说明书一种荧光团衍生物及其应用
技术领域
本发明涉及用于检测硫烷硫的荧光探针，具体的说是一种荧光团衍生物及其应用。
背景技术
硫化氢(H2S)作为一种内源性重要的气体信号分子，具有多种重要的生理功能，然而H2S在这些生理功能中起作用的化学机理仍不清楚。且H2S在组织和体液中的浓度也备受争议：“自由态”硫化氢浓度仅维持在亚摩尔级别。H2S之所以能维持在较低浓度可能是由于硫烷硫与H2S之间存在一种平衡转换。硫烷硫是活性硫物种的一种，指以6价电子的形式(S0)可逆地附着在其它硫原子上的离子化硫。然而，硫烷硫具有比H2S更高的活性，能更快地参与一系列生理反应，因此硫烷硫可能是实际的信号传导分子，H2S可能只是基于硫烷硫信号传导终端所释放的终产物，即作为硫烷硫的还原产物。这也与生理状态的H2S浓度总是保持在较低的浓度相一致。而这就需要新的实验证据证明：在硫化氢信号转导过程中，硫烷硫分子是否为实际的信号传导分子。如果该情况得到证实，那么H2S可能只是基于硫烷硫信号传导终端所释放的终产物。
鉴于硫烷硫在细胞信号转导通路中的重要生物医学意义，发展用于检测硫烷硫浓度变化水平的分析方法已经变得越来越迫切。目前，用于检测硫烷硫的方法有:比色法，电化学分析，色谱分析法。但是这些方法往往需要试样预处理，荧光探针方法以其高时空分辨、操作简便和原位非损伤检测等优点，在生物活性物种检测领域，已成为一种功能强大的研究辅助工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光团衍生物及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种荧光团衍生物，荧光团衍生物如通式Ⅰ所示，
通式Ⅰ中，
R为C4-22的烷基或有机酸酯；
X1为N、O或S；
Y为S、Se或Te；
X2为具有细胞器定位功能的基团。
所述有机酸酯为甲酸酯或丁酸酯；具有细胞器定位功能的基团为-OH、三苯基膦、生物素、C4-22的烷基、单糖或多糖。
优选，所述通式Ⅰ中，X1为N；R为乙基；Y为S、Se或Te；X2为-OH、三苯基膦、生物素、C4-22的烷基、单糖或多糖。
更有选，所述通式Ⅰ中，R为乙烷；X1为N；Y为S；X2为-OH。
一种荧光团衍生物的制备方法，在惰性气体保护下，将花菁类荧光团溶解于二氯甲烷中，再加入花菁类荧光团摩尔量80-100倍的DIPEA(二异丙基乙胺)，待用；再加入花菁类荧光团摩尔量15-20倍的固体光气溶解于甲苯中，冰水浴下，滴加到上述溶液，室温下反应至溶液由蓝色变为绿色，而后旋蒸去杂质，杂质出除,后依次加入二氯甲烷，再加入花菁类荧光团摩尔量80-100倍的DIPEA、花菁类荧光团摩尔量1.6-2倍的DMAP(二甲氨基吡啶)和花菁类荧光团摩尔量的10倍的2,2’-二硫二乙醇，在四十摄氏度下搅拌反应至完全，反应后将反应液调节至中性，调节后纯化即得到如通式Ⅰ所示荧光团衍生物。
优选，在惰性气体保护下，将花菁类荧光团溶解于二氯甲烷中，再加入花菁类荧光团摩尔量80倍的DIPEA(二异丙基乙胺)，待用；加入花菁类荧光团摩尔量15倍固体光气溶解于甲苯中，冰水浴下，滴加到上述溶液，室温下反应至溶液由蓝色变为绿色，而后旋蒸去杂质，杂质出除,后依次加入二氯甲烷，加入花菁类荧光团摩尔量100倍的DIPEA、花菁类荧光团摩尔量2倍的DMAP(二甲氨基吡啶)和花菁类荧光团摩尔量的10倍的2,2’-二硫二乙醇，在四十摄氏度下搅拌反应至完全，反应后将反应液调节至中性，调节后纯化即得到如通式Ⅰ所示荧光团衍生物。
一种荧光团衍生物的应用，以所述通式Ⅰ所示的荧光团衍生物作为硫烷硫的荧光探针。
一种荧光探针，荧光探针为在荧光母体上引入亲脂性基团有机酸酯或烷基，以及检测基团和具有定位功能的基团，即如通式Ⅰ所示的荧光团衍生物。
所述检测基团(-Y-Y-)为-S-S-、-Se-Se或-Te-Te-基团。
所述荧光探针用于定性/定量地检测生理环境下细胞或生物体内外的硫烷硫浓度。
本发明的有益效果：
本发明化合物用于作为硫烷硫检测的荧光探针，其在检测硫烷硫前后荧光探针吸收和荧光发射最大波长会有改变。可用于水体系、模拟生理环境和细胞内硫烷硫水平的检测，并可大大降低外部检测条件的干扰，提高 检测精度。本发明化合物用作荧光探针，可用于细胞内硫烷硫检测，这对深入研究硫烷硫在生物体内的信号转导过程和机理，进一步了解硫烷硫的生理和毒理作用具有重要的生物医学意义。
附图说明
图1为本发明实施例提供的所采用的荧光探针对硫烷硫检测前后荧光光谱的变化图。
图2为本发明实施例提供的所采用的荧光探针对硫烷硫的选择性示意图；其中，横坐标从左至右依次为：亚硫酸氢钠、硫酸钠、硫烷硫、硫化氢、斜方硫、谷胱甘肽、半胱氨酸、氧化型半胱氨酸。
具体实施方式
荧光探针通式为：
通式Ⅰ中，
R为烷基或有机酸酯；
X1为N、O或S；
Y为S、Se或Te；
X2为-OH、三苯基膦、生物素、C4-22的烷基、单糖和多糖等具有细胞器定位功能的基团。
优选为：
X1为N时，所述化合物的通式为：
通式II中：
R为乙基；
Y为S、Se或Te；
X2为-OH、三苯基膦、生物素、C4-22的烷基、单糖和多糖等具有细胞器定位功能的基团。
更优选，通式Ⅰ中，R为乙烷；X1为N；Y为S；X2为-OH。
将通式Ⅰ与待测定水体、模拟生理环境或生物体内外的硫烷硫反应从而导致荧光波长和荧光强度的改变，所得通式III结构的化合物；
将通式II结构应用于检测硫烷硫时，与硫烷硫作用后，生成具有通式V结构的化合物，从而导致荧光波长和荧光强度的改变；
通式I可对硫烷硫进行定性、定量的检测。
本发明中使用的术语“有机酸酯链”包括直链有机酸酯基和支链有机酸酯基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
具体实施方式
本发明实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
实施例1.花菁类化合物的制备：
通式Ⅰ中所示花菁类荧光团来自市售商品，然后在荧光团相应的位置分别修饰检测基团和定位基团，在二氯甲烷溶剂中反应得到的相应的花菁类化合物，其中，以下化学试剂均来市售自上海国药。具体实施例如下：
制备式一化合物：
在氩气保护下，花菁类荧光团(60mg,0.1mmol)溶于50ml新蒸的二氯甲烷中，加入1mL DIPEA(二异丙基乙胺)。固体光气(0.2g,0.67mmol) 溶解在2mL甲苯中，冰水浴下，滴加到上述溶液，室温下反应3小时，溶液由蓝色变为绿色。旋蒸，用乙醚洗去杂质。去除杂质后依次加入50mL新蒸过的二氯甲烷，1mL DIPEA、20mg DMAP(二甲氨基吡啶)，2，2’-disulfanediyldiethanol(0.6g,4mmol)，而后于40℃下搅拌反应，直到反应完全(点板，确定反应终点)。反应后以稀盐酸(10％)中和反应至中性，然后经二氯甲烷(100ml╳3)萃取，萃取后加硫酸钠干燥，蒸干溶剂后用硅胶柱色谱(10-20目)分离。洗脱剂为乙酸乙酯和甲醇(8:1/v/v)，收集绿色组分，蒸干溶剂后得得式一化合物62mg,收率:80％。其中，新蒸的二氯甲烷通过往二氯甲烷中加入氢化钙干燥回流获得。
式一化合物1H NMR(500MHz,CDCl3-D1)δ(ppm):1.29-1.43(m,13H),1.77(s,6H),2.16-2.18(m,2H),2.42(q,1H),2.57(m,1H),2.74-2.83(m,4H),3.08(m,1H),3.24(t,2H),3.65(s,3H),3.94-4.22(m,6H),4.35(s,1H),4.58-4.79(m,4H),6.48(d,1H),6.69-6.73(m,3H),7.02-7.36(m,6H),8.06(t,1H),8.94(d,1H).13C NMR(125MHz,CDCl3-D1)δ(ppm):171.85,155.07，147.64，141.76，141.44，141.37，141.25，137.94，128.56，127.95，127.87，126.25，126.16，125.11，122.19，114.85，110.63，106.50，100.54，63.93，59.78，49.19,40.95，40.85，38.99，37.92，32.01，27.55，27.29，27.19，11.20.LC-MS(API-ES):m/zC46H56N3O4S2+Calcd 778.3707,found[M+H]+778.3708.
另外，通式Ⅰ所示的其它化合物按照上述的说明制备获得。并且将通式Ⅰ所示荧光团转换为其他市售荧光团。然后在荧光团相应的位置分别修饰检测基团和定位基团，在二氯甲烷溶剂中反应可得到的相应的荧光团所衍生的探针。
现以式一所指化合物为例说明测定过程，以下实施例中涉及到的探针化合物均为式一所指化合物：
实施例2
将制备所得式一化合物作为探针应用于水体系、模拟生理环境和细胞内进行对硫烷硫的检测，模拟生理条件，以下各项实验均在pH＝7.4条件下进行(HEPES缓冲溶液，浓度为10mM)，探针浓度采用1mM。
上述制备所得化合物式一对硫烷硫的响应：
pH采用HEPES缓冲溶液控制。于10ml比色管中加入1mM化合物式一，再加入10mM HEPES，然后加入10mM硫烷硫，超纯水定容到10ml，摇匀溶液，平衡10min后，将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。荧光光谱在检测硫烷硫前后的变化如图1所示。本化合物可用于实现生物体内的硫烷硫检测。同时，本发明实施例提供的探针与硫烷硫反应后产物结构如下：
实施例3
在上述实施例2操作后，向待测液中加入化合物如图2所示，待测物依次为：斜方硫、硫氢化钠、四硫化钠、氧化型谷胱甘肽、氧化型半胱氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、硫辛酸、胱氨酸和硫酸钠。摇匀溶液，25℃下平衡10min后，将各个比色管中工作液分别倒入到荧光皿中测定荧光光谱。式一化合物对硫烷硫的选择性如图2所示。并由图可知式一化合物对硫烷硫具有很好的选择性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。