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1、(10)申请公布号 CN 103541259 A (43)申请公布日 2014.01.29 CN 103541259 A (21)申请号 201310491157.4 (22)申请日 2013.10.19 CGMCC NO ： 6225 2012.06.15 CGMCC NO ： 5466 2011.11.17 CGMCC NO ： 6226 2012.06.15 CCTCC NO ： M 2010004 2010.01.11 D21C 5/00(2006.01) (71)申请人 沅江浣溪沙酶技术有限公司 地址 413111 湖南省益阳市黄茅洲镇银苑新 村 (72)发明人 李忠兴 杨忠义 (7。
2、4)专利代理机构 益阳市银城专利事务所 43107 代理人 舒斌 (54) 发明名称 芦苇、 狄苇造纸制浆用复合酶液的生产方法 及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种芦苇、 狄苇造纸制浆用复 合酶液的生产方法， 其特征是将各组份酶经称量、 复配罐混合配制、 防腐、 检验、 包装后存放于 5 库房中， 所述各组份酶为碱性果胶酶、 木聚糖酶和 甘露聚糖酶或者碱性果胶酶、 木聚糖酶、 甘露聚 糖酶和木质素酶 ； 其在芦苇、 狄苇造纸制浆中的 应用为造纸原料经预处理后送入蒸煮锅进行酶处 理， 即将原料用复合酶液浸泡， 酶处理条件为 ： 温 度 40 60， 绝干原料与复合酶液的质量比为 100:1.。
3、2 1.8， 浸酶时间 20 分钟 60 分钟 ； 酶 处理后在蒸煮锅中蒸煮， 本发明各组分酶的活力 高， 且复合酶液中各组份酶对结晶纤维素、 羧甲基 纤维素均没有活性 ； 与传统化学制浆法比较， 用 碱量降低50左右， 废水中COD含量降低30以 上， 生产成本降低 20 左右， 且提高了纸的产品 品质。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 (10)申请公布号 CN 103541259 A CN 103541259 A 1/1 页 2 1. 一种芦苇、 狄苇造。
4、纸制浆用复合酶液的生产方法， 其特征是将各组份酶经称量、 复配 罐混合配制、 防腐、 检验、 包装后存放于 5库房中， 所述各组份酶为碱性果胶酶、 木聚糖酶 和甘露聚糖酶 ； 所述碱性果胶酶为 CCTCC NO ： M 2010004 菌种经菌种培养、 摇瓶发酵， 种子 罐到发酵罐、 过滤、 除菌、 防腐处理后制备 ； 所述木聚糖酶为 CGMCC NO ： 5466 菌种经菌种培 养、 摇瓶发酵， 种子罐到发酵罐、 过滤、 除菌、 防腐处理后制备 ； 所述甘露聚糖酶为CGMCC NO ： 6226 菌种经菌种培养、 摇瓶发酵， 种子罐到发酵罐、 过滤、 除菌、 防腐处理后制备 ； 所述复合 酶。
5、液中碱性果胶酶的活力为 800u/ml 1200u/ml， 木聚糖酶的活力为 1200u/ml 1500u/ ml， 甘露聚糖酶的活力为 2000u/ml 3000u/ml。 2. 根据权利要求 1 所述芦苇、 狄苇造纸制浆用复合酶液的生产方法， 其特征是所述各 组份酶为碱性果胶酶、 木聚糖酶、 甘露聚糖酶和木质素酶 ； 所述木质素酶为 CGMCC NO ： 6225 菌种经菌种培养、 摇瓶发酵， 种子罐到发酵罐、 过滤、 除菌、 防腐处理后制备 ； 所述复合酶液 中碱性果胶酶的活力为 800u/ml 1200u/ml， 木聚糖酶的活力为 1200u/ml 1500u/ml， 甘 露聚糖酶的活。
6、力为 2000u/ml 3000u/ml， 木质素酶的活力为 80u/ml 100u/ml。 3. 一种如权利要求 1 所述复合酶液在芦苇、 狄苇造纸制浆中的应用， 其特征是造纸 原料经预处理后送入蒸煮锅进行酶处理， 即将原料用复合酶液浸泡， 酶处理条件为 ： pH 值 7.09.5， 温度4060， 绝干原料与复合酶液的质量比为100:1.21.8， 绝干原料与 水的质量比为 1:8 12， 浸酶时间 20 分钟 60 分钟 ； 酶处理后在蒸煮锅中蒸煮， 蒸煮条件 为 ： NaOH 用量为绝干原料质量的 7 11 ， 温度 120 150， 时间 70 分钟 120 分 钟。 4. 一种如权。
7、利要求 2 所述复合酶液在芦苇、 狄苇造纸制浆中的应用， 其特征是造纸 原料经预处理后送入蒸煮锅进行酶处理， 即将原料用复合酶液浸泡， 酶处理条件为 ： pH 值 7.09.5， 温度4060， 绝干原料与复合酶液的质量比为100:1.21.8， 绝干原料与 水的质量比为 1:8 12， 浸酶时间 20 分钟 60 分钟 ； 酶处理后在蒸煮锅中蒸煮， 蒸煮条件 为 ： NaOH 用量为绝干原料质量的 7 11 ， 温度 120 150， 时间 70 分钟 120 分 钟。 5.根据权利要求3或4所述复合酶液在芦苇、 狄苇造纸制浆中的应用， 其特征是酶处理 条件优选为 ： pH值8.09.0， 。
8、温度5055， 绝干原料与复合酶液的质量比为100:1.5， 绝干原料与水的质量比为 1:8 10， 浸酶时间 40 分钟 50 分钟。 权 利 要 求 书 CN 103541259 A 2 1/9 页 3 芦苇、 狄苇造纸制浆用复合酶液的生产方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及一种造纸制浆， 具体地说是一种芦苇、 狄苇造纸制浆， 特别是涉及一种 芦苇、 狄苇造纸制浆用复合酶液的生产方法及应用。 背景技术 0002 随着社会的发展和人民生活水平的提高， 我国纸和纸制品的消费在高速增长， 已 成为世界第二大纸和纸制品的消费市场。国际上造纸原料 94 为木材， 由于我国森林资源 匮乏， 木浆。
9、主要依赖进口。 我国湖区芦苇、 狄苇资源丰富， 它也是我国重要的造纸原料之一。 但是， 传统的芦苇、 狄苇化学法制浆工艺污染严重， NaOH 用量为绝干原料质量的 14 20 ， 黑液处理难度大， 费用高， 一般每吨成品纸约需 200 元 300 元。致使造纸企业面临较 大的环保压力和沉重的经济负担。 0003 目前， 造纸制浆主要有两大类技术路线。1、 化学制浆方法， 添加助剂、 调整工艺对 污染污物进行回收处理。2、 生物制浆方法， 应用生物制浆技术从源头减少污染。对前者来 讲 ： 主要借助国际惯用的技术“碱回收” 系统来解决污染问题， 但 “碱回收” 系统主要是 针对大型木浆厂开发的， 。
10、若将该技术用于治理非木浆的黑液污染， 仍存在诸如热值低、 硅干 扰、 废水处理难度大、 白泥二次污染等问题， 且 “碱回收” 系统投资大， 处理费用高。对于后 者来讲 ： 生物制浆技术是从源头上减少污染， 提高原料的利用率， 且经生物处理后的黑液可 再次转化为有机肥进行二次利用， 是近年来被专家学者和企业大力关注开发的一种新型制 浆技术。 0004 现有的生物制浆方法主要有两类 ： 一类是采用微生物直接处理原料 ； 一类是采用 酶处理原料。 0005 采用微生物直接处理原料的， 如公开号为 CN1683711A， 发明名称为一种造纸 生物制浆工艺 ； 公开号为 CN1420229A， 发明名称。
11、为一种造纸草浆制浆工艺 ； 公开号为 CN101225614A， 发明名称为一种以生物发酵制浆法替代化学制浆工艺的造纸工艺方法 ； 公 开号为 CN1188830A， 发明名称为生物脱木素机械制浆技术等专利申请都是采用微生 物直接处理原料， 它们的主要缺点有 ： 生物处理周期长， 一般需几天时间 ； 微生物处理 前， 一般应对原料进行灭菌处理， 增加了生产成本， 同时有可能降低原料质量 ； 生物处理 过程难以有效控制， 常常出现处理后的原料质量均匀性差， 碳水化合物降解严重等问题， 导 致制浆得率降低 ； 生物处理后原料质量均匀性差， 还直接影响制浆质量， 从而影响最终的 产品质量 ； 采用上。
12、述方法生产出的纸浆与普通化学浆相比， 纸浆的物理性能及漂白性能 都较差， 不能用来生产高白度、 高强度的纸张， 只能用来生产低档次的纸张。 0006 采用酶处理原料的， 如公开号为 CN1616758A， 发明名称为生物制浆工艺 ； 公开号 为 CN1421570A， 发明名称为草类原料酶法制浆的方法等专利， 该工艺的主要缺点是 ： 酶液 的成本高， 在工业化生产中不占有成本优势 ； 同时， 木质素酶、 木聚糖酶、 半纤维素酶对相应 成分的破坏难以控制， 可能过多去除木质素、 木聚糖、 半纤维素， 影响纸浆得率。 0007 公开号为 CN 101914510A， 发明名称为一种碱性果胶酶生产方。
13、法及在造纸制浆中 说 明 书 CN 103541259 A 3 2/9 页 4 的应用的专利公开了一种碱性果胶酶及在造纸制浆中的应用， 即将造纸原料在浸酸处理 后， 用碱性果胶酶液浸泡， 酶处理后再在蒸煮锅中蒸煮。但是， 其工艺复杂， 原料需浸酸、 浸 碱后再进行酶处理， 存在以下不足 ： 一是酶种单一， 浸酶时间长 ； 二是需新增设备， 增加成 本 ； 三是需新增浸酸、 浸碱步骤， 新增污染， 不利于工业化生产使用。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种芦苇、 狄苇造纸制浆用复合酶液的生产方法及应用， 所 述复合酶液的酶活力高， 单位生产成本低， 发酵周期短， 工业化程度高， 工艺过程。
14、简单易控， 且复合酶液中各组份酶对结晶纤维素、 羧甲基纤维素均没有活性， 应用于造纸制浆， 可降低 造纸生产成本和环境污染， 同时有助提高纸的产品品质。 0009 本发明是采用如下技术方案实现其发明目的的， 一种芦苇、 狄苇造纸制浆用复合 酶液的生产方法， 将各组份酶经称量、 复配罐混合配制、 防腐、 检验、 包装后存放于 5库房 中， 所述各组份酶为碱性果胶酶、 木聚糖酶和甘露聚糖酶 ； 所述碱性果胶酶为 CCTCC NO ： M 2010004 菌种经菌种培养、 摇瓶发酵， 种子罐到发酵罐、 过滤、 除菌、 防腐处理后制备 ； 所述 木聚糖酶为 CGMCC NO ： 5466 菌种经菌种培。
15、养、 摇瓶发酵， 种子罐到发酵罐、 过滤、 除菌、 防腐 处理后制备 ； 所述甘露聚糖酶为 CGMCC NO ： 6226 菌种经菌种培养、 摇瓶发酵， 种子罐到发酵 罐、 过滤、 除菌、 防腐处理后制备 ； 所述复合酶液中碱性果胶酶的活力为 800u/ml 1200u/ ml， 木聚糖酶的活力为1200u/ml1500u/ml， 甘露聚糖酶的活力为2000u/ml3000u/ml。 0010 由于生物酶具有较强的专一性， 造纸原料中的物料组分较为复杂。本发明添加添 加木质素酶直接作用于原料中的木质素， 使其分解或脱落， 多酶耦合协同作用原料有助于 提高生物酶的催化效果和化工原料的可及性和利用。
16、率。 0011 本发明所述各组份酶为碱性果胶酶、 木聚糖酶、 甘露聚糖酶和木质素酶 ； 所述木 质素酶为 CGMCC NO ： 6225 菌种经菌种培养、 摇瓶发酵， 种子罐到发酵罐、 过滤、 除菌、 防腐 处理后制备 ； 所述复合酶液中碱性果胶酶的活力为 800u/ml 1200u/ml， 木聚糖酶的活力 为 1200u/ml 1500u/ml， 甘露聚糖酶的活力为 2000u/ml 3000u/ml， 木质素酶的活力为 80u/ml 100u/ml。 0012 上述复合酶液在芦苇、 狄苇造纸制浆中的应用， 造纸原料经预处理后送入蒸煮锅 进行酶处理， 即将原料用复合酶液浸泡， 酶处理条件为 。
17、： pH值7.09.5， 温度4060， 绝干原料与复合酶液的质量比为 100:1.2 1.8， 绝干原料与水的质量比为 1:8 12， 浸酶 时间20分钟60分钟 ； 酶处理后在蒸煮锅中蒸煮， 蒸煮条件为 ： NaOH用量为绝干原料质量 的 7 11 ， 温度 120 150， 时间 70 分钟 120 分钟。 0013 本发明的酶处理条件优选为 ： pH 值 8.0 9.0， 温度 50 55， 绝干原料与复 合酶液的质量比为 100:1.5， 绝干原料与水的质量比为 1:8 10， 浸酶时间 40 分钟 50 分 钟。 0014 由于采用上述技术方案， 本发明较好的实现了发明目的， 各组。
18、分酶的活力高， 单位 成本低， 发酵周期短， 工业化程度高， 且复合酶液中各组份酶对结晶纤维素、 羧甲基纤维素 均没有活性 ； 应用于造纸制浆， 无需增加设备， 工艺简单、 使用方便， 与传统化学制浆法比 较， 用碱量降低 50 左右， 废水中 COD 含量降低 30 以上， 生产成本降低 20 左右， 且提 高了纸的产品品质。 说 明 书 CN 103541259 A 4 3/9 页 5 具体实施方式 0015 下面结合实施例对本发明作进一步说明。 0016 实施例 1 ： 一种芦苇、 狄苇造纸制浆用复合酶液的生产方法， 将各组份酶经称量、 复配罐混合配 制、 防腐、 检验、 包装后存放于 。
19、5库房中， 所述各组份酶为碱性果胶酶、 木聚糖酶和甘露聚 糖酶 ； 所述碱性果胶酶为 CCTCC NO ： M 2010004 菌种经菌种培养、 摇瓶发酵， 种子罐到发酵 罐、 过滤、 除菌、 防腐处理后制备 ； 所述木聚糖酶为 CGMCC NO ： 5466 菌种经菌种培养、 摇瓶发 酵， 种子罐到发酵罐、 过滤、 除菌、 防腐处理后制备 ； 所述甘露聚糖酶为 CGMCC NO ： 6226 菌种 经菌种培养、 摇瓶发酵， 种子罐到发酵罐、 过滤、 除菌、 防腐处理后制备 ； 所述复合酶液中碱 性果胶酶的活力为 800u/ml 1200u/ml， 木聚糖酶的活力为 1200u/ml 1500。
20、u/ml， 甘露聚 糖酶的活力为 2000u/ml 3000u/ml。 0017 本发明所述的 CCTCC NO ： M 2010004 菌种是在中国宁夏土壤中通过自然采集菌 样， 从近百株菌株中经摇瓶筛选得到二株出发菌株， 并在细胞水平下采用亚硝基胍和紫外 线辐射诱变得到近万株菌株， 经过摇瓶筛选得到一株实验室编号为 MAPLE61 的菌株， 即耐 热枯草芽胞杆菌 （Heat resistant Bacillus subtilis） ， 其生物学特性为 ： 菌体呈杆状， 菌体两端较平整、 单个细胞 (0.7 0.75)*(2.5 2.9) 微米， 无荚膜， 周生鞭毛， 菌落乳白 色， 革兰氏。
21、染色阳性， 需氧菌， 液体培养生长期菌体多数呈链状排例且以三连体或四连体居 多 ； 形成芽胞， 芽孢形态椭圆到杆状，（0.6 0.8） *（1.0 1.4） 微米， 位于菌体中央或稍 偏。该菌种已于 2010 年 1 月 11 日提交中国典型培养物保藏中心保藏 （湖北省武汉市武汉 大学） ， 保藏号为 ： CCTCC NO ： M 2010004， 并于 2010 年 1 月 15 日提交了保藏存活证明。 0018 该菌种的斜面培养基配方为 ： 1000mL 蒸馏水中， 加入牛肉膏 5g 10g， 酵母膏 5g 10g， 蛋白胨 10g 15g， 葡萄糖 5g 10g， 氯化钠 5g 10g，。
22、 碳酸钠 0.3 0.5g， 琼 脂粉 20g， 调 pH 值 6.9 7.1， 0.1MPa 灭菌 20 分钟 30 分钟， 制成试管斜面， 接种该菌种， 33 35， 培养 18 小时 24 小时。 0019 该斜面菌种通过摇瓶发酵检验菌种产酶能力合格后， 可以作为种子扩培使用或发 酵产酶使用。 0020 摇瓶发酵的培养条件是 ： 以质量计， 培养基配方 ( ) 麦麸 6 8、 玉米粉 0.5 1、 玉米浆 （氮含量 40 ） 1 2、 氯化钠 0.5 0.8、 碳酸钠 0.2 0.3、 纤维质粉 1 2、 水 85.0 91.0， 其中所述各组分之和为 100 ， 灭菌前， 调 pH 值。
23、为 8.0 8.5， 0.1MPa 灭菌 25 分钟 35 分钟， 培养条件 ： 33 35， 转速 260 r/ 分钟 280r/ 分钟， 培养 18 小时 22 小时。 0021 酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐， 二级发酵， 制备标准化酶液。以质量 计， 其培养基配方为 （） 麦麸 6 8、 玉米粉 0.5 1、 玉米浆 （氮含量 40 ） 1 2、 氯化钠 0.50.8、 碳酸钠0.20.3、 纤维质粉12、 水85.091.0， 其中所述各组分之和为100 ， 灭菌前， 调 pH 值为 8.0 8.5， 0.1MPa 灭菌 25 分钟 35 分钟， 装罐总体积不超过 70； 种子。
24、罐的培养条件 ： 温度 （） ： 36 38， 搅拌转速 （r/ 分钟） ： 220， 通气量 （v/v） 0 时 5 时， 1 ： 0.40 0.46、 5 时以后 1 ： 0.50 0.56 ； 发酵罐的培养条件 ： 温度 （） ： 0 小时 4 小时， 36 38， 4 小时以后 33 35， 搅拌转速 （r/min） ： 0 小时 4 小时， 180， 4 小时 6 小 说 明 书 CN 103541259 A 5 4/9 页 6 时， 200， 6 小时以后 220， 通气量 （v/v） ： 0 小时 4 小时， 1 ： 0.25 0.27， 4 小时 6 小时， 1 ： 0.33 。
25、0.36， 6 小时以后 1 ： 0.5 0.55。 0022 酶液制备后， 制备标准碱性果胶酶液， 将发酵醪液经过板框过滤、 硅藻土除菌， 经 防腐处理得到在 15密封存放三个月条件下， 酶活力保持率为 95 以上的标准碱性果胶 酶液。 0023 本发明碱性果胶酶的酶活力测定是用 DNS 显色， 分光光度计比色法测得。其测定 条件为 ： 以 1 的果胶为底物在 pH9.6、 60水浴反应 10 分钟， 加 DNS 沸水浴显色， 550nm 比 色。 酶活力单位定义为 ： 在测定条件下， 每小时水解果胶产生1mg还原糖 （以半乳糖醛酸计） 所需的酶量定义为一个酶活力单位。 0024 以上内容已。
26、在专利号为 201010238630.4、 发明名称为一种碱性果胶酶生产方法及 在造纸制浆中的应用的专利申请中详细描述， 其保藏存活证明也已随申请向中国专利局提 交。 0025 本发明所述的 CGMCC NO ： 5466 菌种是在中国宁夏采集， 在菌种选育筛选过程中， 采用了试管液体培养基反应 DNS 显色初步定性筛选和摇瓶产酶定量筛选的方法， 筛选出一 株实验室编号为KERR89的高产菌株， 根据主要生理生化特征及16S rRNA基因序列、 gyrB基 因序列等实验数据综合分析鉴定为沙福芽孢杆菌 （Bacillus safensis） ， 其生物学特性为 ： 革兰氏染色阳性菌， 产芽孢， 。
27、菌体呈短杆状， 单细胞直径小于 1um， 以二分裂方式增殖 ； 在本 发明所述培养基上菌落呈圆形， 白色、 表面光滑， 均一， 边缘整齐， 略有光泽， 黏稠。 该菌种已 于 2011 年 11 月 17 日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏 （北京市朝 阳区北辰西路 1 号院 3 号） ， 保藏号 ： CGMCC NO ： 5466， 并于同日提交了保藏存活证明。 0026 该菌种的斜面培养基配方为 ： 蛋白胨 0.5 1 、 牛肉膏 0.3 0.5 、 酵母 膏 0.3 0.5 、 葡萄糖 0.3 0.5 、 氯化钠 0.3 0.5 、 琼脂 1.8 2.2 、 水 94.8。
28、 96.5 ， 其中所述各组分之和为 100 ， 调 pH 值 6.9 7.1， 0.1MPa 灭菌 20 分钟 30 分钟， 制成试管斜面， 接种该菌种， 32 35， 培养 24 小时 26 小时。 0027 该斜面菌种通过摇瓶发酵检验菌种产酶能力合格后， 可以作为种子扩培使用或发 酵产酶使用。 0028 摇瓶发酵的培养条件是 ： 以重量计， 培养基配方为麦麸 5 8 、 纤维质粉 1.5 2 、 葡萄糖 0.3 0.5 、 硫酸铵 0.3 0.5 、 玉米浆 1 2 、 磷酸氢二钾 0.1 0.2 、 氯化钠 0.3 0.5 、 水 86.3 91.5 ， 其中所述各组分之和为 100 。
29、， 灭菌前， 调 pH 值为 8.0 8.5， 0.1MPa 灭菌 20 分钟 35 分钟， 培养条件 ： 33 35， 摇床转速 260 r/min 280r/min， 培养 48 小时 52 小时。 0029 酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐， 二级发酵， 制备标准化酶液。 0030 种子培养基配方为 ： 以重量计， 麦麸 5 8 、 玉米粉 1.5 2 、 硫酸铵 0.3 0.5 、 玉米浆 1 2 、 磷酸氢二钾 0.1 0.2 、 氯化钠 0.3 0.5 、 水 86.8 91.8 ， 其中所述各组分之和为 100 ， 灭菌前， 调 pH 值为 6.5 7.0， 0.1MPa 灭。
30、 菌 30 分钟 35 分钟， 种子罐装料总体积不超过 70； 培养条件 ： 温度 33 38， 搅拌转 速 180 r/min 220 r/min， 通气量以 v/v 计 ： 0 小时 5 小时， 1 ： 0.40 0.46， 5 小时以 后， 1 ： 0.50 0.56， 罐压 0.06 MPa 0.07MPa， 培养周期为 7 小时 9 小时。 0031 产酶发酵罐的培养基配方为 ： 以重量计， 麦麸 5 8 、 纤维质粉 1.5 2 、 说 明 书 CN 103541259 A 6 5/9 页 7 葡萄糖 0.3 0.5 、 硫酸铵 0.3 0.5 、 玉米浆 1 2 、 磷酸氢二钾 。
31、0.1 0.2 、 氯化钠 0.3 0.5 、 水 86.3 91.5 ， 其中所述各组分之和为 100 ， 灭菌前， 调 pH 值为 8.0 8.5， 0.1MPa 灭菌 30 分钟 35 分钟， 装料总体积不超过 70 ； 培养条件 ： 温度 33 38， 搅拌转速 180 r/min 220 r/min， 通气量以 v/v 计 ： 0 小时 2 小时， 1 ： 0.40 0.42， 2 小时 4 小时， 1:0.50 0.52， 4 小时 6 小时， 1:0.55 0.68， 6 小时 以后 1:0.60 0.62， 罐压 0.06 MPa 0.07MPa， 发酵周期为 48 小时 52。
32、 小时。 0032 酶液制备后， 制备标准化木聚糖酶液。 将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、 硅 藻土除菌， 经防腐处理得到在 15密封存放三个月条件下， 酶活力保持率为 95 以上的标 准木聚糖酶液。 0033 本发明木聚糖酶的活力测定方法为， 用 pH 值为 9.0， 0.1mol/L 的甘氨酸氢氧化 钠缓冲液为溶剂配制 2 木聚糖 （sigma 来自于桦木产品） 溶液。吸取 0.9ml 底物于 15ml 刻度试管中， 在要求温度水浴平衡 3min， 加入 0.1ml 适当稀释酶溶液， 反应 10min， 加入 3ml 3， 5 二硝基水杨酸试剂， 沸水浴中显色 15min， 冷凉后用蒸。
33、馏水定容至 15ml， 分光光度计 550nm 波长测光吸收值。酶活力定义为， 在测定条件下每小时水解底物产生 1mg 还原糖 （以 木糖计， ） 所需酶量定义为一个酶活力单位 （u） 。 0034 本发明所述的 CGMCC NO ： 6226 菌种是在中国宁夏采集， 在菌种选育筛选过程中， 筛选出一株实验室编号为 PARK9639 的高产菌株， 根据主要生理生化特征及 16S rRNA 基因 序列、 gyrB基因序列等实验数据综合分析鉴定为枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ， 该菌 种已于 2012 年 06 月 15 日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
34、 （北京 市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号） ， 保藏号 ： CGMCC NO ： 6226， 并于同日提交了保藏存活证明。 0035 该菌种的斜面培养基配方为 ： 1000mL蒸馏水中， 加入牛肉膏3g8g， 酵母膏3g 8g ， 蛋白胨 8g 12g， 葡萄糖 3g 5g ， 氯化钠 3g 5g， 调 pH 值 6.9 7.1， 0.1MPa 灭菌 28 分钟 32 分钟， 制成试管斜面， 接种该菌种， 34 36， 培养 20 小时 24 小时。 0036 该斜面菌种通过摇瓶发酵检验菌种产酶能力合格后， 可以作为种子扩培使用或发 酵产酶使用。 0037 摇瓶发酵的培养条件是 ： 以质量。
35、计， 培养基配方为 ： 魔芋粉34、 麦麸2 4 、 氮含量 40的玉米浆 0.5 1 、 酵母膏 0.5 1 ， 磷酸氢二铵 0.2 0.3 、 磷酸氢二钾 0.02 0.05 、 蛋白胨 0.1 0.2 、 硫酸镁 0.02 0.05 、 碳酸 钠 0.20 0.25 、 水 89.15 93.46 ， 其中所述各组分之和为 100 ， 灭菌前， 调 pH 值为 pH8.0 pH8.5， 0.1MPa 灭菌 30 分钟 35 分钟， 培养条件 ： 32 37， 摇床转速 260 r/min 280r/min， 培养 34 小时 42 小时。 0038 酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐，。
36、 二级发酵， 制备标准化酶液。 0039 种子培养基配方为 ： 以质量计， 麦麸 5 6 、 玉米粉 1 2 、 氮含量 40 的玉米浆 1 2 、 氯化钠 0.4 0.6 、 碳酸钠 1 2 、 硫酸铵 0.3 0.5 、 水 86.9 91.3 ， 其中所述各组分之和为 100 ， 灭菌前， 调 pH 值为 6.5 7.0， 0.1MPa 灭菌30分钟35分钟 ； 种子罐装料总体积不超过70， 培养条件为 ： 温度3338， 搅 拌转速 180 r/min 220 r/min， 通气量以 v/v 计 ： 0 小时 4 小时， 1 ： 0.25 0.27 ， 4 小 时 6 小时， 1:0.。
37、33 0.36 ， 6 小时以后， 1:0.50 0.55， 罐压 0.06 MPa 0.07MPa， 培 养周期为 7 小时 9 小时。 说 明 书 CN 103541259 A 7 6/9 页 8 0040 产酶发酵罐的培养基配方为 ： 以质量计， 魔芋粉 3 4 、 麦麸 2 4 、 氮含 量40的玉米浆0.51、 酵母膏0.51， 磷酸氢二铵0.20.3、 磷酸氢二 钾 0.02 0.05 、 蛋白胨 0.1 0.2 、 硫酸镁 0.02 0.05 、 碳酸钠 0.20 0.25 、 水 89.15 93.46 ， 其中所述各组分之和为 100 ， 灭菌前， 调 pH 值为 8.0 8。
38、.5， 0.1MPa灭菌30分钟35分钟， 装料总体积不超过70 ； 培养条件 ： 温度3338， 搅拌转速 180 r/min 220 r/min， 通气量以 v/v 计 ： 0 小时 4 小时， 1 ： 0.30 0.32 ， 4 小时 6 小时， 1:0.40 0.42， 6 小时以后 1:0.50 0.55， 罐压 0.06 MPa 0.07MPa， 发酵 周期为 34 小时 42 小时。 0041 酶液制备后， 制备标准化甘露聚糖酶液。 将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、 硅藻土除菌， 经防腐处理得到在 15密封存放三个月条件下， 酶活力保持率为 95 以上的 标准甘露聚糖酶液。 。
39、0042 甘露聚糖酶的酶活力测定方法为， 利用 0.05mol/L pH6.0 的十二水合磷酸氢二钠 和一水合柠檬酸缓冲液配制0.5%的槐豆胶溶液。 在0.9ml该底物溶液中加入0.1ml适当稀 释的酶溶液， 50准确计时反应10min， 在550nm测光吸收值。 其酶活力定义为， 在测定条件 下每小时水解槐豆胶产生 1mg 还原糖 （以甘露糖计） 所需酶量定义为一个酶活力单位 （u） 。 0043 将制备好的碱性果胶酶液、 木聚糖酶液和甘露聚糖酶液经称量、 复配罐混合配制、 防腐、 检验、 包装后存放于 5库房中备用， 所述复合酶液中碱性果胶酶的活力为 800u/ ml 1200u/ml（本。
40、实施例为 1000u/ml ？ ） ， 木聚糖酶的活力为 1200u/ml 1500u/ml（本 实施例为 1300u/ml ？ ） ， 甘露聚糖酶的活力为 2000u/ml 3000u/ml（本实施例为 2200u/ ml ？ ） 。 0044 上述复合酶液在芦苇、 狄苇造纸制浆中的应用， 造纸原料经预处理后送入蒸煮锅 进行酶处理， 即将原料用复合酶液浸泡， 酶处理条件为 ： pH值7.09.5， 温度4060， 绝干原料与复合酶液的质量比为 100:1.2 1.8， 绝干原料与水的质量比为 1:8 12， 浸酶 时间20分钟60分钟 ； 酶处理后在蒸煮锅中蒸煮， 蒸煮条件为 ： NaOH用。
41、量为绝干原料质量 的 7 11 ， 温度 120 150， 时间 70 分钟 120 分钟。 0045 本发明的酶处理条件优选为 ： pH 值 8.0 9.0， 温度 50 55， 绝干原料与复 合酶液的质量比为 100:1.5， 绝干原料与水的质量比为 1:8 10， 浸酶时间 40 分钟 50 分 钟。 0046 本实施例 pH 值 8.5， 温度 55， 绝干原料与复合酶液的质量比为 100:1.5， 绝干原 料与水的质量比为 1:8， 浸酶时间 50 分钟。酶解完成后进入蒸煮阶段， 蒸煮时的蒸煮条件 为 ： NaOH 用量为绝干原料质量的 10 ， 温度 150， 时间 110 分钟。。
42、在蒸煮过程中酶被高温 高压灭活， 对后续工艺不产生任何不良影响。 0047 本发明将复合酶液应用于芦苇、 狄苇造纸制浆中， 复合酶液中的果胶酶有效水解 原料中高耗化工料的果胶、 果胶质， 木聚糖酶水解原料中的木聚糖等杂多糖等物质， 可直接 降低化工料用量 ； 同时， 各组份酶酶解植物组织中细胞与细胞之间相粘连的中胶层中的果 胶、 果胶质， 木聚糖、 甘露聚糖等杂多糖使细胞与细胞疏离或分开， 木质素碎片脱落， 形成毛 细孔 ； 酶解导致细胞壁结构松动， 出现裂隙， 为化工料直接迅速渗透到植物空腔并直接作用 于木质素创造条件， 从而提高化工料利用率， 达到降低化工料用量目的。 0048 且木聚糖酶。
43、不产纤维素酶， 不损伤纤维， 不影响纸浆强度。 说 明 书 CN 103541259 A 8 7/9 页 9 0049 碱性果胶酶作用原料中的果胶质， 木聚糖酶作用原料中的木聚糖， 甘露聚糖酶作 用原料中的甘露聚糖， 减少了碱等化工料作用果胶、 木聚糖和甘露聚糖等杂多糖的消耗， 达 到降低化工料的目的 ； 另外通过对果胶质、 木聚糖和甘露聚糖等杂多糖的水解， 使孢间层中 的果胶质， 木聚糖， 甘露聚糖等粘连物质减少， 使细胞与细胞疏离或分开， 毛细孔增多增大， 利于碱等化工料的渗入， 增加它们的可及性， 提高其作用效率， 从而达到降低化工料用量的 目的。 0050 本发明经在以芦苇、 狄苇为原。
44、料的造纸厂工业化生产实践表明， 与传统化学制浆 法比较， 用碱量降低 50 左右， 蒸煮时间也下降 30 分钟以上， 废水中 COD 含量降低 30 以 上， 生产成本降低 20 左右， 且提高了纸的产品品质。 0051 实施例 2 ： 本发明所述各组份酶为碱性果胶酶、 木聚糖酶、 甘露聚糖酶和木质素酶 ； 所述木质素酶 为 CGMCC NO ： 6225 菌种经菌种培养、 摇瓶发酵， 种子罐到发酵罐、 过滤、 除菌、 防腐处理后制 备 ； 所述复合酶液中碱性果胶酶的活力为 800u/ml 1200u/ml， 木聚糖酶的活力为 1200u/ ml 1500u/ml， 甘露聚糖酶的活力为 200。
45、0u/ml 3000u/ml， 木质素酶的活力为 80u/ml 100u/ml。 0052 本发明所述的 CGMCC NO ： 6225 菌种是在中国宁夏采集， 在菌种选育筛选过 程中， 筛选出一株实验室编号为 KERR7989 的高产菌株， 根据主要生理生化特征及 16S rRNA 基因序列、 gyrB 基因序列等实验数据综合分析鉴定为阿拉提芽孢杆菌 （Bacillus altitudinis） ， 该菌种已于 2012 年 06 月 15 日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心保藏 （北京市朝阳区北辰西路1号院3号） ， 保藏号 ： CGMCC NO ： 6225， 并于同日提。
46、交 了保藏存活证明。 0053 该菌种的斜面培养基配方为 ： 1000mL 蒸馏水中， 加入牛肉膏 5g 10g， 酵母膏 5g 10g， 蛋白胨 10g 15g， 葡萄糖 5g 10g， 氯化钠 3g 8g， 调 pH 值 6.9 7.1， 0.1MPa 灭菌20分钟30分钟， 制成试管斜面， 接种该菌种， 3335， 培养18小时24小时。 0054 该斜面菌种通过摇瓶发酵检验菌种产酶能力合格后， 可以作为种子扩培使用或发 酵产酶使用。 0055 摇瓶发酵的培养条件是 ： 以质量计， 培养基配方为 ： 麦麸 6 8 、 纤维质粉 1 2 、 氮含量 40 的玉米浆 1 2 、 硫酸铵 0.。
47、3 0.5 、 磷酸氢二钾 0.1 0.2 、 蛋白胨 0.5 1 、 硫酸镁 0.03 0.05 、 碳酸钠 0.2 0.3 ， 水 85.95 90.7 ， 其中所述各组分之和为 100 ， 灭菌前， 调 pH 值为 8.0 8.5， 0.1MPa 灭菌 25 分钟 35 分钟， 培养条件 ： 33 35， 摇床转速 260 r/ 分钟 280r/ 分钟， 培养 48 小 时 52 小时。 0056 酶液制备为由茄瓶斜面制得细胞液体种子到种子罐， 再到产酶发酵罐， 二级发酵， 制备标准化酶液。 0057 种子培养基配方为 ： 以质量计， 麦麸 5 6 、 玉米粉 1 2 、 氮含量 40 的玉米浆 1 2 、 氯化钠 0.4 0.6 、 碳酸钠 1 2 、 硫酸铵 0.3 0.5 、 水 86.9 。