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1、(10)申请公布号 CN 102311981 A (43)申请公布日 2012.01.11 CN 102311981 A *CN102311981A* (21)申请号 201110201993.5 (22)申请日 2011.07.19 CCTCC NO: M2011209 2011.06.23 C12P 17/16(2006.01) C07D 207/44(2006.01) C12R 1/43(2006.01) (71)申请人 东南大学 地址 215123 江苏省苏州市工业园区仁爱路 188 号 (72)发明人 浦跃朴 杨飞 尹立红 吴巍 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司。
2、 32103 代理人 范晴 (54) 发明名称 制备提纯灵菌红素的方法 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 制 备 提 纯 灵 菌 红 素 的 方 法，该 方 法 是 用 粘 质 沙 雷 氏 菌 （Serratiamarcescens） 生产菌株， 经粘质沙雷氏 菌母种发酵培养， 提取红色代谢产物并浓缩得到 灵菌红素粗品 ； 然后对灵菌红素粗品通过硅胶柱 层析法、 高效液相色谱分离法进行纯化， 再通过真 空低温冷冻干燥获得灵菌红素高纯品。该方法制 备的高纯品产品纯度为 98%， 而且生产方法高 效， 使用的有机溶剂可以旋转蒸发而回收循环利 用。 (83)生物保藏信息 (51)Int。
3、.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 6 页 CN 102311983 A1/1 页 2 1. 一种制备提纯灵菌红素的方法， 其特征在于所述方法包括先培养粘质沙雷氏菌 （Serratia marcescens） LTH-2菌株， 然后从粘质沙雷氏菌 （Serratia marcescens） LTH-2菌 株代谢产物中分离纯化获得灵菌红素的步骤 ； 所述粘质沙雷氏菌 （Serratia marcescens） LTH-2 菌株现在已经保藏于中 国 典 型 培 养 物 保 藏 中 心， 保藏编号为 CCTCC M 2011。
4、209。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述方法具体包括以下步骤 ： （1） 用粘质沙雷氏菌 （Serratia marcescens） LTH-2 生产菌株， 经粘质沙雷氏菌母种发 酵培养， 提取红色代谢产物并浓缩得到灵菌红素粗品 ； （2） 对灵菌红素粗品使用硅胶柱层析法进行初步分离纯化， 所述初步分离纯化的条件 是 ： 洗脱液采用石油醚、 乙酸乙酯混合物进行梯度洗脱 ； 梯度控制的条件为起始阶段石油 醚与乙酸乙酯的体积比为50:1， 中间阶段采用的石油醚与乙酸乙酯的体积比为20 ： 1和10 ： 1， 最后阶段石油醚与乙酸乙酯的体积比为 5 ： 1， 收集石油醚与乙酸乙。
5、酯的比例为 5:1 时的 洗脱下来的组分并浓缩形成灵菌红素次纯品 ； （3） 对灵菌红素次纯品通过高效液相色谱分离法进行进一步纯化， 高效液相色谱分离 法的条件是 ： 色谱柱采用 C18 柱， 柱温控制在 28， 流动相采用甲醇、 0.1% 冰乙酸， 进行梯 度洗脱， 梯度洗脱的条件是 ： 0 5min 采用体积比占 65% 的甲醇以及体积比占 35% 的 0.1% 冰乙酸混合流动相洗脱 ； 5.0113min只采用甲醇洗脱 ； 13.0115.2min采用体积比占65% 的甲醇以及体积比占 35% 的 0.1% 冰乙酸混合流动相洗脱 ； 以双波长监测灵菌红素纯化过 程 ： 检测波长为 535。
6、nm， 参比波长为 630nm ； 检测波长为 254nm， 参比波长为 360nm ； 根 据颜色变化和色谱检测器信号的变化， 收集 2.0 4.0min 时间段的红色组分， 即可得到含 有甲醇和 0.1% 冰乙酸的灵菌红素溶液， 并旋转蒸发去除甲醇形成灵菌红素高纯品。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于所述方法步骤 （1） 中粘质沙雷氏菌母种通 过以下方法制备 ： 在牛肉膏蛋白胨培养生产发酵母种， 将颜色深红的菌株接种于牛肉膏蛋 白胨斜面培养基上， 并将此菌株作为发酵母种菌株使用。 4. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于所述方法步骤 （1） 中发酵培养粘质沙雷氏 菌。
7、母种的方法是 ： 接种生产发酵母种于发酵培养基中发酵生产， 发酵条件是 ： 通气培养， 生 产温度控制在 2830得到发酵液 ； 所述的发酵培养基为液体培养基， 培养基以其组分的 重量百分比计包括 ： 牛肉膏 5 重量份数 ； 蛋白胨 10 重量份数 ； NaCl 5 重量份数 ； 蒸馏水 100 重量份 数 ； 所述液体培养基的 pH 值控制在 6.8 7.5。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于所述方法步骤 （1） 灵菌红素粗品是通过将 发酵液离心， 上清液用乙酸乙酯萃取， 沉淀物溶解于甲醇， 合并上清液中的乙酸乙酯红色萃 取物和沉淀物中的甲醇红色提取物得到含灵菌红素的混合液。
8、， 将含灵菌红素的混合液浓缩 后溶解于乙酸乙酯， 去除不溶物得到灵菌红素粗品。 6. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于所述方法步骤 （3） 中旋转蒸发去除甲醇再 经真空低温冷冻干燥除去溶剂形成灵菌红素高纯品。 权 利 要 求 书 CN 102311981 A CN 102311983 A1/8 页 3 制备提纯灵菌红素的方法 技术领域 0001 本发明属于制药技术领域， 具体涉及一种制备提纯灵菌红素的方法。 背景技术 0002 灵菌红素 (Prodigiosin)， 其结构如式 (I) 所示， 正式名称为 2-methyl-3-pe ntyl-6-methoxyprodiginine。
9、)， 是 Prodiginin 的 一 种， 是 由 粘 质 沙 雷 氏 菌 (Serratia marcescens) 和多种放线菌 (Streptomyces) 等细菌合成的一类次级代谢产物。灵菌红素， 又名灵菌素、 灵杆菌素， 具有三吡咯环骨架结构， 其中的一个吡咯环 C2 上带有一个甲基， C3 上则有一个戊基。 0003 0004 从 1929 年 Amak 等人发现此类物质以来， 对该物质性质及生物活性的研究一直倍 受相关研究人员的关注， 随着研究的不断深入， 它的许多生物学活性被人们所认识， 包括 抗疟疾 (antimalarial)、 抗细菌 (antibacterial)、 。
10、抗真菌 (antifungal) 和抗原生动物 (antiprotozoal)的活性。 尤其抗癌活性研究方面， 因为其具有癌组织的高针对性和对正常 细胞则表现的低毒害作用， 因此灵菌红素很有可能成为一种拥有良好的生物活性且副作用 小的抗癌药物， 从而被开发成一种非常有潜力的抗癌物质。 其次， 灵菌红素为一种微生物生 产的天然色素， 可克服以动植物为原料生产天然色素的诸多缺点， 且易于工业化， 具有可大 量用于食品工业的潜力。 另外， 近些年来， 有些研究表明灵菌红素具有很强的藻细胞溶解酶 活性， 能杀灭引起赤潮的浮游藻类和引起水华的微囊藻， 其有望通过相关的毒性试验检测， 成为治理赤潮和水华的。
11、产品。 虽然灵菌红素具有特异的活性， 为一种天然色素， 具有可大量 用于食品工业的潜力， 具有成为治理治理赤潮和水华的产品的潜力， 还具有治疗癌症的药 用潜力， 但灵菌红素的作用机理还不是十分清楚， 因此对其微生物发酵生产、 分离纯化以及 药理毒理的进一步深入研究具有重要的科研和应用价值。 0005 现在常用的制备灵菌红素的工艺生产环节繁多， 有机溶剂耗量大， 尤其纯度不高， 从而难以满足药理毒理学等方面研究的需求。因此， 现阶段需要一种制备灵菌红素高纯品 的方法， 对灵菌红素毒理和药理学方面的基础研究以及相关应用研究都具有非常重要的意 义。本发明因此而来。 发明内容 说 明 书 CN 102。
12、311981 A CN 102311983 A2/8 页 4 0006 本发明目的在于提供一种制备提纯灵菌红素的方法， 解决了现有技术中灵菌红素 难以制备以及制备后难以纯化等问题。 0007 为了解决现有技术中的这些问题， 本发明提供的技术方案是 ： 0008 一种制备提纯灵菌红素的方法， 其特征在于所述方法包括先培养粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens)LTH-2菌株， 然后从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LTH-2菌 株代谢产物中分离纯化获得灵菌红素的步骤 ； 所述粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) LTH-2 菌株现在已经保。
13、藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC M 2011209。 0009 优选的， 所述方法具体包括以下步骤 ： 0010 (1) 用粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens)LTH-2 生产菌株， 经粘质沙雷氏菌母 种发酵培养， 提取红色代谢产物并浓缩得到灵菌红素粗品 ； 0011 (2) 对灵菌红素粗品使用硅胶柱层析法进行初步分离纯化， 所述初步分离纯化 的条件是 ： 洗脱液采用石油醚、 乙酸乙酯混合物进行梯度洗脱 ； 梯度控制的条件为起始阶 段石油醚与乙酸乙酯的体积比为 50 1， 中间阶段采用的石油醚与乙酸乙酯的体积比为 201和101， 最后阶段石油醚与乙酸。
14、乙酯的体积比为51， 收集石油醚与乙酸乙酯的 比例为 5 1 时的洗脱下来的组分并浓缩形成灵菌红素次纯品 ； 0012 (3) 对灵菌红素次纯品通过高效液相色谱分离法进行进一步纯化， 高效液相色谱 分离法的条件是 ： 色谱柱采用 C18 柱， 柱温控制在 28， 流动相采用甲醇、 0.1冰乙酸， 进 行梯度洗脱， 梯度洗脱的条件是 ： 0 5min 采用体积比占 65的甲醇以及体积比占 35的 0.1冰乙酸混合流动相洗脱 ； 5.01 13min 只采用甲醇洗脱 ； 13.01-15.2min 采用体积比 占 65的甲醇以及体积比占 35的 0.1冰乙酸混合流动相洗脱 ； 以双波长监测灵菌红 。
15、素纯化过程 ： 检测波长为 535nm， 参比波长为 630nm ； 检测波长为 254nm， 参比波长为 360nm ； 根据颜色变化和色谱检测器信号的变化， 收集 2.0 4.0min 时间段的红色组分， 即 可得到含有甲醇和 0.1冰乙酸的灵菌红素溶液， 并旋转蒸发去除甲醇形成灵菌红素高纯 品。 0013 优选的， 所述方法步骤 (1) 中粘质沙雷氏菌母种通过以下方法制备 ： 在牛肉膏蛋 白胨培养生产发酵母种， 将颜色深红的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上， 并将此菌 株作为发酵母种菌株使用。 0014 优选的， 所述方法步骤 (1) 中发酵培养粘质沙雷氏菌母种的方法是 ： 接种生产发。
16、 酵母种于发酵培养基中发酵生产， 发酵条件是 ： 通气培养， 生产温度控制在 28 30得到 发酵液 ； 所述的发酵培养基为液体培养基， 培养基以其组分的重量百分比计包括 ： 0015 牛肉膏 5 重量份数 ； 0016 蛋白胨 10 重量份数 ； 0017 NaCl 5 重量份数 ； 0018 蒸馏水 100 重量份数 ； 0019 所述液体培养基的 pH 值控制在 6.8 7.5。 0020 优选的， 所述方法步骤 (1) 灵菌红素粗品是通过将发酵液离心， 上清液用乙酸乙 酯萃取， 沉淀物溶解于甲醇， 合并上清液中的乙酸乙酯红色萃取物和沉淀物中的甲醇红色 提取物得到含灵菌红素的混合液， 将。
17、含灵菌红素的混合液浓缩后溶解于乙酸乙酯， 去除不 溶物得到灵菌红素粗品 说 明 书 CN 102311981 A CN 102311983 A3/8 页 5 0021 优选的， 所述方法步骤 (3) 中旋转蒸发去除甲醇再经真空低温冷冻干燥除去溶剂 形成灵菌红素高纯品。 0022 本发明属于生化分离技术领域， 是一种从粘质沙雷氏菌发酵液中分离制备灵菌红 素高纯品的方法。所得的灵菌红素经 HPLC-DAD 检测， 其纯度 98， 可做标准样品。本发 明所提供制备灵菌红素的方法， 是用粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)生产菌株， 经粘 质沙雷氏菌母种发酵培养， 提取红色代谢产物和。
18、纯化代谢产物， 从而制备灵菌红素高纯品， 具体制备步骤是 ： 0023 (1) 母种制备 ： 在牛肉膏蛋白胨培养生产发酵母种， 将颜色深红的菌株接种于牛 肉膏蛋白胨斜面培养基上， 并将此菌株作为发酵母种菌株使用。 0024 (2) 发酵生产红色代谢产物 ： 接种生产发酵母种于发酵培养基中发酵生产， 发酵 条件是 ： 通气培养， 生产温度为30。 所述的发酵培养基为液体培 养基， 培养基配方为 ： 牛 肉膏 5g， 蛋白胨 10g， NaCl5g， 蒸馏水 100mL， pH6.8 7.5。 0025 (3) 提取红色代谢产物和浓缩 ： 离心发酵液， 上清液用乙酸乙酯萃取， 沉淀物溶解 于甲醇，。
19、 合并上清液中的乙酸乙酯红色萃取物和沉淀物中的甲醇红色提取物。将含灵菌红 素的洗脱液浓缩后得到其粗品。 0026 (4) 硅胶柱层析分离纯化 ： 将上面红色的粗品溶解于乙酸乙酯， 去除不溶物， 然后 上硅胶柱， 用石油醚、 乙酸乙酯混合物对硅胶柱进行梯度洗脱 ( 石油醚乙酸乙酯起始比 为 50 1， 接着为 20 1 和 10 1， 最终配比为 5 1， 均为体积比 )， 收集红色组分 ( 石 油醚乙酸乙酯体积比为 5 1 时的组分 )， 即通过梯度洗脱硅胶柱， 观察洗脱液的颜色来 控制收集得到红色洗脱液， 旋转蒸发浓缩可得到红色精制品， 此精制品纯度 80。 0027 (5) 分析型高效液相。
20、色谱纯化和真空低温冷冻干燥 ： (I) 高效液相色谱纯化 ： 将 硅胶柱纯化后的红色精制品溶于一定量的甲醇， 然后上高效液相色谱 (Agilent 1100， Agilent， USA) 进行进一步纯化， 其参数条件 Zorbax Extend C18 柱 (4.6150mm， 5m， Agilent， USA)， 柱温 ： 28， 双波长监测灵菌红素纯化过程 ： 检测波长为 535nm， 参比波长 为 630nm ； 检测波长为 254nm， 参比波长为 360nm。流动相 ： (A) 甲醇， (B)0.1冰乙酸。 梯度洗脱 ： 0-5min， 65 (A) ； 5.01-13min， 10。
21、0 (A) ； 13.01-15.2min， 65 (A)。根据颜色 变化和色谱检测器信号的变化， 收集 2.0-4.0min 时间段的红色组分， 即可得到含有甲醇和 0.1冰乙酸的灵菌红素溶液， 然后进行旋转蒸发， 将大部分的甲醇除去。 0028 (II) 真空低温冷冻干燥 ： 真空冷冻干燥技术， 简称冻干， 是将含水物料预先冻 结， 然后使之在真空状态下升华的一种方法。经冷冻干燥的物品， 原有的生物化学特性基 本不变， 易于长期保存， 加水后能恢复到冻干前的形态， 并且能保持其原有生化特性， 因此 冷冻干燥技术在化学工业、 生物制品等领域得到广泛应用。利用真空冷冻干燥机 ( 型号 ： LG。
22、J-18)， 对液相纯化后的红色样品进行冷冻干燥浓缩， 将甲醇、 冰乙酸和水成分去掉， 最后 采用电动压盖装置进行压盖。 即进行速冻， 然后真空干燥， 最后真空压盖包装形成成品一灵 菌红素高纯品 ( 一种红色干粉物质 )。 0029 由于此次分析型高效液相色谱纯化的对象是硅胶柱纯化后的精制品， 粗 品中大 部分的杂质由硅胶柱去除， 高效液相色谱几乎只发挥了进一步纯化的效果， 因此大大增强 了高效液相色谱的作用， 使高效液相色谱每次分离的样品量大大增加， 使每次分离得到的 灵菌红素高纯品量大大增加， 从而可适于毫克级灵菌红素高纯品的制备。最后经真空低温 说 明 书 CN 102311981 A 。
23、CN 102311983 A4/8 页 6 冷冻干燥， 然后真空压盖， 从而得到灵菌红素高纯品干粉。 0030 (6) 高效液相色谱双波长检测测定灵菌红素高纯品成品纯度 ： 双波长分光光度检 测法具有可用于严重重叠的色谱峰的检测等众多优点， 从而可以更广范围地检测物质， 尤 其紫外波段长常用于检测一些样品中的杂质。高效液相色谱双波长检测测定灵菌红素纯 度 ： 检测波长为535nm， 参比波长为630nm ； 检测波长为254nm， 参比波长为360nm。 其它 参数为 ： Zorbax Extend C18 柱 (Agilent， USA) ； 柱温 ： 28； 流动相 ： (A) 甲醇， (。
24、B)0.1冰 乙酸， 体积比为6535 ； 流速 ： 1ml/min ； 进样量 ： 10l。 高效液相检测结果显示， 此产品纯 度 98。 0031 这些理化特性、 分子量、 1H-NMR、13C-NMR、 FT-IR、 GC-MS， TOFMS-ES+ 等数据与灵菌红 素一致， 即经过理化性质及结构的鉴定试验可知此制备方法所得的高纯度产品正是灵菌红 素。 0032 使用的微生物 0033 使用的微生物为粘质沙雷氏菌， 根据其生物类别情况命名为粘质沙雷氏菌 (Sarratia marcesens)LTH-2， 来自中华人民共和国江苏省无锡市太湖湖水中分离获得， 现 在已经保藏于中国典型培养物。
25、保藏中心， 该保藏中心的地址位于湖北省武汉市武汉大学生 命科学学院武汉市武昌珞珈山 ； 粘质沙雷氏菌 (Sarratia marcesens)LTH-2 的保藏日期为 2011 年 6 月 23 日， 保藏期限为 30 年， 保藏编号为 CCTCC M 2011209。 0034 本发明提供的溶藻菌是从江苏省无锡市富营养化程度严重且微囊藻水华频发 的太湖中筛选的得到的菌株。该菌株为太湖中土著的异养细菌， 命名为 LTH-2， 此菌经过 Biolog微生物鉴定系统鉴定以及此菌16S rDNA序列分析， 其属于粘质沙雷氏菌(Sarratia marcesens) 中的成员。菌 LTH-2 的 16。
26、SrDNA 全基因序列已向美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 的 Genebank 基因序列数据库递交， 登录号为 HM640277。 0035 粘质沙雷氏菌 LTH-2 的微生物学特性 0036 1、 形态学方面的特性 0037 微生物本身形态学特性 ： 菌体为革兰氏阴性短杆状， 大小为 (0.7 0.9) m(1.0 1.3)m， 周身鞭毛， 有动力， 无芽孢， 无荚膜。 0038 2、 培养学方面的特性 0039 培养基用的是牛肉膏蛋白胨培养基。 其在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的微生物学 特性 ： 菌落呈圆形， 光滑， 湿润， 表面凸起， 中心不透明， 边缘不规则， 大小为 1-3mm。
27、， 均产生 红色色素， 有轻微异味。该菌为为兼性好氧菌。 0040 3、 生理生化特征 ： 0041 (1) 细胞产生红色色素 ； (2) 杆状 ； (3) 革兰氏阴性 ； (4) 氧化 / 发酵 (O/F) ： F 发 酵型 ； (5) 氧化酶 ： 阴性 ； (6) 鸟氨酸 ： 阳性 ； (7) 赖氨酸 ： 阳性 ； (8) 乳糖 ： 阴性 ； (9) 蔗糖 ： 阳性 ； (10) 苯丙氨酸 ： 阴性 ； (11) 葡萄糖酸盐 ： 阳性 ； (12) 甘露醇 ： 阳性 ； (13) 尿素 ： 阴性 ； (14)丙二酸眼 ： 阴性 ； (15)明胶液化 ： 弱阳性(22度) ； (16)七叶苷。
28、 ： 阳性 ； (17)水杨苷 ： 阴 性 ； (18) 麦芽糖 ： 阴性 ； (19) 半乳糖 ： 阳性 ； (20) 硝酸盐还原 ： 阳性 ； (21) 木糖 ： 阴性 ； (22) 密二糖 ： 弱阳性 ； (23)肌醇 ： 阳性 ； (24)海藻糖 ： 阳性 ； (25)棉籽糖 ： 阴性 ； (26)吲哚 ： 阴性 ； (27) 鼠李糖 ： 阴性 ； (28) 动力学检查 ： 阳性 ( 悬滴检查 )， 半固体为动力弱阳性。 0042 通过生理生化检测、 Biolog 微生物鉴定系统鉴定以及此菌 16S rDNA 序列分析均 说 明 书 CN 102311981 A CN 10231198。
29、3 A5/8 页 7 表明此菌为粘质沙雷氏菌中的成员， 因此可以精确地将本发明的 LTH-2 分类为粘质沙雷氏 菌， 从而建立了分类鉴定微生物的一种快速(利用Biolog微生物鉴定系统， 16h内即可得到 鉴定结果 )、 可靠、 准确的途径。 0043 该菌株能够高效溶解微囊藻， 24h 溶藻率 78.6。产生溶解微囊藻的红色代谢产 物灵菌红素， 代谢产物产量高。 0044 本发明所提供制备灵菌红素的方法， 是用 LTH-2 为生产菌株， 经母种发酵培养， 提 取红色代谢产物和纯化代谢产物的过程。 0045 经理化特性、 分子量、 1H-NMR、 FT-IR、 GC-MS 检测， 代谢产物的数。
30、据与灵菌红素一 致， 即经过理化性质及结构的鉴定试验可知此制备方法所得的产品是较纯的灵菌红素。将 代谢产物溶于微量甲醇中， 然后加入藻密度为 3106个 /mL 处于对数生长期的微囊藻液 中， 然后在显微镜下计数藻细胞浓度。在 24 内， 其对铜绿微囊藻的半数抑制浓度 IC50为 1.9(0.1)10-1gml-1。通过形态学、 一系列生化试验等生理生化特性以及 16S rDNA 序 列分析， 将此溶藻菌最终确定为粘质沙雷氏菌。 0046 经过对该产物理化性质、 分子量、 结构和溶藻效果分析， 可证明由菌株 LTH-2 发酵 提取的深红色代谢物为灵菌红素， 且具有较强的溶藻效果， 具有很好地开。
31、发成一种见效快、 用量少、 对环境友好的除藻剂的巨大潜力。该菌株的获得为消除微囊藻水华及其水华带来 的环境污染增添了一种生物途径， 也为开发出廉价但高效的生物活性物质以及天然色素奠 定了菌种基础， 有很好的研究前景。 0047 相对于现有技术中的方案， 本发明的优点是 ： 0048 本发明将发酵液中的上清液和菌体分别进行提取红色代谢产物， 节约了有机溶剂 的用量 ； 梯度洗脱硅胶柱层析分离纯化法纯化样品效率高， 有机溶剂可旋转蒸发从而回收 循环利用， 节约了有机溶剂的用量， 且采用石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂， 安全性高 ； 利用高 效液相色谱纯化样品， 采用双波长监测纯化过程， 可以高效率且准确。
32、地收集所需的组分 ； 采 用硅胶柱层析和分析型高效液相色谱纯化法相结合纯化样品， 大部分的杂质由硅胶柱去 除， 使高效液相色谱每次分离的样品量大大增加， 因此每次分离得到的灵菌红素高纯品量 大大增加， 从而高效且较大量地得到相应的高纯品， 可适于毫克级灵菌红素高纯品的制备 ； 经真空低温冷冻干燥， 然后采用真空压盖， 从而得到高纯度灵菌红素干粉。 最后利用高效液 相色谱双波长非常准备地测定了灵菌红素高纯品产品纯度， 排除了严重重叠的色谱峰的干 扰， 排除了杂质的干扰， 测得高纯品产品纯度为 98。 附图说明 0049 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 ： 0050 图 1 为本发明实施。
33、例进行高效液相色谱纯化得到的色谱图 ； 0051 图 2 为本发明实施例高效液相色谱双波长检测测定灵菌红素高纯品成品图 ； 0052 图 3 为所示为制备的灵菌红素高纯品溶液的 3D 图谱 ； 0053 图 4 为所示为制备的灵菌红素高纯品的 1H-NMR 图谱 ； 0054 图 5 为所示为制备的灵菌红素高纯品的 13C-NMR 图谱 ； 0055 图 6 为所示为制备的灵菌红素高纯品的 FT-IR 图谱 ； 0056 图 7 为所示为制备的灵菌红素的 GC-MS 图谱 ； 说 明 书 CN 102311981 A CN 102311983 A6/8 页 8 0057 图 8 为所示为制备的。
34、灵菌红素的 TOF MS-ES+ 图谱 ； 0058 图 9 为所示为制备的灵菌红素的紫外可见光全波长扫描图谱。 具体实施方式 0059 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解， 这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。 实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整， 未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 0060 实施例菌株红色色素的制备和结构鉴定 0061 粘质沙雷氏菌 (Sarratia marcesens)LTH-2 自中华人民共和国江苏省无锡市 太湖湖水中分离获得， 现在已经保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC M 2011。
35、209。 0062 以下对利用Serratia marcescens LTH-2为生产菌株(在美国国家生物技术信息 中心(NCBI)的Genebank基因序列数据库中的登录号为HM640277)， 制备其产生的红色代谢 产物灵菌红素的方法做进一步的详细说明。 0063 用 Serratia marcescens LTH-2 为生产菌株， 灵菌红素高纯品制备具体步骤如 下 ： 0064 (1) 母种制备 ： 在牛肉膏蛋白胨培养生产发酵母种， 将颜色深红的菌株 LTH-2 接种 于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上， 并将此菌株作为发酵母种菌株使用。 0065 (2) 发酵培养生产 ： 接种生产发酵母种于发。
36、酵培养基中发酵生产， 发酵条件是 ： 通 气培养， 生产温度为 30。所述的发酵培养基为液体培养基， 培养基配方为 ： 牛肉膏 5g， 蛋 白胨 10g， NaCl5g， 蒸馏水 100mL， pH6.8 7.5。 0066 发酵过程分三个阶段， 逐步扩大培养。首先将发酵母种菌株接种于含有新鲜培养 基的平皿中 ( 一级培养， 18-24 小时 )， 然后接种到装有 250mL 液体培养基的三角烧瓶中进 行摇床培养 ( 二级培养， 约 24 小时 )， 再将三角烧瓶中的发酵液作为母液加到装有 1.6L 的 液体培养基中， 进行通气发酵培养 ( 生产性发酵培养， 约 2 天及以上 )。二级培养与生。
37、产型 发酵培养之间母液和液体培养基之间的比例为 1 10。 0067 (3) 提取红色代谢产物 ： 12000r/min， 15min 离心发酵液， 上清液用乙酸乙酯萃取， 沉淀物溶解于甲醇， 合并上清液中的乙酸乙酯红色萃取物和沉淀物中的甲醇红色提取物。 0068 (4) 硅胶柱层析分离纯化 ： 将上面红色的粗品溶解于乙酸乙酯， 去除不溶物， 然后 上硅胶柱， 用石油醚、 乙酸乙酯混合物对硅胶柱进行梯度洗脱 ( 石油醚乙酸乙酯起始比 为 50 1， 接着为 20 1 和 10 1， 最终配比为 5 1， 均为体积比 )， 收集红色组分 ( 石 油醚乙酸乙酯比例为 5 1 时的组分 )， 即通过。
38、梯度洗脱硅胶柱， 观察洗脱液的颜色来控 制收集得到红色洗脱液， 旋转蒸发浓缩可得到红色精制品， 此精制品纯度 80。 0069 (5) 分析型高效液相色谱纯化和真空低温冷冻干燥 ： (I) 高效液相色谱纯化 ： 将 硅胶柱纯化后的红色精制品溶于一定量的甲醇， 然后上高效液相色谱 (Agilent 1100， Agilent， USA) 进行进一步纯化， 其参数条件 ZorbaxExtend C18 柱 (4.6150mm， 5m， Agilent， USA)， 柱温 ： 28， 双检测波长监测灵菌红素纯化过程 ： 检测波长为 535nm， 参比 波长为 630nm ； 检测波长为 254nm，。
39、 参比波长为 360nm。流动相 ： (A) 甲醇， (B)0.1冰乙 酸。梯度洗脱 ： 0-5min， 65 (A) ； 5.01-13min， 100 (A) ； 13.01-15.2min， 65 (A)。收集 说 明 书 CN 102311981 A CN 102311983 A7/8 页 9 2.0-4.0min 时间段的红色组分， 即可得到含有甲醇和 0.1冰乙酸的灵菌红素溶液， 然后 进行旋转蒸发， 将大部分的甲醇除去。 0070 (II) 真空低温冷冻干燥 ： 真空冷冻干燥技术， 简称冻干， 是将含水物料预先冻 结， 然后使之在真空状态下升华的一种方法。经冷冻干燥的物品， 原有。
40、的生物化学特性基 本不变， 易于长期保存， 加水后能恢复到冻干前的形态， 并且能保持其原有生化特性， 因此 冷冻干燥技术在化学工业、 生物制品等领域得到广泛应用。利用真空冷冻干燥机 ( 型号 ： LGJ-18)， 对液相纯化后的红色样品进行冷冻干燥浓缩， 将甲醇、 冰乙酸和水成分去掉， 最后 采用电动压盖装置进行压盖。即进行速冻， 然后真空干燥， 最后真空压盖包装形成成品 - 灵 菌红素高纯品 ( 一种红色干粉物质 )。 0071 (6) 高效液相色谱双波长检测测定灵菌红素高纯品成品纯度 ： 双波长分光光度检 测法具有可用于严重重叠的色谱峰的检测等众多优点， 从而可以更广范围地检测物质， 尤 。
41、其紫外波段常用于检测一些样品中的杂质。高效液相色谱双检测波长检测测定纯度 ： 检 测波长为 535nm， 参比波长为 630nm ； 检测波长为 254nm， 参比波长为 360nm。其它参数为 ： Zorbax Extend C 18 柱 (Agilent， USA) ； 柱温 ： 28； 流动相 ： (A) 甲醇， (B)0.1 冰乙酸， 体积比为 65 35 ； 流速 ： 1ml/min ； 进样量 ： 10l， 运行时间 20min。高效液相检测结果显 示， 此产品纯度 98。 0072 上述方法制备的产品纯度、 结构鉴定评价如下 ： 本实施例制备的灵菌红素高纯品 综合高效液相色谱、 。
42、1H-NMR 和13C-NMR 图谱显示， 纯度 98。并经结构鉴定试验证明其结 构为 ： 0073 0074 分子式为 ： C20H25N3O。 0075 产品数据 ： max ： 535nm ； 1H-NMR(CDCl 3， 500MHz， ppm)0.90(t， 3H， H-19)， 1.26(m， 2H， H-18)， 1.31(m， 2H， H-17)， 1.53(m， 2H， H-16)， 2.39(t， 2H， H-15)， 2.56(s， 3H， H-14)， 3.97(s， 3H， H-20)， 6.05(s， 1H， H-6)， 6.29(m， 1H， H-2)， 6.56。
43、(d， 1H， H-11)， 6.89(d， 1H， H-3)， 7.07(brs， 1H， H-9)， 7.26(m， 1H， H-1)， 12.58(brs， 1H， H-21)， 12.76(brs， 1H， H-22).13C-NMR(CDCl3， 125MHz， ppm)11.85(C-14)， 14.01(C-19)， 22.48(C-18)， 25.40(C-15)， 29.96(C-16)， 31.49(C-17)， 58.54(C-20)， 93.68(C-6)， 111.13(C-2)， 115.87(C-9)， 117.47(C-3)， 119.56(C-8)， 122.。
44、46(C-4)， 125.77(C-10)， 127.61(C-1)， 128.96(C-11)， 129.53(C-12)， 147.02(C-13)， 147.53(C-5)， 166.56(C-7).FT-IR(KBr) ： 3445， 2956， 2924， 2854， 1625， 1544， 1461， 1376， 1260， 1134， 1060， 985， 726cm-1。GC-MS ： m/z 323.2， TOF MS-ES+ ： m/z 324.2。 0076 此产品的理化特性、 分子量、 1H-NMR、13C-NMR、 FT-IR、 GC-MS， TOF MS-ES+ 等。
45、数据与 灵菌红素一致， 即经过理化性质及结构的鉴定试验可知此制备方法所得的高纯品是高纯度 的灵菌红素。 说 明 书 CN 102311981 A CN 102311983 A8/8 页 10 0077 上述实例只为说明本发明的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102311981 A CN 102311983 A1/6 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102311981 A CN 102311983 A2/6 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102311981 A CN 102311983 A3/6 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 102311981 A CN 102311983 A4/6 页 14 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102311981 A CN 102311983 A5/6 页 15 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102311981 A CN 102311983 A6/6 页 16 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102311981 A 。