 ： 免疫抑制， 例如在患有免疫缺陷综合症 ( 例如艾滋病 ) 或其它病毒感染的个体中 的免疫抑制， 进行放疗、 化疗、 自身免疫病治疗或引起免疫抑制的药物治疗 ( 例如皮质类 固醇 ) 的个体中的免疫抑制 ； 由于受体功能的先天缺陷或其它原因造成的免疫抑制 ； 以及 传染病， 例如寄生虫病， 包括但不限于， 蠕虫感染， 例如线虫 (round warms)( 鞭虫病、 蛲虫 病、 蛔虫病、 钩虫病、 类圆线虫病、 旋毛虫病、 丝虫病 )， 吸虫 (flukes)( 血吸虫病、 支睾吸虫 病 )， 绦虫 (tape warms)( 棘球蚴病， 牛肉绦虫病， 猪囊尾蚴病 )， 内脏蠕虫， 内脏幼虫移行 症 (visceral larva migraines)( 例如弓蛔虫 )， 嗜伊红细胞性胃肠炎 ( 例如异尖绒虫 属， 福卡利马线虫属 ) 和皮肤幼虫移行症 (cutaneous larva migraines)( 巴西钩口线虫 (Ancylostona braziliense)， 犬钩口线虫 )。 此外， 如果考虑递送足量的化合物以便通过诱 发趋化因子受体内在化造成受体在细胞上的表达损失， 或者以造成细胞迁移错向的方式递 送化合物， 则上述炎症、 变应性和自身免疫性疾病的治疗也可以考虑趋化因子受体功能的 促进剂。
本发明方法因此可用于许多种炎性和免疫调节障碍和疾病、 变应性病症、 特应性 病症以及自身免疫病理特性的预防和治疗。在一项具体的实施方案中， 本发明涉及使用所 研究的化合物预防或治疗自身免疫性疾病， 例如类风湿性关节炎或银屑病关节炎。
本发明方法治疗的对象是需要调节其细胞受体活性的哺乳动物， 优选男性或女性 人类。本文中使用的 “调节” 一词意指包括拮抗、 激动、 部分拮抗、 逆激动和 / 或部分激动。 在本发明的一个优选的方面， 调节指的是对细胞因子受体活性的拮抗作用。 术语 “治疗有效 量” 指的是会引起组织、 系统、 动物或人发生研究人员、 兽医、 医生或其它临床医师寻求的生 物或医学响应的受试化合物数量。
本发明化合物可以与一种或多种其它化疗药物联合使用。 本发明化合物的剂量可 随任何的药物 - 药物相互作用而调节。联合疗法调节趋化因子受体活性并从而预防和治疗 炎性和免疫调节障碍和疾病， 包括哮喘和变应性疾病， 以及自身免疫性病理特性， 例如类风 湿性关节炎和动脉粥样硬化， 及以上指出的病理特征， 该疗法通过本发明化合物与已知用 于此种用途的其它化合物的联合来示例说明。
例如， 在炎症的治疗或预防中， 本发明化合物可以与以下药物结合使用 ： 抗炎或 镇痛药 ( 例如阿片类激动剂 )， 脂氧合酶抑制剂 ( 例如 5- 脂氧合酶的抑制剂 )， 环氧合酶 抑制剂 ( 例如环氧合酶 -2 抑制剂 )， 白介素抑制剂 ( 例如白介素 -1 抑制剂 )， NMDA 拮抗 剂， 一氧化氮抑制剂或一氧化氮合成的抑制剂， 非甾类抗炎药或抑制细胞因子的抗炎药， 例 如与诸如对乙酰氨基酚、 阿斯匹林、 可待因、 依那西普、 芬太尼、 布洛芬、 吲哚美辛、 酮咯酸、吗啡、 萘普生、 非那西丁、 吡罗昔康、 甾类镇痛药、 舒芬太尼、 舒林酸、 替尼达普等化合物联 合。类似地， 本发明化合物可以与止痛药、 强化剂 ( 如咖啡因 )、 H2- 拮抗剂、 西甲硅油、 氢氧 化铝或氢氧化镁 ； 减充血药， 例如去氧肾上腺素、 苯丙醇胺、 伪麻黄碱、 羟甲唑啉、 肾上腺素 (ephinephrine)、 萘甲唑啉、 赛洛唑啉、 丙己君或左旋去氧麻黄碱 ； 止咳药， 例如可待因、 氢 可酮、 卡拉美芬、 喷托维林或右美沙芬 (dextramethorphan) ； 利尿剂 ； 以及镇静性或非镇静 性抗组胺药一起服用。
同样， 本发明化合物可以与用来治疗 / 预防 / 抑制或改善本发明化合物适用的疾 病和病症的其它药物联合使用。这些其它药物可以以其通常使用的途径和数量， 与本发明 化合物同时或顺序地施用。当本发明化合物与一种或多种其它药物同时使用时， 优选除本 发明化合物外还含有这类其它药物的药物组合物。因此， 本发明的药物组合物包括除本发 明化合物外还含有一种或多种其它活性成分的那些组合物。
可以与本发明化合物分别地或在同一药物组合物中联合给药的其它活性成分的 实例包括， 但不限于 ： (a)VLA-4 拮抗剂， 例如在美国专利 No. 5,510,332、 WO 95/15973、 WO 96/01644、 WO 96/06108、 WO 96/20216、 WO 96/22966、 WO 96/31206、 WO 96/40781、 WO 97/03094、 WO 97/02289、 WO 98/42656、 WO 98/53814、 WO 98/53817、 WO 98/53818、 WO 98/54207 和 WO 98/58902 中描述的那些， (b) 甾族化合物， 例如丙酸贝氯米松、 甲泼尼龙、 倍他米松、 泼尼松、 地塞米松和氢化可的松 ； (c) 免疫抑制剂， 例如环胞素、 他克莫司、 雷帕 霉素和其它 FK-506 型免疫抑制剂 ； (d) 抗组胺药 (H1- 组胺拮抗剂 )， 例如溴苯那敏、 氯苯 那敏、 右氯苯那敏、 曲普利啶、 氯马斯汀、 苯海拉明、 二苯拉林、 曲吡那敏、 羟嗪、 甲地嗪、 异丙 嗪、 阿利马嗪、 阿扎他定、 赛庚啶、 安他唑啉、 非尼拉敏、 美吡拉敏、 阿司米唑、 特非那定、 氯雷 他定、 地洛他定、 西替利嗪、 非索非那定、 去乙氧羰基氯雷他定等 ； (e) 非甾类抗哮喘药， 例 如 β2 拮抗剂 ( 特布他林， 奥西那林， 非诺特罗， 异他林， 沙丁胺醇， 比托特罗和吡布特罗 )， 茶碱、 色甘酸二钠、 阿托品、 异丙托溴铵、 白三烯拮抗剂 ( 扎鲁司特， 孟鲁司特， 普仑司特， 伊 拉司特， 泊比司特， SKB-106,203)， 白三烯生物合成抑制剂 ( 齐留通， BAY-1005) ； (f) 非甾炎 抗炎药 (NSAIDs)， 例如丙酸衍生物 ( 阿明洛芬、 苯 洛芬、 舒洛芬、 噻洛芬酸和硫 洛芬、 布氯酸、 卡洛芬、 芬布芬、 非诺洛 芬、 氟洛芬、 氟比洛芬、 布洛芬、 吲哚洛芬、 酮洛芬、 咪咯芬、 萘普生、 奥沙普秦、 吡洛芬、 普拉 洛芬 )， 乙酸衍生物 ( 吲哚美辛、 阿西美辛、 阿氯芬酸、 环氯茚 酸、 双氯芬酸、 芬氯酸、 芬替酸、 呋罗芬酸、 异丁芬酸、 伊索克酸、 oxpinac、 舒林酸、 硫平酸、 托 美丁、 齐多美辛和佐美酸 )， 芬那酸衍生物 ( 氟芬那酸、 甲氧芬那酸、 甲芬那酸、 尼氟酸和托 芬那酸 )， 联苯羧酸衍生物 ( 二氟尼柳和氟苯柳 )、 昔康类药物 ( 伊索昔康、 吡罗昔康、 舒多 昔康和替诺昔康 )， 水杨酸盐 ( 乙酰基水杨酸， 柳氮磺吡啶 ) 和吡唑啉酮 ( 阿扎丙宗， 苄哌 立隆 (bezpiperylon)、 非普拉宗、 莫非布宗、 羟布宗、 保泰松 ) ； (g) 环加氧酶 -2(COX-2) 抑 制剂 ； (h)IV 型磷酸二酯酶 (PDE-IV) 的抑制剂 ； (i) 趋化因子受体 ( 特别是 CCR-1、 CCR-2、 CCR-3、 CXCR-3 和 CCR-5) 的拮抗剂 ； (j) 胆固醇降低剂， 例如 HMG-CoA 还原酶抑制剂 ( 洛伐 他汀， 辛伐他汀和普伐他汀， 氟伐他汀、 阿托伐他汀及其它他汀类药物 )， 螯合剂 ( 消胆胺和 胆固醇吸收抑制剂 ( 依泽麦布 )， 烟酸， 非诺贝酸衍生物 ( 吉非贝齐、 氯贝特、 考来替泊 )， 非诺贝特和苯扎贝特 )， 和普罗布考 ； (k) 抗糖尿病药， 例如胰岛素、 磺酰脲、 双胍 ( 二甲双 胍 )， α- 葡糖苷酶抑制剂 ( 阿卡波糖 ) 和格列酮 ( 曲格列酮和吡格列酮 ) ； (l) 干扰素 β 制剂 ( 干扰素 β-1α， 干扰素 β-1β) ； (m) 其它化合物， 例如 5- 氨基水扬酸及其前药， 抗代谢药例如硫唑嘌呤和 6- 巯基嘌呤， 以及细胞毒性癌化疗药物。
可用的 COX-II 抑制剂的实例包括万络 (vioxx)、 西乐葆 ( 塞来考昔 )、 伐地考昔、 帕瑞考昔、 罗非考昔和 COX 189。
本发明化合物与第二活性成分的重量比可以变化， 这将取决于每种成分的有效剂 量。一般来说， 将使用各成分的有效剂量。例如， 当本发明化合物与 NSAID 联合时， 本发明 化合物与 NSAID 之重量比一般为约 1000:1 至约 1:1000， 优选为约 200:1 至约 1:200。本发 明化合物与其它活性成分的联合一般也在上述范围内， 但在每种情形均应使用各活性成分 的有效剂量。
在这种合剂中， 本发明化合物和其它活性剂可以分别或者同时给药。 此外， 一种药 物的施用可以是在其它药物的施用之前、 同时或之后。
通过考虑以下的非限制实施例会进一步理解本发明。 实施例 关于 Axl 激酶的方案和数据 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)LANTHASCREENTM 激酶试验 时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 的根据是来自附着在 PY-20 抗体上作为供体分 子起作用的镧系螯合物分子 ( 例如铽 ) 的能量交换。当抗体结合到荧光素 poly-GT 底物上 的磷酸化的酪氨酸残基上时， 随两个分子密切接近， 与底物共价结合的受体分子接受来自 供体的能量转移， 而供体分子则受到来自闪光灯的激发。能量转移作为受体分子发射的增 加和供体分子发射减少来测量。用这种方式能够推断药物对抗 Axl 激酶活性的效力。
TR-FRET 利用铽分子的长激发态以使能量转移的测量延缓到长得足以使背景散射 光和 / 或荧光消散， 同时避免来自闪光灯源的直接激发。因此， TR-FRET 能克服标准的 FRET 分析的一些限制。
ATP(Cat# PV 3227 Invitrogen Corporation, Carlsbad ； CA) 的 Km 值测定的优 化是在 1 mM ATP 用一系列 Axl 激酶系列稀释液使用 Vatsala 方法进行。EC80 被确定为试 验的最佳 ATP 浓度。该 EC80 值为 20 μM。
Axl 激酶 (Cat# PV 3971 Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) 浓度的优化 用一系列酶在 20 μM ATP 下的系列稀释液完成以确定 EC80。这是用 Vatsala 方法完成的， EC80 被确定为 103 ng/mL 的酶。
抑制剂 IC50 测定步骤 ： 1) 制备一个主系列的系列稀释液， 其浓度为试验中抑制剂预期的最终工作浓度的 100 倍， 对于 Axl， 这是从 10 mM 开始， 按 1:2 稀释， 直至 610 nM， 为最终浓度的 100 倍。在所有 试验中抑制剂的最终工作浓度为 100 μM 至 6.1 nM。这是在 PCR 排连管中于 25 μl 100% DMSO 内完成的。
2) 从步骤 1 中的主稀释液出发， 在 96 孔板中于含水的 1X 激酶缓冲液 (Cat# PV 3189 5X Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) 内配制中间的稀释液。其作法是向 96 孔板的每只孔内加入 96 μl 激酶缓冲液 (KB)， 并涡流摇动， 与 4 μl 抑制剂混合。
3) 从步骤 2) 的中间稀释液出发， 从各孔中取出 2.5 μl 抑制剂， 加到 384 孔板的 三个重复试验孔中。
4) 从 330 μg/mL 的酶储备液配制 4 μg/mL 的 Axl 激酶在 KB 中的稀释液。
5) 从步骤 4 中的稀释液出发， 配制 412 ng/mL(4 倍于 103 ng/mL 的最佳酶浓度 ) 的酶在 KB 中的稀释液， 向 384 孔板含抑制剂的各孔内加 2.5 μl 此稀释液。
6) 配制适当体积的在 KB 中的溶液， 其中含有来自 10 mM 储备液的 20 μM ATP 和 来 自 30 μM 储 备 液 的 0.4 μM 荧 光 素 -Poly GT 底 物 (Cat# PV 3610 Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) 将 5 μl 此混合物加到 384 孔板的各孔中开始反应。 在涡动 板摇荡器上于 80 rpm 下混合 30 秒。密封并在室温下温育 1 小时。
7) 配 制 适 当 体 积 的 在 TR-FRET 稀 释 缓 冲 液 (Cat# PV 3574 Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)， 其中含有来自 500 mM 储备液的 20 mM EDTA 激酶猝灭缓冲 液 (Cat# P2832 Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) 和来自 6700 nM 储备液的 4 nM LanthaScreenTM Tb-PY20 抗体 (Cat# PV 3553 Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)。 在含步骤 6 反应物的 384 孔板的每个孔中加 10 μL。密封并在室温下温育 30 分。
8) 在 Wallac EnvisionTM PerkinElmer 2103 Multilable Reader (PerkinElmer Waltham, MA) 上读数， 使用 340 nm 激发光滤片， 495 nm 发射光滤片用于铽供体信号， 520 nm 发射光滤片用于荧光受体信号检测。
9) 对每份重复试样计算平均发射和标准偏差， 在 Excel(Microsoft Corporation Redmond, WA) 电子表格上进行数据分析。 从试验的每个平均发射值减去只含 ATP 的对照样 的平均发射值， 计算发射的减少。 这些数值被用来计算活性百分数， 其作法是将每个发射减 少值除以没有抑制剂对照样的发射减少值。 形成一条含拟合线的散布图以显示药物浓度和 Axl 激酶活性百分数的关系。每个点均用标准误差棒拟合并计算 IC50。IC50 的计算方法是， 直接画出在 50% 值之上和之下的药物浓度点和活性百分数点。线的方程被用来求解方程中 的 “X” ， 它代表各药物的 IC50 值。数据还用 CrapPad Prism 5 软件 (GraphPad Software La Jolla, CA) 作了计算。
本发明的实施例表明， 在以上的 TR-FRET 试验中 IC50 结果为约 4.08 μM 至约 0.014 μM。有利的是 IC50 结果小于 3.0 μM。更有利的是 IC50 值小于 1.0 μM。还要更有 利的是 IC50 小于 0.1 μM。
CellTiter-GLO 试验 (Promega Corporatino, Madison, WI) 基于细胞培养的试验可以用来评价本发明化合物抑制一种或多种细胞活性， 例如癌细 胞生长和 / 或存活的能力。各种癌细胞系可以从美国典型培养物保藏所 (ATCC) 和其它来 源得到。简言之， 将细胞在 100 μL 的合适生长培养基 ( 由 ATCC 确定 ) 中， 按每孔 1000 个 细胞接种在组织培养处理的 96 孔不透明白板中 (Thermo Electron, Vantaa, Finland)。 然后使细胞与合适浓度的药物接触， 在其存在下生长 96 小时。 接着， 向各孔中加入 100 μL 的 Cell-Titer-Glo 试剂 (Promega, Inc., Madison, WI)。将板在室温下摇 2 小时使细胞 裂解， 并在室温下温肓 10 分钟以稳定荧光信号。与 Promega 公司的激酶 -Glo 试验试剂相 似， 此试剂含有荧光素酶及其底物荧光素。荧光素酶被细胞裂解物中的 ATP 活化， 催化荧光 素向氧化荧光素转化， 此反应产生光。产生的光的数量与细胞裂解物中的 ATP 之量成比例， 后者本身又与细胞数成比例并给出细胞增殖的指标。
两种实施例化合物在以上试验中显示出 IC50 值为约 0.448 μM 和约 0.266 μM。 有利的是 IC50 小于 5.0 μM。更有利的是 IC50 小于 1.0 μM。人 phospho-Axl ELISA 试验 (R & D Systems Minneapolis, MN) 此试验利用对于结合在 96 孔板上的人 Axl 激酶特异性的捕捉抗体。该抗体会识别 磷酸化和未磷酸化的 Axl。将细胞裂解物与该捕捉抗体一起温育， 然后洗去未结合的蛋 白质。将对磷酸化的酪氨酸残基特异性的 HRP- 缀合的检测抗体在试验孔中温育以检测 Phospho-Axl 激酶。 依次加入底物溶液和酸性终止液， 产生与结合的 HRP 检测抗体的量相应 的颜色变化。用酶标仪测定色度变化的光密度， 在 450 nm 和 540 nm 下读数。从 450 nm 的 读数减去 540 nm 的读数以校正该板的光学不完美性。
以 4 x 105 细胞 /mL 将细胞植入 6 孔板中并温育过夜， 将其用 Axl 抑制剂处理， 温育 4 小时后用 500 ng/mL GAS6( 生长停顿特异基因 6) 刺激 5 分钟。将细胞刮取在裂解缓冲液 中进行裂解， 该裂解缓冲液由 1X R&D Systems IC 稀释液 #12(Cat# DYC002， R & D Systems Minneapolis, MN) 加 1X 蛋白酶抑制剂混合物 III(Cat# 80053-852 VWR International San Diego, CA) 构成。 用 BCA 试验 (Thermo Scientific Rockford, IL) 定量测定蛋白质。 向 96 孔 ELISA 超高结合板的每个孔中以在 PBS 中 8 μg/mL 的浓度加入捕捉抗体并在室温 下温育过夜。 次日用由 0.05% Tween 20®/PBS 组成的洗涤缓冲液洗板 5 次， 然后将板的孔封 闭在 300 μL 含 1% BSA 和 0.05% 叠氮化钠的 PBS 中于室温下 2 小时。封闭后将孔洗 5 次， 向各孔中加入在 100 μL 体积的 1X IC 稀释液 #12 中的 125 μg 蛋白质。该蛋白裂解物与 含结合的捕促抗体的孔在室温下温育 2 小时。将孔用洗涤缓冲液洗 5 次， 然后与 100 μL 的检测抗体在 IC 稀释液 #14 中的 1/1300 倍稀释液一起温育， 所述的 IC 稀释液 #14 由 20 mM Tris, 137 mM NaCl、 0.05% Tween 20、 0.1% BSA 在水中构成。 此温育在室温下进行 2 小 时， 然后用洗涤缓冲液洗 5 次。按照 1:1 比例将试剂 A 和试剂 B 混合形成底物溶液 (Cat# DY999 R & D Systems Minneapolis, MN)， 然后每孔加 100 μL， 室温下温育 20 分钟。温 育后将 50 μl 终止液 (Cat# DY994 R & D Systems Minneapolis, MN) 直接加到底部溶液 中， 轻敲混合， 立即测定光密度。
在从 450 nm 的读数中人工减去 540 nm 的读数后， 用 Excel 电子表格进行数据分 析。 将未处理样品的光密度平均后， 用未处理样的平均光密度读数除以各样品光密度读数， 得到相对的磷酸化 -Axl(phospho-Axl) 值， 计算 phospho-Axl 表达的平均相对倍数变化。 将 三份重复样的相对 phospho-Axl 值平均以计算各样品的平均相对 phospho-Axl 值及各样品 的标准误差。得到相对于 GAS6 处理的样品的条形图， 并计算活性百分数或 50% 有效的浓度 (EC50)。
在此试验的一个实施例中， 使用 Axl 表达高的 MDA-MB 231 细胞。将平均相对倍数 变化对本发明实施例的浓度作图。 GAS6 处理的细胞 ( 未施用实施例化合物 ) 被设定为 100% pAxl， 未经 GAS6 处理 ( 也未施用实施例化合物 ) 的细胞为基线零。该实施例化合物显示出 EC50 为约 0.8 μM。
Luminex® phosphor-AKT (S473) 试验 Luminex® (Luminex® Corporation, Austin, TX) 试验平台是一种能对天然构型状态 下的多种蛋白分析直接来自生命体系的表达的系统。 该系统的组件简单地由所研究的目标 分析物—例如磷酸化的蛋白质、 聚苯乙烯微球、 仪器流体、 仪器光学系统和高速数据处理系 统构成。 羧基化的聚苯乙烯珠由于微球表面能与各式各样的分析物捕捉物种共价结合而使 该试验平台具有灵活性。 此外， 一组 100 个不同的珠子中的每个微球都充满红色 / 红外染料的梯度混合物， 从而使每个珠子有自己的特征染料混合物。每个珠内的这种独特的染料混 合物使得 Luminex® 仪器能鉴别那只珠子通过光学系统， 并且， 假定一组 100 只珠子中每只 都能有不同的捕捉分析物物种与其表面结合， 则 96 孔板的每个孔能分析最高达 100 种不同 的分析物。因此， 用这一平台能够观察 96 个不同样品中数目从一种到最多 100 种分析物。 TM Bio-Plex 磷蛋白检测试剂盒 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA) 是该平台对 于 phospho-AKT (S473) 试验的具体应用。在这种情形只分析一种分析物。phospho-AKT (S473) Single Plex 是用 MDA-MB 231 和 U2-OS 细胞如下所述地工作 ： Bio-Plex ™ (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA) phospho-AKT (S473) 要 工作 3 天。第一天的晚上将完全培养基中的细胞植入透明的平底黑壁 96 孔板 (Greiner Bio-One North America Inc., Monroe, North Carolina)， 对于 MDA-MB 231( 美国模式培 养物保藏所， Manassas， VA) 密度为 35,000 细胞 / 孔， 对于 U2-OS( 美国模式培养物保藏所， Manassas, VA) 密度为 30,000 细胞 / 孔。次晨将细胞用半对数浓度为 3 μM 至 0.03 μM 的 Axl 抑制剂处理， 在 37℃和 5% CO2 温育 10 分钟。10 分钟后， 在除未处理的孔之外的所 有孔中加入 2.5 μg/mL 重组人 GAS6(rhGAS6)(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)， 在 37℃和 5% CO2 温育 5 分钟。温育后除去培养基， 细胞用冰冷的 PBS(HyClone Laboratories Inc., Logan, UT) 洗。除去 PBS， 细胞用 Bio-PlexTM 试剂盒中提供的裂解缓冲液裂解。板 内的细胞用滴管头尖刮取， 然后置于板摇荡器上于 4℃在 600 rpm 摇荡 20 分钟。摇荡后将 细胞裂解物转移到一只透明的 V 形底 96 孔板 (Greiner Bio-One North America Inc., Monroe, North Carolina) 中， 在 4℃于 4500 rcf( 相对离心力 ) 下离心 20 分钟。将细胞 裂解物储存在冰上， 同时通过用试剂盒内包含的洗涤缓冲液洗涤的步骤， 准备试剂盒内包 TM 含的滤板和 Bio-Plex 珠。一旦准备好滤板和对 phospho-AKT(S473) 特异性的 Bio-PlexTM 珠， 每孔加入 50 μL 细胞裂解液， 使细胞植入密度等于 400 μg/ 孔的蛋白质。将含有在蛋 TM 白裂解液中的 Bio-Plex 珠的滤板置于加盖的摇荡器中在室温下于 600 rpm 振荡过夜。次 晨准备 Luminex® 仪器， 用洗涤缓冲液将 Bio-PlexTM 珠洗 3 次， 然后与对 phospho-AKT(S473) 特异性的第二检测抗体一起温育 30 分。温育后， 将滤板中的 Bio-PlexTM 珠再洗 3 次， 与试 剂盒中的链霉亲和素 - 藻红蛋白 (SAPE) 一起温育， 使得 Luminex® 系统的光学系统能检测 出那些珠子含有与其结合的目标分析物 phospho-AKT(S473)。 将 SAPE 溶液内的珠子在加盖 TM 的摇荡器中于室温下摇荡 10 分钟， 然后用 Bio-Plex 试剂盒中的冲洗缓冲液冲洗 3 次。冲 洗后， 将板在 1100 rpm 下短暂摇动以使珠子重新悬浮。然后将板放入 Luminex® 仪器的托 盘中， 分析样品。
一旦开始板的分析， 平均荧光强度 (MFI) 的读出系统产生的原始数字被用来计算 phospho-AKT(S473) 的平均相对磷酸化百分数。 磷酸化相对百分数是由只含 rhGAS6 组计算 如下 ： 将每个样品减去本底的 MFI 值除以只含 rhGAS6 的样品的减去本底的平均 MFI 值。这 得到每个样品重复样的相对磷酸化百分数， 然后将其一起平均， 得到每个重复样的平均相 对磷酸化百分数。这一数据分析能够比较未处理组和 rhGAS6 处理的细胞以证实细胞对于 rhGAS6 的激动剂响应， 以及比较 Axl 抑制剂处理的细胞和只用 rhGAS6 处理的细胞， 以证实 Axl 抑制剂在封阻 Axl/GAS6 信号转导通道方面的效力， 该通道是由丝氨酸 473 活化的 AKT 传播的。可以用线性方程计算 EC50 以确定 Axl 的磷酸化被抑制 50% 时的浓度。这样， 化合 物可以彼此比较抑制 Axl 的能力。试验的本发明样品在以上的 Bio-PlexTM 试验中显示出 EC50 结果为约 1.06 μM 至 约 0.455 μM。优选 EC50 结果小于 1.0 μM。更优选的是 IC50 结果小于 0.5 μM。
phospho-Axl 免疫沉淀法试验 作为一种受体酪氨酸激酶， Axl 被来自 GAS6 的配体键合通过磷酸化而激活。目前还不 知道在 Axl 激酶上当配体键合时被磷酸化的特异性磷酸化酪氨酸残基， 因此， 市场上买不 到能探测磷酸 Axl 的抗体。就这一点而论， 免疫沉淀技术能被用来发挥观察 phospho-Axl 的能力。免疫沉淀法的概念简单。将编码 Axl 激酶的 DNA 质粒与一个小的蛋白标记物 ( 例 如 FLAG®) 短暂转染到细胞中。令细胞生长并超量表达被标记的 Axl 蛋白。当细胞裂解时， 包含在细胞胞质内的可溶性 Axl 蛋白与缓冲液和缀合了对 FLAG® 蛋白标记物特异性的抗体 的琼脂糖珠混合。用这种方式， 只有用 FLAG® 标记的超量表达的 Axl 与抗体 - 珠体系结合。 通过低速离心， 现在与 FLAG® 标记的 Axl 结合的琼脂糖珠被旋转沉出上清液， 并与非必需蛋 白分离。一系列洗涤步骤保证只有 Axl 蛋白与琼脂糖结合， 随后可通过蛋白还原和变性使 其从抗体 - 珠体系中释放。一旦该蛋白已被变性和还原成为线性， 它就可以利用聚丙烯酰 胺凝胶电泳分离。凝胶中包含的蛋白可以转移到硝化纤维膜上， 利用一般的磷酸化酪氨酸 抗体进行蛋白质印迹检测。类似地， 总 Axl 蛋白可以通过用识别 FLAG® 标记的 Axl 蛋白的 抗体探测该膜来检测。因此， 可以确定用 GAS6 配体激发的转染细胞的总 Axl 水平和磷酸化 Axl 水平之间的可检测的差别。 上面列出的方法与免疫沉淀技术一起使用以得到本文的数据。
对培养的 HEK 293 细胞 ( 美国模式培养物收藏所， Manassas, VA) 计数以达到 30 6 × 10 细胞 /mL。将含有此细胞计数的适当体积的培养基在 200 rcf 下离心 10 分钟。吸 出培养基， 将细胞沉淀物重新悬浮在足够体积的 Cell Line Nucelofector® 溶液 V(Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland) 中， 以便达到在试验中每孔植入 100 μL 细胞溶液。 此 6 方法为 6 孔板每孔提供 3 × 10 细胞。在重新悬浮之后， 将细胞分小份装入 1.5 mL 微量 离心管 (USA Scientific Inc., Ocala, FL) 中， 每管 100 μL。向该悬浮液中加入 2 μg 的 Axl 质粒 ((Origene Technologies Inc., Rockville, MD)， 混合后放入在 Amaxa® Cell Line Nucelofector® 试剂盒 V(Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland) 中提供的电穿孔 小槽中。对细胞进行电穿孔， 然后向小槽中加入 500 μL 完全培养基。取出细胞悬浮液放 入一只已经含有 1.5 mL 预温热的完全培养基的 6 孔板 (Becton Dickinson and Company, San Jose, CA) 中。对每个样品孔重复此过程， 然后在 37℃和 5% CO2 下温育该细胞 24 小 时。次日， 将细胞用半对数浓度从 3 μM 至 0.01 μM 的 Axl 抑制剂处理， 在 37℃和 5% CO2 下温育 10 分钟。 10 分钟温育后， 除去细胞培养基， 加入得自 WI38( 美国模式培养物收藏所， Manassas, VA) 细胞的含 GAS6 的新鲜的温热条件培养基。此外， 再次加入从 3 μM 至 0.01 μM 的半对数浓度的新鲜 Axl 抑制剂， 然后在 37℃和 5% CO2 下温育 5 分钟。5 分钟的温育 完成后， 除去培养基， 细胞用冰冷的 PBS(HyClone Laboratories Inc., Logan, UT) 洗。除 去 PBS， 将细胞用 100 mL 通用细胞裂解缓冲液裂解， 缓冲液中含有 1% NP40、 120 mM NaCl、 30 mM Tris pH 7.4、 1X 蛋白酶抑制剂 (EMD Chemical Inc., Darmstadt, Germany)， 1X 磷 酸酶抑制剂 (Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO)。 刮取细胞， 将悬浮液吸取到 1.5 mL 微 量离心管中。将管在冰上温育 10 分钟， 然后将裂解液在 13,500 rpm 下离心 15 秒使裂解液 澄清。将上清液转移到新的微量离心管中， 利用 BCA 试剂盒 (Thermo Fisher Scientific
Inc., Rockford, IL) 定量测定蛋白质。在另外的微量离心管中加入 40 μL 抗 FLAG® M2 琼脂糖 (Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO)， 用 TBS 洗 3 次， 保持在 4℃。洗涤后， 向该 抗 -FLAG® M2 琼脂糖中加入 800 μL 旋转缓冲液和适当体积的细胞裂解液以达到 200 μg/ 样品， 所述旋转缓冲液是 TBS， 0.2% BSA(Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO)， 1X 蛋白 酶抑制剂 (Promega Corporation Madison, WI)， 2X 磷酸酶抑制剂 (Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO)。将样品在 4℃旋转过夜。次日， 将样品在 4℃于 250 rcf 离心 30 秒， 移 出上清液。每只管中的抗 FLAG® M2 琼脂糖用洗涤缓冲液 (TBS 和 0.1% BSA) 洗 2 次， 然后 再洗 2 次， 每次在 4 ℃转动 15 分钟。最后用 TBS 洗， 然后将含抗 FLAG® M2 琼脂糖的样品 在 70 μL 2X LDS 缓冲液 (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA)、 2X 样品还原缓冲液 (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA) 和水中于 70℃烧煮 10 分钟， 烧煮后， 将各样品在 150 V 下电泳穿过 4-12% Bis-Tris 聚丙烯酰胺凝胶 (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA)1.5 小时， 然后转移到硝化纤维膜上。转移后， 用在 TBST( 含 0.05% Tween 20 的 TBS 溶 液， EMD Chemical Inc., Darmstadt, Germany) 中的 5% 脱脂奶粉溶液在室温下封阻该膜 1 小时。供 phospho-Axl 用的第一抗体是抗磷酸化酪氨酸 PY20-HRP 缀合物 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)， 它在室温下按 1:500 的比例在 5% 的脱脂奶粉 / TBST 溶液中使用 1 小时。供总 Axl 用的第一抗体是抗 DDK 抗体 (Origene Technologies Inc., Rockville, MD)， 它检测 FLAG 抗原表位， 在室温下按 1:1000 的比例在 5% 脱脂奶 粉 /TBST 溶液中使用 1 小时。温育后将膜用 TBST 洗 3 次， 每次 5 分钟。然后通过在膜上 加 1 mL Super Signal West Dura ECL (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) 并用 Kodak In Vivo FX 成像剂 (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) 成像， 使 phospho-Axl 用的 PY20-HRT 抗体显影。将总 Axl 膜与第二抗体一起温育， 该抗体是山羊抗 鼠 HRP(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)， 按 1:1000 在 20% 山羊血清 (Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO)/TBST 中于室温下使用 1 小时。将膜用 TBST 洗 3 次， 每次 15 分钟， 然 后用类似的方式显色。
磷酸化 Axl 的印迹的磷酸化百分数使用 Kodak In Vivo FX 软件确定， 以画出在 phospho-Axl 和总 Axl 谱带周围的兴趣区 (ROI)。该 ROI 信息提供了谱带的净强度值， 它随 后被用来使 phospho-Axl 对于总 Axl 信号规一化， 其作法是将每个谱带的 phospho-Axl 净 强度除以同一样品的总 Axl 信号的净强度。磷酸化百分数随后通过各样品的规一化数值除 以只含 GAS6 的样品的规一化数值来计算。这样， 在未处理样和 GAS6 激发样之间可进行比 较以证实激动剂效力， 而只含 GAS6 的样品与含 GAS6 + Axl 抑制剂的样品之间的比较则显 示了抑制剂阻断因 GAS6 配体结合与激发导致的激酶磷酸化的能力。利用线性公式方程可 以计算出 EC50 以确定 Axl 的磷酸化被抑制 50% 时的浓度。于是， 化合物可以彼此比较抑制 Axl 的能力。
试验的本发明的实施例在以上的免疫沉淀试验中显示出 EC50 结果为约 0.100 μM 至约 0.068 μM。
化学 本发明化合物可以由化学领域的普通专业人员利用常规的合成步骤以及下面描述的 一般反应方案和实施例制备。2-(3-(2- 氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 化合物 A) ： 将 含有 2,4- 二氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 (500 mg, 2.66 mmol) 和 2-(3- 氨基苯基 ) 乙腈 (351 mg, 1 当量 ) 的反应混合物在 90℃微波加热 21 小时。浓缩并用 CombiFlash 快速制 备色谱纯化 (4 g， DCM 至 10% MeOH/DCM)， 得到黄色粉末。
2,2’ -(3,3’ -(7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -2,4- 二基 ) 双 ( 氮烷二基 ) 双 (3,1- 亚 苯基 )) 二乙腈 ( 实施例 1) ： 实施例 1 是在化合物 A 的制备期间作为副产物被分离。
2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 基 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 2) ： 向化合物 A(50 mg, 0.176 mmol) 和 3- 氟 -4-(4- 甲 基哌嗪 -1- 基 ) 苯胺 (36.9 mg, 1 当量 ) 在 IPA(5 mL) 中的反应混合物加入 HCl(4M 二氧杂 环己烷溶液， 0.132 mL， 3 当量 )。将混合物在 150℃微波加热 1 小时。HPLC(280 nm) 指示 33% 转化。加入 Na2CO3。浓缩并用 CombiFlash 快速制备色谱分离 (4 g, DCM 至 10% MeOH/ DCM)， 得到棕色固体。2-(3-(2-(4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 3) ： 步骤与实施例 2 的制备相似。
2-(3-(2-(4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 )-3-( 三氟甲基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 4) ：。
2-(3-(2-(4-(4- 环己基哌嗪 -1- 羰基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 5) ：。
2-(3-(2-(4-(4- 甲基哌嗪 -1- 羰基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 6) ：。
2-(3-(2-(4-(4- 环己基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 7) ：。
2-(4-(2- 氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 化合物 B) ： 2,4- 二氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 (500 mg) 和 2-(4- 氨基苯基 ) 乙腈 (351 mg) 在 1- 丁 醇中混合并在 90℃加热 24 小时。从透明溶液中形成黄色沉淀。浓缩并用 CombiFlash 快速 制备色谱分离 (12 g, DCM 至 10% MeOH/DCM)， 得到棕色固体。
2-(4-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 8) ： 步骤与实施例 2 的制备相似。N-(3-(2- 氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 环丙烷甲酰胺 ( 化合 物 C) ： 步骤与化合物 B 的制备相似。
N-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 氨基 ) 苯基 ) 环丙烷甲酰胺 ( 实施例 9) ：。 2,4,5- 三氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 ( 化合物 D) ： 将 2,4- 二氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 (0.1 g, 0.532 mmol) 和 NSC(0.132 g, 1.2 当量 ) 在 DCM/THF(10 mL/4 mL) 中的反应混合物在 90℃微波加热 2.5 小时。浓缩并用 CambiFlash 快速制备色谱分离 (10 g, DCM)， 得到白色固体。
2,4- 二氯 -5- 氟 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 ( 化合物 E) ： 向 2,4- 二氯 -7H- 吡咯 [2,3-d] 嘧啶 (90.3 g, 1.6 mmol)、 Selectfluor 氟试剂 (0.848 g, 2.4 mmol) 的溶液中 加入乙腈 (15 mL) 和 AcOH(2,5 mL)。然后将溶液在氩气下于 70℃加热 24 小时。冷却至室 温后加冰， 将混合物用 NaHCO3 中和。用 EtOAc 萃取， 有机残留物用 CombiFlash 快速制备色 谱分离 (10 g, 0%~100% EtOAc/ 己烷 )。得到白色晶体。
2-(3-(2,5- 二氯 -7H- 吡咯 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 化合物 F) ： 制备步骤与实施例 2 的制备相似。
2-(3-(2- 氯 -5- 氟 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 化合物G) ：。2-(3-(2- 氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 化合物 H) ： 向 2,4- 二 氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 (0.5 g, 2.66 mmol)、 2-(3-(4,4,5,5- 四甲基 -1,3,2- 二氮杂 硼杂环戊 -2- 基 ) 苯基 ) 乙腈 (647 mg, 1 当量 ) 和 Pd(PPh3)4(92 mg, 0.08 mmol) 的混合
物中加入 Na2CO3(2 M， 3.99 mL， 3 当量 ) 和二氧杂环己烷 (16 mL)。将反应混合物在 150℃ 微波加热 1 小时。浓缩并用 CombiFlash 快速制备色谱分离 (40 g, DCM 至 10% MeOH/DCM)， 得到黄色粉末。2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 12) ： 反 应条件 与实施 例 2 的 制备相 似。 产物用 硅 胶 CombiFlash 快速制备色谱和 C-18 RediSep 柱纯化以除去所有的起始物。
2- 氯 -4-(3- 甲氧甲基 ) 苯基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 ( 化合物 H) ：。 N-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯基 )-4-(3-( 甲氧甲基 ) 苯基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -2- 胺 ( 实施例 13) ：
。
2- 氯 -4-(3-( 三氟甲氧基 ) 苯基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 ( 化合物 J) ：。
3-(2- 氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 )-N,N- 二甲基苯胺 ( 化合物 K) ：。 N-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯基 )-4-(3-( 三氟甲氧基 ) 苯基 )-7H- 吡咯 [2,3-d] 嘧啶 -2- 胺 ( 实施例 14) ：
。 4-(3-( 二甲基氨基 ) 苯基 )-N-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯基 )-7H- 吡咯 并 [2,3-d] 嘧啶 -2- 胺 ( 实施例 15) ：
。
2-(4-(2- 氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 化合物 L) ：。
本发明的代表性实施例列在下面的表 1 和表 2 中。 表1。
表2。本发明的化合物包括 ： 2,2’ -(3,3’ -(7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -2,4- 二基 ) 双 ( 氮烷二基 ) 双 (3,1- 亚苯 基 )) 二乙腈 ； 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨 基 ) 苯基 ) 乙腈 ； 2-(3-(2-(4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨基 ) 苯 基 ) 乙腈 ; 2-(3-(2-(4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 )-3-( 三氟甲基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧 啶 )-4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ; 2-(3-(2-(4-(4- 环己基哌嗪 -1- 羰基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨 基 ) 苯基 ) 乙腈 ; 2-(3-(2-(4-(4- 甲基哌嗪 -1- 羰基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ; 2-(3-(2-(4-(4- 环己基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨基 )
苯基 ) 乙腈 ; 2-(4-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨 基 ) 苯基 ) 乙腈 ; N-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨 基 ) 苯基 ) 环丙烷甲酰胺 ; 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯基氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ; N-(3- 氟 -4-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 基 )-4-(3-( 甲 氧 甲 基 ) 苯 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧啶 -2- 胺 ; N-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -4- 基 ) 苯基 )-4-(3-( 三氟甲氧基 ) 苯基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -2- 胺 ; 4-(3-( 二 甲 氨 基 ) 苯 基 )-N-(3- 氟 -4-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧啶 -2- 胺 ; 及它们的可药用的盐。
本发明的其它实施例示于下表中 ：实施例 17-23 可利用以下前体和本文所述的一般合成途径来制备。 前体的合成 ：1-(2- 氟 -4- 硝基苯基 ) 哌啶 ( 化合物 AA) 向大的圆底烧瓶中加入乙腈 (40 mL)、 3,4- 二氟硝基苯 (0.278 mL, 2.51 mmol) 和哌 啶 (0.298 mL, 3.02 mmol)。 在加哌啶时， 溶液由透明变成黄色透明溶液。 将形成的溶液在 80℃和搅拌下回流过夜 (16 小时 )。TLC(30% DCM/ 己烷 ) 表明反应完全。CombiFlash 快速 色谱分离 (10 g， 己烷至 DCM) 得到黄色油状的化合物 AA。3- 氟 -4-( 哌啶 -1- 基 ) 苯胺 ( 化合物 AB) 向化合物 AA(506 mg, 2.257 mmol) 在乙醇 (50 mL) 中的溶液加入 Pd/C(100 mg, 0.094 mmol) 催化剂。将该黑色的悬浮液在氢气氛下 (60 psi) 摇动 2 小时。TCL(DCM) 表明反应 完全。 CombiFlash 快速制备色谱 (10 g， 己烷至乙酸乙酯 ) 得到化合物 AB， 为浅红棕色油状 物。
1-(2- 氟 -4- 硝基苯基 )-4- 甲基哌啶 ( 化合物 AC) 向一只大圆底烧瓶中加入乙腈 (45 mL)、 3,4- 二氟硝基苯 (0.313 mL， 2.83 mmol) 和 4- 甲基哌啶 (0.418 mL, 3.39 mmol)。 将该溶液在搅拌下回流 (80℃ ) 过夜。 TLC(30% DCM/ 己烷 ) 显示反应完全。CombiFlash 快速制备色谱 (10 g， 己烷至 DCM) 得到黄色油状的化合 物 AC。
3- 氟 -4-(4- 甲基哌啶 -1- 基 ) 苯胺 ( 化合物 AD) 向化合物 AC(559 mg, 2.346 mmol) 在乙醇 (55 mL) 中的溶液加入 Pd/C(112 mg, 0.105 mmol) 催化剂。将得到的黑色悬浮液在氢气氛 (60 psi) 下摇动 2 小时。TLC(6% MeOH/DCM) 显示反应完全。CombiFlash 快速制备色谱 (10 g, 己烷至乙酸乙酯 ) 得到化合物 AD 固体。
1- 乙基 -4-(2- 氟 -4- 硝基苯基 ) 哌嗪 ( 化合物 AE) 向一只大的圆底烧瓶中加入乙腈 (40 mL)、 3,4- 二氟硝基苯 (0.278 mL, 2.51 mmol) 和 1- 乙基哌嗪 (0.391 mL, 3.02 mmol)。将形成的溶液在搅拌下回流 (80℃ ) 过夜 (16 小 时 )。TLC(50% EtOAc/ 己烷 ) 显示反应完全。CombiFlash 快速制备色谱 (10 g, DCM 至 10% MeOH/DCM) 得到化合物 AE， 为浅黄橙色晶态固体。
4-(4- 乙基哌嗪 -1- 基 )-3- 氟苯胺 ( 化合物 AF) 向化合物 AE(599 mg, 2.365 mmol) 在乙醇 (60 mL) 中的溶液加入 Pd/C(120 mg, 0.113 mmol) 催化剂。 将形成的黑色悬浮液在氢气氛 (60 psi) 下摇动 2 小时。 TLC(10% MeOH/DCM) 显示反应完全。CombiFlash 快速制备色谱 (10 g, 己烷至乙酸乙酯 ) 得到金棕色油状的化 合物 AF。
4-(4- 氨基苯基 ) 哌嗪 -1- 羧酸苄酯 ( 化合物 AG) 向 1-(4- 氨基苯基 ) 哌嗪 (300 mg, 1.693 mmol) 和三乙胺 (0.236 mL, 1.693 mmol) 在 DCM(30 mL) 中的透明的暗色溶液在搅拌下逐滴加入氯甲酸苄酯 (0.238 mL, 1.693 mmol)。 将形成的溶液在室温下搅拌 1 小时， 之后 HPLC 显示反应完全。浓缩并用 CombiFlash 快速 制备色谱 (10 g, DCM 至 10% MeOH/DCM) 分离， 得到化合物 AG 固体。
4,4- 二氟 -1-(2- 氟 -4- 硝基苯基 ) 哌啶 ( 化合物 AH) 向 3,4- 二氟硝基苯 (0.278 mL, 2.51 mmol) 在乙腈 (40 mL) 中的溶液加入 4,4- 二氟 哌啶盐酸盐 (475 mg, 3.02 mmol) 和三乙胺 (0.526 mL, 3.77 mmol)。TLC 显示 18 小时后 反应完全。 浓缩和 CombiFlash 快速制备色谱分离 (10 g, 己烷至乙酸乙酯 ) 得到黄色晶状 固体化合物 AH。4-(4,4- 二氟哌啶 -1- 基 )-3- 氟苯胺 ( 化合物 AI) 向化合物 AH(321 mg, 1.23 mmol) 在乙醇 (32 mL) 中的溶液加入 Pd/C(64.2 mg, 0.060 mmol) 催化剂。 将形成的黑色悬浮液在氢气氛 (60 psi) 下摇动 2 小时。 TLC(10% MeOH/DCM) 显示反应完全。CombiFlash 快速色谱分离 (10 g, 己烷至乙酸乙酯 ) 得到浅红棕色油状的 化合物 AI。
在 0 ℃下向氢化钠 (94 mg, 3.91 mmol) 在 DMF(10 mL) 中的悬浮液加入 1- 甲 基 -4- 羟基哌啶 (300 mg, 2.60 mmol)。在溶液恢复到室温之前， 似乎无 H2 放出。使溶液 在室温下搅拌 1.5 小时。向此混合物中加入 3,4- 二氟硝基苯 (0.577 mL, 5.21 mmol)。溶 液迅速地变成深绿色， 然后成深橙色。将此溶液在 150℃再搅拌 3 小时。用 20 mL 半饱和的 碳酸氢钠水溶液稀释， 萃取到乙酸乙酯 (3×30 mL) 中。浓缩和高真空干燥得到化合物 AJ， 为粗制的棕色液体， 它不进行还原， 将在下一步对混合物进行氢化并用色谱法纯化。 MS 证实 + + 其结构。MS(ESI ) ： 255.2(M+H) 。
3- 氟 -4-(1- 甲基哌啶 -4- 基氧 ) 苯胺 ( 化合物 AK) 向化合物 AJ(2.00 g, 7.87 mmol) 在乙醇 (100 mL) 中的溶液加入 Pd/C(0.837 g, 7.87 mmol) 催化剂。将此黑色悬浮液在氢气氛 (60 psi) 下摇动 1 小时。TLC(10% MeOH/DCM) 显 示反应完全。 浓缩和硅胶色谱 (10 g, DCM 至 50% MeOH/DCM) 得到化合物 AK， 为在约 25-30% MeOH/DCM 下洗脱的次要产物， 两次收率 25.3%。外观为深棕色油。
2-(4-(2- 氟 -4- 硝基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 乙醇 ( 化合物 AL) 向 3,4- 二氟硝基苯 (0.221 mL, 1.999 mmol) 在乙腈 (20 mL) 中的无色透明溶液加入 1- 哌嗪乙醇 (0.245 mL, 1.99 mmol)。该溶液立即变成深黄色。将反应溶液在 130℃加热 1 小时， 之后溶液变浑， 成深橙色。浓缩至干， 加在硅胶上， 用色谱法纯化 (10 g, DCM 至 15% MeOH/DCM)， 得到化合物 AL(464 mg, 1.723 mmol, 收率 86%)。
2-(4-(4- 氨基 -2- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 乙醇 ( 化合物 AM) 向化合物 AL(460 mg, 1.708 mmol) 在乙醇 (45 mL) 中的橙色透明溶液中加入 Pd/C(92 mg, 0.086 mmol) 催化剂。将反应混合物在氢气氛 (60 psi) 下摇动 1 小时。浓缩和硅胶色 谱分离 (10 g, DCM 至 50% MeOH/DCM)， 得到浅黄色晶状固体化合物 AH。N-(2- 氟 -4- 硝基苯基 )-1- 甲基哌啶 -4- 胺 ( 化合物 AN) 向 4- 氨基 -1- 甲基哌啶 (0.220 mL, 1.751 mmol) 在乙腈 (20 mL) 中的溶液加入 3,4- 二氟硝基苯 (0.194 mL, 1.751 mmol)。将反应混合物在 130℃微波加热 30 分。TCL 显示出新的斑点。 浓缩和硅胶色谱分离 (4g, DCM 至 10% MeOH/DCM) 得到化合物 AN， 为浅黄 色晶状固体。
2- 氟 -N1-(1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 苯 -1,4- 二胺 ( 化合物 AO) 向化合物 AN(155 mg, 0.612 mmol) 在 EtOH(30 mL) 中的溶液加入 Pd/C(31 mg, 0.029 mmol) 催化剂。 将形成的黑色悬浮液在氢气氛 (60 psi) 下摇动 2 小时。 TLC(10% MeOH/DCM) 显示反应完全。 浓缩和硅胶色谱分离 (4g, DCM 至 50% MeOH/DCM) 得到化合物 AO， 为浅黄色 粉状固体。
1-(2-(2- 氟 -4- 硝基苯氧基 ) 乙基 ) 吡咯烷 ( 化合物 AP) 向吡咯烷乙醇混合物 (0.724 g, 6.29 mmol) 中加入 NaH(1.2 当量 )。5 分钟后加入二 氟硝基苯 (1 g， 6.29 mmol)。30 分钟后再加入 1 当量 NaH。将混合物用 EtOAc 和水稀释。 用 EtOAc(80 mL×3) 萃取， 用 50 mL 水洗。有机相用 MgSO4 干燥和浓缩， CombiFlash 快速色
谱分离 (24 g, DCM 至 10% MeOH/DCM) 得到黄色固体。3- 氟 -4-(2-( 吡咯烷 -1- 基 ) 乙氧基 ) 苯胺 ( 化合物 AQ) 将化合物 AP(550 mg, 2.16 mmol)、 Pd/C(100 mg) 在 EtOH(50 mg) 中的混合物在氢气氛 (60 psi) 下摇动 3 小时。 TLC(10% MeOH/DCM) 指示反应完全。 将混合物浓缩， 用 CombiFlash 分离 (10 g, DCM 至 10% MeOH/DCM)， 得到黄色油状物。
2-(3-(2-(4-(4- 乙 基 哌 嗪 -1- 基 )-3- 氟 苯 基 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 17) ：
。 2-(3-(2-(4-(4-( 甲磺酰 ) 哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 19) ：
。
2-(3-(2-(4-(4,4- 二 氟 哌 啶 -1- 基 )-3- 氟 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 21) ：。 2-(3-(2-(4- 吗啉基苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 23) ：
。 2-(3-(2-(4-(2-( 吡 咯 烷 -1- 基 ) 乙 氧 基 ) 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 18) ：
。 2-(3-(2-(4-(2-( 二甲基氨基 ) 乙氧基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 20) ：
。 2-(3-(2-(4-(4-(2- 羟 乙 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 22) ：
。
本发明的其它实施例示于下表中 ：。 以上实施例可以利用以下方案和以上所示的方案制备， 包括使用下面的中间体化 合物 BA、 BB、 BC 和 BD。
2- 氯 -4-(3- 氯 -4- 氟苯基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 ( 化合物 BA)。将含 2,4- 二氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 (250 mg, 1.33 mmol)、 3- 氯 -4- 氟苯 基硼酸 (232 mg, 1.33 mmol)、 Pd(PPh3)4(30.7 mg, 0.02 当量 ) 和 Na2CO3(1.33 mL, 2M)
的反应混合物在二氧杂环己烷 (5 mL) 中用微波在 120℃加热 1 小时。HPLC 显示反应完成。 将反应混合物浓缩和 CombiFlash 快速色谱分离 (24 g, 己烷至 EtOAc)， 得到 304 mg 浅黄 色固体。
2- 氯 -4-(4- 氟苯基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 ( 化合物 BB)。 4-(3- 氯 -4- 氟 苯 基 )-N-(3- 氟 -4-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧啶 -2- 胺 ( 实施例 24) ：
。
N-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯基 )-4-(4- 氟苯基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧 啶 -2- 胺 ( 实施例 26) ：。
2-(3-(2-(4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯 基 ) 乙腈 ( 实施例 28) ：。
2-(3-(2-(4-(4- 乙 基 哌 嗪 -1- 基 )-3- 氟 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 30) ：。 4-(4-(4-(3-( 氰甲基 ) 苯基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -2- 基氨基 ) 苯基 ) 哌 嗪 -1- 羧酸苄酯 ( 实施例 32) ：
。 2-(3-(2-(4-( 哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙 腈 ( 实施例 25) ： 向一只干净的小反应烧瓶中加入实施例 32(161 mg, 0.296 mmol) 和 HBr/ HOAc 溶液 (1 mL, 5.52 mmol)。加入 HBr 溶液时， 二氧化碳的放出明显。将反应混合物搅 拌 1 小时。加入乙醚以沉淀产物， 并将产物过滤分离。浓缩和 CombiFlash 快速制备色谱分 离 (4 g, DCM 至 10% MeOH/DCM) 得到实施例 25， 为粉状固体。
2-(3-(2-(4-(4-( 甲 磺 酰 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 27) ：。 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲 基 哌 啶 -1- 基 ) 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 29) ：
。
2-(3-(2-(4-(4,4- 二 氟 哌 啶 -1- 基 )-3- 氟 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 31) ：。 2-(3-(2-(4- 吗啉基苯基氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实 施例 33) ：
。 2-(3-(2-(3- 氟 -4- 吗啉基苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙 腈 ( 实施例 34) ：
。 2-(3-(2-(3- 氟 -4-( 哌啶 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯 基 ) 乙腈 ( 实施例 36) ：
。 2-(3-(2-(4-(2-( 吡 咯 烷 -1- 基 ) 乙 氧 基 ) 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 38) ：
。 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(2-( 吡咯烷 -1- 基 ) 乙氧基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 40) ：
。 2-(3-(2-(4-(2- 二甲基氨基 ) 乙氧基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 42) ：
。
2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4-(2- 羟乙基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 35) ：。
2-(3-(2-(3- 氟 -4-(1- 甲 基 哌 啶 -4- 基 氧 ) 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 37) ：。 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(1- 甲基哌啶 -4- 基氨基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 39) ：
。 2-(3-(2-(4-(4-(2- 羟 乙 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 氨 基 )-7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 41) ：
。
2-(3-(2- 氯 -5- 甲基 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 化合物 BC)。将 含 2,4- 二 氯 -5- 甲 基 -7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧 啶 (100 mg, 0.495 mmol)、 2-(3-(4,4,5,5- 四甲基 -1,3,2- 二氧杂硼杂环戊 -2- 基 ) 苯基 ) 乙腈 (120 mg, 1 当量 ) 和 Pd(PPh3)4(11.44 mg, 0.02 当量 ) 的混合物与 Na2CO3(0.495 mL, 2M) 在二氧杂环己烷 (5 mL) 中用微波在 120℃加热 2 小时。浓缩和用 CombiFlash 快速制备色谱分离 (10 g, 己烷 至乙酸乙酯 )， 得到 36 mg 灰白色固体的实施例 7078b。
2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-5- 甲基 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 43) ：
。 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(2-( 吡咯烷 -1- 基 ) 乙氧基 ) 苯氨基 )-5- 甲基 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 44) ：
。
2-(3-(2- 氯 -5,6- 二甲基 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 化合物 BD) ：。
2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 氨 基 )-5,6- 二 甲 基 -7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 46) ：。
2-(3-(2-(4-(4-(2- 羟乙基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-5- 甲基 -7H- 吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 45) ：。
2-(3-((2-((3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯基 ) 氨基 )-5- 羟基 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 氨基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 47) ： HR-MS ： 473.22058(M+H)+, 计算值 ： 473.22081。
2-(3-(2-((4-(4- 乙 基 哌 嗪 -1- 基 )-3- 氟 苯 基 ) 氨 基 )-5- 甲 基 -7H- 吡 咯 并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 49) ：。
还由实施例化合物制备了一些可药用盐 ： 实施例 30 甲磺酸盐 ： 将实施例 30 溶于 5 mL 氯仿中， 加入 0.5 mL 异丙醇， 加甲磺酸， 搅 拌 5 分钟。在 7 分钟内向反应混合物中滴加 70 mL 乙醚并激烈搅拌。滤出固体， 在仍然潮 湿的情况下置于高真空下干燥。
。
实施例 30 盐酸盐 ：。实施例 30 盐酸盐和实施例 30 甲苯磺酸盐 ： 制备实施例 30 盐酸盐的另一途径是经 由甲苯磺酸盐 ：。 室温下向 2,4- 二氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 (SM-3) 和 2-(3-(4,4,5,5- 四甲 基 -1,3,2- 二氧杂硼杂环戊 -2- 基 ) 苯基 ) 乙腈 (SM-2) 在二氧杂环己烷 / 水混合物中的 混合物依次加入碳酸钠和双 ( 二叔丁基 (4- 二甲基氨基苯基 ) 膦 ) 二氯化钯 (II) 催化剂 固体。将形成的混合物加热回流 45 分钟， 然后除去溶剂至三分之一体积， 收集分离出的固 体， 得到 2-(3-(2- 氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 (INT-001)。
室温下向 2-(3-(2- 氯 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 (INT-001) 在二氯甲烷中的溶液依次加入三乙胺、 甲苯磺酰氯和催化数量的 DMAP。将形成的混合物 在室温下搅拌 1 小时， 然后蒸除溶剂。向残留物中加水， 抽气过滤收集分离出的固体， 得到 2-(3-(2- 氯 -7- 甲苯磺酰 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 (INT-001-Ts)。
室温下向 2-(3-(2- 氯 -7- 甲苯磺酰 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙 腈 (INT-001-Ts) 和 3- 氟 -4-(4- 乙基哌嗪 -1- 基 ) 苯胺 (SM-5) 在甲苯中的混合物加入碳 酸铯和 Xantphos 配体， 随后加入 Pd2(dba)3 催化剂。 将形成的混合物加热回流 20 小时， 然后 蒸发溶剂。 向残留物中加入乙腈， 抽气过滤出不溶解的固体。 将滤液浓缩， 用快速柱和 MeOH/ DCM 纯化， 得到 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 乙基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7- 甲苯磺酰 -7H- 吡咯 并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 30-Ts)。
在 室 温 下 向 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 氨 基 )-7- 甲 苯 磺酰 -7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 30-Ts) 在 THF/ 水中的溶液依次 加入 LiOH 和催化数量的 CTAB。将形成的混合物加热回流 24 小时后蒸除溶剂。残留物溶在 乙酸乙酯中， 用水、 盐水洗， 用 Na2SO4 干燥， 过滤和浓缩。残留物用快速柱和 MeOH/DCM 纯化， 得到 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 乙基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 30 游离碱 )。
室温下向 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 乙基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 30 游离碱 ) 在氯仿 /IPA 混合物中的溶液加入 HCl/ 二 氧杂环己烷溶液。将形成的混合物搅拌 5 分钟， 然后过滤分离出的固体， 用 MTBE 洗。减压 干燥 4 小时后得到 2-(3-(2-(3- 氟 -4-(4- 乙基哌嗪 -1- 基 ) 苯氨基 )-7H- 吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈二盐酸盐 ( 实施例 30·2HCl)， 定量收率。
类 似 地， 其 它 实 施 例 及 其 盐 可 以 通 过 用 碳 酸 铯 和 Xantphos 配 位 体、 随后用 Pd2(dba)3 催化剂处理中间体甲苯磺酸盐制备。例如， 实施例 43 用这一甲苯磺酸盐方法制 备。先形成实施例 43 甲苯磺酸盐， 然后用 LiOH 和 CTAB 催化处理， 形成实施例 43。盐酸盐 可随后由该游离碱形成。
实施例 38 甲磺酸盐 ：。
实施例 38 盐酸盐 ：。
实施例 41 盐酸盐 ：。
实施例 41 甲磺酸盐 ：。
实施例 39 甲磺酸盐 ：。
实施例 39 盐酸盐 ：。
实施例 43 盐酸盐 ：。
实施例 40 盐酸盐 ：。
与上述实施例相似， 其它实施例可以按照以下的化学示意类似地制备 ：。2-(3-(2- 氯噻吩并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈的合成。将 2,4- 二氯噻吩并 [2,3-d] 嘧啶 (0.3 g, 1.463 mmol) 和 2-(3-(4,4,5,5- 四甲 基 -1,3,2- 二氧杂硼杂环戊 -2- 基 ) 苯基 ) 乙腈 (0.356 g, 1.463 mmol) 溶在二氧杂环己 烷 (12 mL) 和水 (2 mL) 的混合物中。然后鼓入 N2， 加入 Pb(PPh3)4(85 mg, 0.073 mmol) 和 K2CO3(0.404 g, 2.93 mmol)， 将溶液在 140℃加热 120 分钟。将反应混合物溶于水 (20 mL)， 用 50 mL DCM 萃取 2 次。有机相用 Na2SO4 干燥后蒸发。用柱色谱法， 使用乙酸乙酯 / 己烷， 2-25% 比例溶剂体系， 得到纯产物 2-(3-(2-( 氯噻吩并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 (0.418 g, 0.595 mmol， 收率 41%)。
2-(3-(2-((3- 氟 -4-(4- 甲 基 哌 嗪 -1- 基 ) 苯 基 ) 氨 基 ) 噻 吩 并 [2,3-d] 嘧 啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 ( 实施例 48) 的合成。将 2-(3-(2- 氯嘧啶 -4- 基 ) 苯基 ) 乙腈 (0.130 g, 0.455 mmol) 和 3- 氟 -4-(4- 甲 基哌嗪 -1- 基 ) 苯胺 (0.095 g, 0.455 mmol) 溶在异丙醇 (5 mL) 和 4M HCl/ 二氧杂环 己烷 (0.227 mL) 中。将此溶液在 150 ℃加热 16 小时。TLC 指示反应完全。将有机相用 NaHCO3 中和， 用 Na2SO4 干燥。利用柱色谱法， 使用甲醇 /DCM， 0-5% 比例溶剂体系得到纯产物 2-(3-(2-((3- 氟 -4-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 苯基 ) 氨基 ) 噻吩并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 基 ) 苯 基 ) 乙腈 ( 实施例 48)。
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本说明书中提到的和 / 或申请资料页中列出的任何美国专利、 美国专利申请出版 物、 美国专利申请、 外国专利、 外国专利申请和非专利出版物均以参考引用方式全文并入本 文中。根据上述将会理解， 虽然本文中已描述了本发明的具体实施方案作为示例说明， 但在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以作出各种修改。63