一种表达有机磷水解酶的重组菌株、复合酶制备工艺、复合酶制剂及果蔬洗涤剂.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102199550 A (43)申请公布日 2011.09.28 CN 102199550 A *CN102199550A* (21)申请号 201110071973.0 (22)申请日 2011.03.24 C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/60(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 9/16(2006.01) C12N 9/36(2006.01) C12N 9/。

2、88(2006.01) C11D 7/42(2006.01) C11D 3/386(2006.01) (71)申请人 深圳西德赛科技有限公司 地址 518000 广东省深圳市南山区南海大道 东华园工业厂房五栋七楼 708 号 (72)发明人 郭永超 刘牧龙 王艳平 (74)专利代理机构 深圳市顺天达专利商标代理 有限公司 44217 代理人 易钊 (54) 发明名称 一种表达有机磷水解酶的重组菌株、 复合酶 制备工艺、 复合酶制剂及果蔬洗涤剂 (57) 摘要 本发明涉及一种表达有机磷水解酶的重组菌 株、 复合酶制备工艺、 复合酶制剂及果蔬洗涤剂， 其中重组菌株内含有可控裂解酶基因， 复合酶制 。

3、备工艺包括步骤 ： 对表达有机磷水解酶的重组菌 株进行培养， 加入适当的启动条件诱导表达裂解 酶 ； 用获得的培养液制备复合酶制剂。本发明通 过对所获得的重组有机磷水解酶表达菌株进行培 养， 诱导表达裂解酶裂解细胞， 避免了复杂的机 械和化学裂解方法可能产生的对表达酶活性的影 响， 便于实现工业化廉价生产。基于该工艺生产 的复合酶制剂同时含有有机磷水解酶和细胞裂解 酶， 具有农药降解和杀菌的双重功能， 可用于开发 新型蔬菜水果洗涤剂。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 CN 102199554 。

4、A1/1 页 2 1. 一种表达有机磷水解酶的重组菌株， 其特征在于， 所述重组菌株内还含有可控裂解 酶基因。 2. 根据权利要求 1 所述的重组菌株， 其特征在于， 所述裂解酶为噬菌体裂解酶或溶菌 酶。 3. 根据权利要求 1 所述的重组菌株， 其特征在于， 采用下述方法获得所述重组菌株 ： 将有机磷水解酶表达质粒转化到可控裂解的宿主菌 ； 或者， 将含有有机磷水解酶基因和可控裂解酶基因双顺反子的表达质粒转化宿主菌 ； 或者， 将有机磷水解酶表达质粒和可控裂解酶表达质粒共转化宿主菌。 4. 根据权利要求 3 所述的重组菌株， 其特征在于， 所述宿主菌为细菌或真菌， 所述细菌 至少包括大肠杆菌。

5、， 所述真菌至少包括酵母菌。 5. 一种应用如权利要求 1-4 中任一项所述的重组菌株的复合酶制备工艺， 其特征在 于， 包括以下步骤 ： A、 对表达有机磷水解酶的重组菌株进行培养， 加入适当的启动条件诱导表达裂解酶 ； B、 将所述培养液离心直接取上清， 获得复合酶溶液 ； 或者， 将所述培养液离心收集细胞后用缓冲液重悬， 再经冻融后离心取上清， 获得复合 酶溶液 ； 或者， 将所述培养液离心收集细胞后用裂解缓冲液重悬处理， 再经离心取上清， 获得复 合酶溶液。 6. 根据权利要求 5 所述的复合酶制备工艺， 其特征在于， 所述步骤 A 中， 所述适当的启 动条件是指 ： 升高温度至 37。

6、 45处理 1 6 小时， 或加入诱导试剂处理 1 6 小时 ； 所述诱导试剂为阿拉伯糖或异丙基硫代半乳糖苷。 7. 一种采用如权利要求 5 6 中任一项所述的复合酶工艺制备的复合酶制剂， 其特征 在于， 包括有机磷水解酶和细胞裂解酶。 8. 根据权利要求 7 所述的复合酶制剂， 其特征在于， 还包括阴离子表面活性剂、 甘氨 酸、 碳酸氢钠、 Tris 碱、 乙二胺四乙酸、 氯化钠和羧甲基纤维素中的一种或者多种组合 ； 所述复合酶制剂以冻干粉、 泡腾片或液体形式包装。 9. 根据权利要求 7 所述的复合酶制剂， 其特征在于， 所述有机磷水解酶占复合酶制剂 总重量的百分比为 0.00001 80。

7、， 所述细胞裂解酶占复合酶制剂总重量的百分比为 0.00001 80。 10. 一种果蔬洗涤剂， 其特征在于， 包括权利要求 7-9 中任一项所述的复合酶制剂。 权 利 要 求 书 CN 102199550 A CN 102199554 A1/9 页 3 一种表达有机磷水解酶的重组菌株、 复合酶制备工艺、 复合 酶制剂及果蔬洗涤剂 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 更具体地说， 涉及一种表达有机磷水解酶的重组菌株、 复合酶制备工艺、 复合酶制剂及果蔬洗涤剂。 背景技术 0002 农药是农业生产中必须的生产资料， 全世界的化学农药品种大约为 14000 多种， 年产量以以原料药计达 。

8、300 万吨。我国是高毒农药的生产大国， 其中有机磷农药的使用占 整个农药的 57， 农药的残留会造成环境和食品的严重污染， 而且污染面广， 持续时间长， 严重影响了人们的身体健康及农产品的出口创汇， 引起越来越多社会的广泛关注。 0003 如何有效地处理农药残留问题， 确保果蔬农药残留符合食品卫生标准， 涉及每位 公民的生命健康。果蔬农药残留治理技术是食品安全生产的关键配套技术， 目前主要的方 法有清水洗涤浸泡或洗涤剂清洗。 但是一般农药都是脂溶性， 在水中的溶解度很小， 因此清 水洗涤一般不能得到满意的洗涤效果。而一般的化学洗涤剂虽然可以一定程度上减少农 药残留， 但是会带来二次污染， 同。

9、时会对果蔬的营养成分造成一定程度的破坏， 因此开发高 效、 经济、 安全的农药残留处理方法已经成为亟待解决的具有重要经济和社会意义的研究 方向。 0004 生物降解酶是一种水解酶， 极易溶于水， 这种生物酶是源于土壤中的一些微生物， 如细菌、 真菌和放线菌等所产生出的一种酶， 它能特异性地水解有机 磷农药分子上的磷酸 酯键， 将有机磷农药分解， 分解后的有机磷农药已经不是磷酸酯类化合物， 从而完全消除了 农药的毒性。 因为酶本身就是蛋白质， 被广泛应用于食品添加剂和酿酒等， 不会像化学合成 洗涤剂那样如使用不当还会造成对人体有害的二次污染。生物降解酶法不但高效而且很 安全， 无毒无副作用， 对。

10、果蔬的口味和营养价值也没有丝毫的影响， 可以直接适用于各种水 果、 蔬菜、 茶叶、 谷物、 豆类、 蛋奶和肉类。 0005 目前， 科学家已将多种来自于微生物的农药降解酶分离、 纯化， 并对其进行深入的 生理和生化研究， 现正致力于净化农药残留污染的实际运用和工业化生产的研究和开发。 但由于农药降解酶在天然原始酶珠中的含量太低， 很难实现工业化廉价生产。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题在于， 针对现有有机磷水解酶工艺的不足， 提供一种表 达有机磷水解酶的重组菌株、 复合酶制备工艺、 复合酶制剂及果蔬洗涤剂。 0007 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ： 0008 构造一种表。

11、达有机磷水解酶的重组菌株， 其中， 所述重组菌株内还含有可控裂解 酶基因。 0009 本发明所述的重组菌株， 其中， 所述裂解酶为噬菌体裂解酶或溶菌酶。 0010 本发明所述的重组菌株， 其中， 采用下述方法获得所述重组菌株 ： 说 明 书 CN 102199550 A CN 102199554 A2/9 页 4 0011 将有机磷水解酶表达质粒转化到可控裂解的宿主菌 ； 0012 或者， 将含有有机磷水解酶基因和可控裂解酶基因双顺反子的表达质粒转化宿主 菌 ； 0013 或者， 将有机磷水解酶表达质粒和可控裂解酶表达质粒共转化宿主菌。 0014 本发明所述的重组菌株， 其中， 所述宿主菌为细。

12、菌或真菌， 所述细菌至少包括大肠 杆菌， 所述真菌至少包括酵母菌。 0015 本发明还提供了一种应用前述任一项所述的重组菌株的复合酶制备工艺， 包括以 下步骤 ： 0016 A、 对表达有机磷水解酶的重组菌株进行培养， 加入适当的启动条件诱导表达裂解 酶 ； 0017 B、 将所述培养液离心直接取上清， 获得复合酶溶液 ； 0018 或者， 将所述培养液离心收集细胞后用缓冲液重悬， 再经冻融后离心取上清， 获得 复合酶溶液 ； 0019 或者， 将所述培养液离心收集细胞后用裂解缓冲液重悬处理， 再经离心取上清， 获 得复合酶溶液。 0020 本发明所述的复合酶制备工艺， 其中， 所述步骤 A 。

13、中， 所述适当的启动条件是指 ： 0021 升高温度至 37 45处理 1 6 小时， 或加入诱导试剂处理 1 6 小时 ； 0022 所述诱导试剂为阿拉伯糖或异丙基硫代半乳糖苷。 0023 本发明还提供了一种采用前述复合酶制备工艺制备的复合酶制剂， 其中， 包括有 机磷水解酶和细胞裂解酶。 0024 本发明所述的复合酶制剂， 其中， 还包括阴离子表面活性剂、 甘氨酸、 碳酸氢钠、 Tris 碱、 乙二胺四乙酸、 氯化钠和羧甲基纤维素中的一种或者多种组合 ； 0025 所述复合酶制剂以冻干粉、 泡腾片或液体形式包装。 0026 本发明所述的复合酶制剂， 其中， 所述有机磷水解酶占复合酶制剂总重。

14、量 的百 分比为 0.00001 80， 所述细胞裂解酶占复合酶制剂总重量的百分比为 0.00001 80。 0027 本发明还提供了一种果蔬洗涤剂， 其中， 包括前述任一项所述的复合酶制剂。 0028 本发明的有益效果在于 ： 通过对所获得的重组有机磷水解酶表达菌株进行培养， 诱导表达裂解酶裂解， 该工艺操作简单， 避免了复杂的机械和化学裂解方法可能产生的对 表达酶活性的影响， 同时降低了生产成本， 便于实现工业化廉价生产。 同时基于该工艺生产 的复合酶制剂含有有机磷水解酶和细胞裂解酶， 具有农药降解和杀菌的双重功能， 可用于 开发新型蔬菜水果洗涤剂。 附图说明 0029 下面将结合附图及实。

15、施例对本发明作进一步说明， 附图中 ： 0030 图 1 是本发明实施例 5 的阿拉伯糖诱导不同时间培养液的 OD600结果 ； 0031 图 2 是本发明实施例 5 的阿拉伯糖诱导不同时间上清测量酶活所占的比率。 具体实施方式 说 明 书 CN 102199550 A CN 102199554 A3/9 页 5 0032 本发明较佳实施例的表达有机磷水解酶的重组菌株内含有可控裂解酶基因。 采用 下述方法获得该重组菌株 ： 将有机磷水解酶表达质粒转化到可控裂解的宿主菌 ； 或者， 将 含有有机磷水解酶基因和可控裂解酶基因双顺反子的表达质粒转化宿主菌 ； 或者， 将有机 磷水解酶表达质粒和可控裂。

16、解酶表达质粒共转化宿主菌。其中， 宿主菌为细菌或真菌， 细 菌至少包括大肠杆菌， 真菌至少包括酵母菌。裂解酶包含噬菌体裂解酶 ( 肽聚糖水解酶， peptidoglycan hydrolase) 或溶菌酶 (lysozyme)， 优选为 噬菌体裂解酶。 0033 采用上述重组菌株可制得用于果蔬洗涤的复合酶制剂， 具体工艺如下 ： 1)、 对表达 有机磷水解酶的重组菌株进行培养， 加入适当的启动条件诱导表达裂解酶 ； 2)、 将所述培养 液离心直接取上清， 获得复合酶溶液 ； 或者， 将所述培养液离心收集细胞后用缓冲液重悬， 再经冻融后离心取上清， 获得复合酶溶液 ； 或者， 将所述培养液离心收。

17、集细胞后用裂解缓冲 液重悬处理， 再经离心取上清， 获得复合酶溶液。其中， 适当的启动条件是指 ： 升高温度至 37-45处理 1 6 小时， 或加入诱导试剂处理 1 6 小时， 诱导试剂为阿拉伯糖或异丙基 硫代半乳糖苷(IPTG)。 这样可避免复杂的机械和化学裂解方法可能产生的对表达酶活性的 影响， 同时降低了生产成本， 便于实现工业化廉价生产。 同时基于该工艺生产的复合酶制剂 含有有机磷水解酶和细胞裂解酶， 具有农药降解和杀菌的双重功能， 可用于开发新型蔬菜 水果洗涤剂。 0034 本发明各实施例中， 所采用的 pET15、 pET22、 pET28、 pEAS、 内切酶 ( 限制性酶 )。

18、 BamHI、 Bg1II、 NcoI、 NdeI、 SacI、 XbaI 和 XhoI、 宿主菌、 阿拉伯糖、 异丙基硫代半乳糖 苷 (IPTG) 等物质均为市购。其中， 宿主菌为细菌或真菌， 细菌至少包括大肠杆菌， 真菌 至少包括酵母菌。大肠杆菌包括市购的 BL21、 BL21(DE3)、 BL21XJb(DE3)(AutolysisTM)、 BL21NTC4828、 AD494、 XL1-Blue 及其它大肠杆菌。 0035 在本发明的另一实施例中， 还提供了一种采用上述工艺制备的复合酶制剂， 包括 有机磷水解酶和细胞裂解酶， 例如溶菌酶。 该复合酶制剂不仅能有效降解有机磷农药残留， 还。

19、能有效杀菌。其中， 有机磷水解酶占复合酶制剂总重量的百分比为 0.00001 80， 优 选为 0.1 10； 细胞裂解酶占复合酶制剂总重量的百分比为 0.00001 80， 优选为 0.1 10。 0036 在进一步的实施例中， 上述复合酶制剂还包括阴离子表面活性剂、 甘氨酸、 碳酸氢 钠、 Tris 碱、 乙二胺四乙酸 (EDTA)、 氯化钠和羧甲基纤维素中的一种或者多种组合。其中 阴离子表面活性剂包含 TritonX100、 直链烷基苯磺酸钠或十二烷基硫酸钠， 其重量份配比 为 0.01 10， 优选为 1 5 ； 甘氨酸重量份配比为 0.1 5， 优选为 0.5 1 ； 碳酸氢钠重量份。

20、配比为 5 -50， 优选为 10 30； 羧甲基纤维素重量份配比为 0.1 1， 优选为 0.4 0.6 ； Tris 碱重量份配比为 0.1 10， 优选为 6 ； EDTA 重量份配 比为 0.05 5， 优选为 4 ； 氯化钠重量份配比为 0.1 10， 优选为 6。 0037 上述实施例中的复合酶制剂以冻干粉、 泡腾片、 泡沫喷雾剂或者是其它液体形式 包装。 0038 下面通过多个具体的实施例对本发明的复合酶制备工艺及所制备的复合酶制剂 进行详述。 0039 实施例 1 0040 本发明较佳实施例的复合酶制备工艺包括以下步骤 ： a)、 构建重组有机磷水解酶 说 明 书 CN 102。

21、199550 A CN 102199554 A4/9 页 6 pET28-OPH， 即应用基因重组技术将有机磷水解酶基因克隆至 pET28 载体， 构建表达质粒 pET28-OPH， 该质粒带有 T7 启动子， 可在 IPTG 的诱导下表达重组有机磷水解酶蛋白 ； b)、 制 备可控裂解的重组有机磷水解酶表达菌株 ； c)、 对所获得的重组有机磷水解酶表达菌株进 行工程发酵培养， 诱导pET28-OPH表达裂解酶 ； d)、 将步骤c)中获得的发酵液制备复合酶制 剂。这样， 通过对所获得的重组有机磷水解酶表达菌株进行工程发酵培养， 诱导 pET28-OPH 表达裂解酶裂解细胞， 避免了复杂的机。

22、械和化学裂解方法可能产生的对表达酶活性的影 响， 便于实现工业化廉价生产。 0041 进一步地， 上述工艺步骤 a) 具体包括以下步骤 ： 0042 a1)、 PCR 扩增有机磷水解酶 OPH 基因 ； 0043 根据有机磷水解酶的编码序列， 设计特异性寡核苷酸引物， 序列为 0044 P1 5-AAACCCCCATGGATGAGCATTGGAACCGGCGATCGTA-3， 0045 P2 5-CCCAAACTCGAGGCTTGCCCGAAGAGTCGGGCTCAGA-3， 0046 其两端含有 NcoI 和 XhoI 酶切位点。 0047 a2)、 采用内切酶 ( 限制性酶 )NcoI 和。

23、 XhoI 对 pET28 载体进行双酶切， 与同样酶切 的 OPH 扩增产物进行连接 ； 0048 进一步地， 上述工艺步骤 b) 包括 ： 将连接产物 pET28-OPH 转化受阿拉伯糖敏感启 动子 (pBAD promoter) 调控的自裂解宿主菌 BL21 XJb(DE3)(AutolysisTM)， 在 50mg/L 卡那 霉素平板上筛选阳性克隆。 0049 进一步地， 上述工艺步骤 c) 包括以下步骤 ： 0050 c1)、 菌种筛选 ： 包括试管培养 - 小试表达 - 扩增培养 - 生产用菌， 具体为， 选取克隆于5ml的LB液体培养基(蛋白胨10g+酵母粉5g+NaCL10g补。

24、水至1000ml， 用NaOH 或 HCL 将 PH 调至 7.2-7.4) 中的重组有机磷水解酶表达菌株， 加入 1mM 诱导剂 ( 例如异丙 基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷， IPTG) 于 28诱导 16 24 小时， 再加入 3mM 阿拉伯糖诱导 14小时， 使得培养液逐渐变清， 将培养液在6000rpm条件下离心515分钟， 收集细胞， 用 50mMTris-HCL 缓冲液 (pH 8.0) 重悬， 放置 -20冷冻半小时后转移至室温冻融半小时， 随后6000rpm条件下离心10分钟， 收集上清液 ； 采用1mM甲基对硫磷进行酶活测量， 测量溶 液为50mMTris-HCL缓冲液(pH。

25、 8.0)， 反应产物405nm测吸收值。 取活性较高克隆的扩增培 养菌种作为生产用菌， 分装冻存。 0051 c2)、 种子液培养 ： 取冻存菌种 LB 平皿划线， 37培养 16 24 小时， 挑 单菌落接 种于液体 LB 培养基中， 于 37、 150-200rpm 的摇床中培养 10 15 小时 ； 0052 c3)、 发酵罐培养 ： 发酵罐首先 121灭菌 30 分钟， 然后将步骤 c2 中获得的种子液 5接入， 通过转速和通气量来控制溶氧值， 当罐内吸光度值 (OD 值 ) 达到 3 时， 加入诱导剂 进行诱导 16 24 小时， 随后加入适当的启动条件诱导宿主菌表达裂解酶 ； 其。

26、中， 适当的启 动条件是指加入 3mM 阿拉伯糖处理 2 4 小时。 0053 进一步地， 在上述工艺步骤 d) 中， 将步骤 c3) 中获得的发酵培养液在 6000rpm 条 件下离心525分钟， 收集细胞， 用50mMTris-HCL(pH 8.0)缓冲液重悬， 放置-20冷冻半 小时后转移至室温冻融半小时， 随后 6000rpm 条件下离心 10 分钟， 将上清冷冻干燥加入阴 离子表面活性剂、 甘氨酸、 碳酸氢钠、 Tris 碱、 乙二胺四乙酸 (EDTA)、 氯化钠和羧甲基纤维 素中的一种或者多种组合， 分装制成含有有机磷水解酶和细胞裂解酶的干粉复合酶制剂。 说 明 书 CN 1021。

27、99550 A CN 102199554 A5/9 页 7 其中阴离子表面活性剂包含 TritonX100、 直链烷基苯磺酸钠或十二烷基硫酸钠， 其重量份 配比为 0.01 10， 优选为 1 5 ； 甘氨酸重量份配比为 0.1 5， 优选为 0.5 1 ； 碳酸氢钠重量份配比为 5 -50， 优选为 10 30 ； 羧甲基纤维素重量份配比为 0.1 1， 优选为 0.4 0.6 ； Tris 碱重量份配比为 0.1 10， 优选为 6 ； EDTA 重量份配比为 0.05 5， 优选为 4； 氯化钠重量份配比为 0.1 10， 优选为 6。 0054 实施例 2 0055 先采用PCR扩增有。

28、机磷水解酶OPH基因， 再根据有机磷水解酶的编码序列， 设计特 异性寡核苷酸引物， 序列为 P3 5-AAACCCCATATGATGAGCATTGGAACCGGCGATCGTA-3， P45-CCCA AAGGATCCGCTTGCCCGAAGAGTCGGGCTCAGA-3， 采用内切酶 ( 限制性酶 )NdeI 和 BamHI 对 pET15 载体进行双酶切， 与同样酶切的 OPH 扩增产物进行连接 ； 将连接产物转化温度敏感自裂解 宿主菌 BL21 NTC4828， 在 100mg/L 氨苄青霉素平板上筛选阳性克隆。 0056 挑单菌落接种于液体 LB 培养基中， 于 30、 150-200。

29、rpm 的摇床中培养 10 15 小 时 ； 将发酵罐 121灭菌 30 分钟， 然后将获得的种子液 5接入， 通过转速和通气量来控制 溶氧值， 当罐内 OD 值达到 3 时， 加入 IPTG 进行诱导 16 小时， 随后发酵罐温度提高至 42 处理 3 小时诱导大肠杆菌表达裂解酶。最后， 将获得的发酵培养液在 6000rpm 条件下离 心 5 分钟， 收集细胞， 用裂解缓冲液 (50mM Tris-Cl， 10mM EDTA， 100mM NaCl， 0.5 (v/v) TritonX-100， pH8.0) 重悬， 放置半小时后 6000rpm 条件下离心 10 分钟， 将上清冷冻干燥加 。

30、入阴离子表面活性剂、 甘氨酸、 碳酸氢钠和羧甲基纤维素中的一种或者多种组合， 分装制成 含有有机磷水解酶和细胞裂解酶的干粉复合酶制剂。 0057 实施例 3 0058 一 .pET28-OPH 的构建 0059 首先根据有机磷水解酶的编码序列， 设计特异性寡核苷酸引物， 两端含有 NcoI 和 XhoI 酶切位点， PCR 扩增 OPH 基因。引物序列如下 ： 0060 P1 5-AAACCCCCATGGATGAGCATTGGAACCGGCGATCGTA-3 0061 P2 5-CCCAAACTCGAGGCTTGCCCGAAGAGTCGGGCTCAGA-3， 0062 用限制性酶对pET28载。

31、体进行双酶切， 与同样酶切的OPH扩增产物进行连接， 连接 产物转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 在 50mg/L 卡那霉素平板上筛选阳 性克隆。 0063 二 .pET22-SR 的构建 0064 1. 合成阿拉伯糖 pBAD 启动子 0065 根据阿拉伯糖 pBAD 启动子的核苷酸序列人工合成 pBAD 启动子， 并在其两端分别 添加 Bg1II 和 NcoI 酶切位点。序列构成如下所示 ： 0066 0067 2.PCR 扩增 噬菌体裂解酶基因 0068 根据 噬菌体裂解酶基因 SR 序列设计特异性引物， 两端分别添加 NcoI 和 XhoI 酶切位点。引物序列如下 ： 说 明 书 C。

32、N 102199550 A CN 102199554 A6/9 页 8 0069 P5 5-AAACCCCCATGGGCCACTGTCTGTCCTGAATTC-3 0070 P6 5-AAACCCCTCGAGTAGGCATTTATACTCCGCTGGA-3， 0071 提取 噬菌体的基因组 DNA， 并以此为模板， 扩增 SR 基因。 0072 3. 表达载体构建 0073 将载体 pET22 用限制性内切酶 Bg1II 和 XhoI 进行双酶切， 对 PCR 扩增的 SR 基因 用 NcoI 和 XhoI 进行双酶切， 将两种双酶切产物与合成的阿拉伯糖 pBAD 启动子连接， 连接 产物转化。

33、大肠杆菌 BL21(DE3)， 在 100mg/L 氨苄青霉素平板上筛选阳性克隆。 0074 三 . 双质粒共转化大肠杆菌 0075 提取 pET28-OPH 和 pET22-SR 质粒， 取等摩尔转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 在含有 50mg/L 卡那霉素及 100mg/L 氨苄青霉素的平板上筛选阳性克隆。 0076 挑单菌落接种于液体 LB 培养基中， 于 37、 150-200rpm 的摇床中培养 10 15 小时 ； 将发酵罐 121灭菌 30 分钟， 然后将获得的种子液 5接入， 通过转速和通气量来控 制溶氧值， 当罐内 OD 值达到 3 时， 加入 IPTG 进行诱导 16 。

34、小时， 随后加入 3mM 阿拉伯糖处 理 2 4 小时诱导大肠杆菌表达裂解酶。最后， 将获得的发酵培养液在 6000r pm 条件下离 心 5 分钟， 收集细胞， 用裂解缓冲液 (50mM Tris-Cl， 10mM EDTA， 100mM NaCl， 0.5 (v/v) TritonX-100， pH8.0) 重悬， 放置半小时后 6000rpm 条件下离心 10 分钟， 将上清冷冻干燥加 入阴离子表面活性剂、 甘氨酸、 碳酸氢钠和羧甲基纤维素中的一种或者多种组合， 分装制成 含有有机磷水解酶和细胞裂解酶的干粉复合酶制剂。 0077 实施例 4 0078 先采用PCR扩增有机磷水解酶OPH基。

35、因， 再根据有机磷水解酶的编码序列， 设计特 异性寡核苷酸引物， 序列为 P75-AAACCCGAGCTCAATGAGCATTGGAACCGGCGATCGTA-3， P85-CCCAA ATCTAGATTAGCTTGCCCGAAGAGTCGGGCTCAGA-3， 0079 采用内切酶(限制性酶)SacI和XbaI对pEAS载体进行双酶切， 与同样酶切的OPH 扩增产物进行连接 ； 将连接产物转化宿主菌 XL1-Blue， 在 100mg/L 氨苄青霉素平板上筛选 阳性克隆。 0080 挑单菌落接种于液体 LB 培养基中， 于 30、 150-200rpm 的摇床中培养 10 15 小 时 ； 。

36、将发酵罐 121灭菌 30 分钟， 然后将获得的种子液 5接入， 通过转速和通气量来控制 溶氧值， 当罐内OD值达到3时， 加入IPTG进行诱导16小时， 随后发酵罐温度提高至43处 理 3 小时诱导大肠杆菌表达裂解酶裂解细胞。 0081 最后， 将获得的发酵培养液在 6000rpm 条件下离心 5 分钟， 将上清冷冻 干燥加入 阴离子表面活性剂、 甘氨酸、 碳酸氢钠、 Tris 碱、 乙二胺四乙酸 (EDTA)、 氯化钠和羧甲基纤 维素中的一种或者多种组合， 分装制成含有有机磷水解酶和细胞裂解酶的干粉复合酶制 剂。 0082 实施例 5 0083 先采用PCR扩增有机磷水解酶OPH基因， 再。

37、根据有机磷水解酶的编码序列， 设计特 异性寡核苷酸引物， 序列为 P75-AAACCCGAGCTCAATGAGCATTGGAACCGGCGATCGTA-3， P85-CCCAA ATCTAGATTAGCTTGCCCGAAGAGTCGGGCTCAGA-3， 0084 采用内切酶(限制性酶)SacI和XbaI对pEAS载体进行双酶切， 与同样酶切的OPH 扩增产物进行连接 ； 将连接产物转化宿主菌 BL21， 在 100mg/L 氨苄青霉素平板上筛选阳性 说 明 书 CN 102199550 A CN 102199554 A7/9 页 9 克隆。 0085 选取克隆于 5ml 的 LB 液体培养基。

38、 ( 蛋白胨 10g+ 酵母粉 5g+NaCL10g 补水至 1000ml， 用 NaOH 或 HCL 将 PH 调至 7.2 7.4) 中的重组有机磷水解酶表达菌株， 加入 1mM 异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷 IPTG 于 28诱导 16 小时， 随后发酵罐温度提高至 42 处理 4 小时， 使得培养液逐渐变清， 如图 1 所示 ； 0086 将培养液在6000rpm条件下离心5分钟， 收集上清液 ； 采用1mM甲基对硫磷进行酶 活测量， 测量溶液为 50mMTris-HCL 缓冲液 (pH 8.0)， 反应产物 405nm 测吸收值。诱导 1 小 时、 2 小时及 4 小时上清的酶活。

39、逐渐提高， 如图 2 所示。 0087 上述实施例1至实施例5中， 分别描述了五种不同的处理工艺， 采用上述实施例中 的工艺， 可制备得到同时含有有机磷水解酶和细胞裂解酶， 或者还包括其他成分的复合酶 制剂。其中复合酶制剂的组分含量如下表 1 所示。 0088 表 1 复合酶制剂组分含量 ( 重量百分比 ) 0089 说 明 书 CN 102199550 A CN 102199554 A8/9 页 10 0090 由于篇幅所限， 除上述表1中列举的16组实验组之外的其他组分比例的复合酶制 剂， 只要所含各成分在前述的范围内， 即可认为是在本申请的保护范围内， 在此不再详述。 0091 在本发明。

40、的另一实施例中， 还提供了一种果蔬洗涤剂， 其中包括有前面任一实施 例所描述的复合酶制剂， 还可包括其他辅助成分。经大量试验证明， 采用该果蔬洗涤剂， 能 有效去除蔬菜水果上的残余农药及细菌。 0092 需要说明的是， 上述实施例中， 有机磷水解酶 (organophosphorusHydrolase， 说 明 书 CN 102199550 A CN 102199554 A9/9 页 11 OPH) 还可以采用甲基对硫磷水解酶 (methyl parathion hydrolase， MPH) 或有机磷酸酐酶 (Organophosphorous Acid Anhydrase， OPAA)代替。

41、， 同样可以达到上述各组实验的效果。 因 此， 采用甲基对硫磷水解酶或有机磷酸酐酶替代完成上述各试验， 应当理解为在本申请保 护范围内。 0093 综上所述， 本发明通过对所获得的重组有机磷水解酶表达菌株进行工程发酵培 养， 诱导表达裂解酶裂解细胞， 该工艺操作简单， 避免了复杂的机械和化学裂解方法可能产 生的对表达酶活性的影响， 同时降低了生产成本， 便于实现工业化廉价生产。 同时基于该工 艺生产的复合酶制剂含有有机磷水解酶和细胞裂解酶， 具有农药降解和杀菌的双重功能， 可用于开发新型蔬菜水果洗涤剂。 0094 应当理解的是， 对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 说 明 书 CN 102199550 A CN 102199554 A1/1 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102199550 A 。