一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法.pdf

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1、10申请公布号CN104178459A43申请公布日20141203CN104178459A21申请号201410419552622申请日20140819C12N7/00200601C12N7/0420060171申请人青岛蔚蓝生物制品有限公司地址266114山东省青岛市红岛经济区红岛街道海洋科技开发区雪驰路东72发明人凌红丽易建中韩成昊马子敏54发明名称一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法57摘要本发明涉及疫苗生产技术领域，具体是通过无血清培养技术，结合悬浮培养的方式，实现狂犬病毒的大规模扩增。利用本发明所述方法，BHK21种子细胞的活力高于95，密度达到5106CELL/ML，狂犬病毒滴度大于。

2、或等于108。所述方法生产工艺稳定，重复性好，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图3页10申请公布号CN104178459ACN104178459A1/1页21一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法，包括如下步骤1种子细胞活化将液氮冻存的种子细胞先用血清含量为5的培养基活化，培养两代后，再用血清含量为2的培养基培养2代；2种子细胞的无血清驯化从2浓度开始，逐渐降低培养基中血清的含量，连续驯化种子细胞，检测细胞活力；待细胞完全适应无血清悬浮培养基之后，停止驯化；3种子细胞在生物反。

3、应器中的培养在生物反应器中接入驯化后的种子细胞初始密度50万/ML，反应器参数设定为转速80转/分，培养温度37，溶氧为3045，PH值为7274；采用半连续流加方式培养细胞；4狂犬病毒株的增殖将狂犬病毒株以2V/V比例接种生长良好的单层种子细胞，培养4872小时，当病变达到80100时，收获狂犬病毒液，测定病毒滴度；5接种病毒当生物反应器中种子细胞的浓度达到100万/ML时，按MOI01接种步骤4获得的狂犬病毒液；6病毒大规模扩增生物反应器设定参数为转速80转/分钟，DO值40，温度为32；7病毒收获狂犬病毒接种72小时后开始收毒，每次收毒2/3体积，隔天再收一次并添加新鲜无血清培养基，收毒。

4、25次之后，细胞活力降低到80以下，停止收毒；毒液收集于塑料容器中，80保存备用。2如权利要求1所述方法，其特征在于，所述种子细胞为BHK21细胞或VERO细胞。3如权利要求1所述方法，其特征在于，所述生物反应器为搅拌式生物反应器，反应器容积为5L、50L或300L。4如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3所述半连续流加方式培养细胞，是将50倍氨基酸维生素浓缩液，按照第3天10V/V，第5天10V/V，第6天10V/V，第7天10V/V，第8天5V/V，第9天5V/V，第10天5V/V，第11天5V/V流加入反应器中用于培养细胞。5如权利要求1所述方法，其特征在于，所述狂犬病毒株为FLURY。

5、或AG毒株。6权利要求15任一所述方法在狂犬病毒疫苗制备中的应用。权利要求书CN104178459A1/3页3一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法技术领域0001本发明涉及疫苗生产技术领域，具体提供了一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法。背景技术00021962年，CAPSTICK等对BHK21细胞驯化实现悬浮培养，并用于兽用疫苗生产。1967年，VANWEZEL开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。悬浮培养与微载体培养标志着细胞大规模培养技术的开始，细胞生产病毒疫苗也成为细胞大规模培养技术生产生物制品的第一次浪潮。到了20世纪八九十年代，CHO细胞实现悬浮培养，治疗性抗体生产技术的发展。

6、极大地推动着生物反应器在生物制药行业中的应用，到20世纪末已进入万升级规模。2000年以后，随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等技术的发展，作为大规模培养主要设备的生物反应器规模也趋向大型化和简单化。当今生物制药的主流技术是在大型机械搅拌式反应器中，用无血清培养基和流加培养工艺悬浮培养细胞进行生产。0003狂犬病俗称“恐水症”，是由狂犬病毒引起的人兽共患中枢神经系统传染病，临床表现以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等为主要特征，是迄今为止人类唯一病死率高达100的急性传染病。中华人民共和国传染病防治法将狂犬病列为乙类传染病。最早制造狂犬疫苗的是法国的巴斯德。1882年它成功地应用连续传代减弱病。

7、毒毒力的方法，用适应毒种来制造疫苗。中国现在制造的狂犬疫苗系用狂犬病毒固定毒接种于原代地鼠肾细胞，培养后，收获毒液，经浓缩、纯化、精制并加氢氧化铝佐剂，经全面检定合格后即为预防狂犬病的疫苗。0004如何通过无血清培养和生物反应器悬浮培养工艺进一步提高兽用狂犬疫苗的质量和产量，是目前本领域的研究热点和难点。发明内容0005本发明的目的是提供一种培养狂犬病毒的方法。具体是通过无血清培养技术，结合悬浮培养的方式，实现狂犬病毒的大规模扩增，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。0006本发明一方面提供了一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法，包括如下步骤00071种子细胞活化0008将液氮冻存的种子细胞先用。

8、血清含量为5的培养基活化，培养两代后，再用血清含量为2的培养基培养2代；00092种子细胞的无血清驯化0010从2浓度开始，逐渐降低培养基中血清的含量，连续驯化种子细胞，检测细胞活力；待细胞完全适应无血清悬浮培养基之后，停止驯化；00113种子细胞在生物反应器中的培养说明书CN104178459A2/3页40012在生物反应器中接入驯化后的种子细胞初始密度50万/ML，反应器参数设定为转速为80转/分，培养温度为37，溶氧为3045，PH值为7274；采用半连续流加方式培养细胞；00134狂犬病毒株的增殖0014将狂犬病毒株以2V/V比例接种生长良好的单层种子细胞，培养4872小时，当病变达到。

9、80100时，收获狂犬病毒液，测定病毒滴度；00155接种病毒0016当生物反应器中种子细胞的浓度达到100万/ML时，按MOI01接种步骤4获得的狂犬病毒液；00176病毒大规模扩增0018生物反应器设定参数为转速80转/分钟，DO值40，温度为32；00197病毒收获0020狂犬病毒接种72小时后开始收毒，每次收毒2/3体积，隔天再收一次并添加新鲜无血清培养基，收毒25次之后，细胞活力降低到80以下，停止收毒；毒液收集于塑料容器中，80保存备用。0021其中所述种子细胞为BHK21细胞或VERO细胞；0022所述生物反应器为搅拌式生物反应器，反应器容积为5L、50L或300L；0023步骤。

10、3所述半连续流加方式培养细胞，是将50倍氨基酸维生素浓缩液，按照第3天10V/V，第5天10V/V，第6天10V/V，第7天10V/V，第8天5V/V，第9天5V/V，第10天5V/V，第11天5V/V流加入反应器中用于培养细胞；0024所述狂犬病毒株为FLURY或AG毒株；0025本发明另一方面提供了上述方法在狂犬病毒疫苗制备中的应用。0026有益效果0027利用本发明所述方法，BHK21种子细胞的活力高于95，密度达到5106CELL/ML，狂犬病毒滴度大于或等于108。所述方法生产工艺稳定，重复性好，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。附图说明0028图1为BHK21细胞无血清驯化过程。

11、。0029图2为无血清批式培养的BHK21细胞生长曲线。0030图3为无血清批式培养的BHK21细胞活力变化情况。0031图4为BHK21细胞无血清流加培养生长曲线。0032图5为培养12天的BHK21细胞涂片。具体实施方式0033实施例1BHK21细胞的无血清驯化003411种子细胞培养0035在150ML摇瓶中添加30ML细胞基本培养基，按2V/V比例加入新生牛血清石说明书CN104178459A3/3页5家庄宏伟生物，制备得到低血清培养基；使用该培养基连续换液扩增BHK21悬浮细胞株。003612无血清驯化0037从2的浓度起始，逐渐降低培养基中血清的含量，增加无血清培养基SFMNB20。

12、7，北京钮因公司的比例，按照图1所述方式连续驯化细胞，用细胞活力是否能够稳定在90以上作为驯化是否良好的一个指标。0038具体方法如下按50万/ML初始密度接入种子细胞，采用血清含量为2的培养基进行细胞培养。然后依循如下顺序逐步降低培养基中血清的含量至1、05、01、0，分这四个阶段驯化细胞，各阶段驯化稳定的标志为连续3天细胞活力保持高于90，每个阶段驯化稳定之后再进入下一阶段。等待细胞完全适应无血清悬浮培养之后，停止驯化。0039在150ML摇瓶中，将驯化完毕的BHK21细胞在无血清培养基SFMNB207，北京钮因公司中作模拟的批式悬浮培养，其生长曲线与细胞活力变化情况如图2，图3所示，最大。

13、细胞密度达到300万/ML以上，细胞活力大部分时间可以维持在90以上。表明该细胞完全适应了无血清培养基。0040实施例2生物反应器半流加培养BHK21细胞0041将驯化后的种子细胞按初始密度50万/ML接入75L搅拌罐生物反应器中，反应器转速为80转/分，培养温度为37，溶氧为3045；PH值为72740042采用半连续流加方式培养细胞。所述半连续流加方式培养细胞，是将50倍氨基酸维生素浓缩液SFMNB207AVT50，北京钮因公司，按照第3天10V/V，第5天10V/V，第6天10V/V，第7天10V/V，第8天5V/V，第9天5V/V，第10天5V/V，第11天5V/V流加入反应器中用于培。

14、养细胞，连续培养二周以上。BHK21细胞在无血清培养基中，第5天达到最高活细胞密度400万以上图4，细胞生长状态良好图5，维持在80以上存活率的时间达到12天，基本满足下一步进行无血清悬浮培养连续生产狂犬病毒的需要。0043实施例3狂犬病毒的大规模扩增0044将狂犬病毒以2V/V比例接种生长良好的单层BHK21细胞，培养4872小时，当病变达到80100时，收获病毒液，测定病毒滴度。0045当生物反应器中种子细胞的浓度达到100万/ML时，按MOI01接种上述获得的狂犬病毒液；生物反应器设定参数为转速80转/分钟，DO值40，温度为32，进行病毒大规模扩增。0046接入病毒之后的72小时开始第一次收毒，每次收毒2/3体积，隔天收一次并添加新鲜培养基，收液25次之后细胞活力降低到80以下停止收毒同时病毒滴度也降低到了60LOGLD50/ML左右，合并液病毒滴度在11068个病毒/ML之间。其间最大细胞密度可以超过5106CELLS/ML，病毒滴度峰值达到83LOGLD50/ML。说明书CN104178459A1/3页6图1图2说明书附图CN104178459A2/3页7图3图4说明书附图CN104178459A3/3页8图5说明书附图CN104178459A。

摘要
申请专利号：	CN201410419552.6	申请日：	2014.08.19
公开号：	CN104178459A	公开日：	2014.12.03
当前法律状态：	实审	有效性：	审中
法律详情：	实质审查的生效IPC(主分类):C12N 7/00申请日:20140819\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N7/00; C12N7/04	主分类号：	C12N7/00
申请人：	青岛蔚蓝生物制品有限公司
发明人：	凌红丽; 易建中; 韩成昊; 马子敏
地址：	266114 山东省青岛市红岛经济区红岛街道海洋科技开发区雪驰路东
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内容摘要

本发明涉及疫苗生产技术领域，具体是通过无血清培养技术，结合悬浮培养的方式，实现狂犬病毒的大规模扩增。利用本发明所述方法，BHK21种子细胞的活力高于95％，密度达到5×106cell/ml，狂犬病毒滴度大于或等于108。所述方法生产工艺稳定，重复性好，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。

权利要求书

1.  一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法，包括如下步骤：
1)种子细胞活化
将液氮冻存的种子细胞先用血清含量为5％的培养基活化，培养两代后，再用血清含量为2％的培养基培养2代；
2)种子细胞的无血清驯化
从2％浓度开始，逐渐降低培养基中血清的含量，连续驯化种子细胞，检测细胞活力；待细胞完全适应无血清悬浮培养基之后，停止驯化；
3)种子细胞在生物反应器中的培养
在生物反应器中接入驯化后的种子细胞(初始密度50万/ml)，反应器参数设定为：转速80转/分，培养温度37℃，溶氧为30-45％，pH值为7.2-7.4；采用半连续流加方式培养细胞；
4)狂犬病毒株的增殖
将狂犬病毒株以2％(v/v)比例接种生长良好的单层种子细胞，培养48-72小时，当病变达到80-100％时，收获狂犬病毒液，测定病毒滴度；
5)接种病毒
当生物反应器中种子细胞的浓度达到100万/mL时，按MOI＝0.1接种步骤4)获得的狂犬病毒液；
6)病毒大规模扩增
生物反应器设定参数为：转速80转/分钟，DO值40％，温度为32℃；
7)病毒收获
狂犬病毒接种72小时后开始收毒，每次收毒2/3体积，隔天再收一次并添加新鲜无血清培养基，收毒2-5次之后，细胞活力降低到80％以下，停止收毒；毒液收集于塑料容器中，-80℃保存备用。

2.  如权利要求1所述方法，其特征在于，所述种子细胞为BHK21细胞或vero细胞。

3.  如权利要求1所述方法，其特征在于，所述生物反应器为搅拌式生物反应器，反应器容积为5L、50L或300L。

4.  如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述半连续流加方式培养细胞，是将50倍氨基酸-维生素浓缩液，按照第3天10％(v/v)，第5天10％(v/v)，第6天10％(v/v)，第7天10％(v/v)，第8天5％(v/v)，第9天5％(v/v)，第10天5％(v/v)，第11天5％(v/v)流加入反应器中用于培养细胞。

5.  如权利要求1所述方法，其特征在于，所述狂犬病毒株为Flury或AG毒株。

6.  权利要求1-5任一所述方法在狂犬病毒疫苗制备中的应用。

说明书

一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法
技术领域
本发明涉及疫苗生产技术领域，具体提供了一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法。
背景技术
1962年，Capstick等对BHK21细胞驯化实现悬浮培养，并用于兽用疫苗生产。1967年，Van Wezel开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。悬浮培养与微载体培养标志着细胞大规模培养技术的开始，细胞生产病毒疫苗也成为细胞大规模培养技术生产生物制品的第一次浪潮。到了20世纪八九十年代，CHO细胞实现悬浮培养，治疗性抗体生产技术的发展极大地推动着生物反应器在生物制药行业中的应用，到20世纪末已进入万升级规模。2000年以后，随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等技术的发展，作为大规模培养主要设备的生物反应器规模也趋向大型化和简单化。当今生物制药的主流技术是在大型机械搅拌式反应器中，用无血清培养基和流加培养工艺悬浮培养细胞进行生产。
狂犬病俗称“恐水症”，是由狂犬病毒引起的人兽共患中枢神经系统传染病，临床表现以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等为主要特征，是迄今为止人类唯一病死率高达100％的急性传染病。《中华人民共和国传染病防治法》将狂犬病列为乙类传染病。最早制造狂犬疫苗的是法国的巴斯德。1882年它成功地应用连续传代减弱病毒毒力的方法，用适应毒种来制造疫苗。中国现在制造的狂犬疫苗系用狂犬病毒固定毒接种于原代地鼠肾细胞，培养后，收获毒液，经浓缩、纯化、精制并加氢氧化铝佐剂，经全面检定合格后即为预防狂犬病的疫苗。
如何通过无血清培养和生物反应器悬浮培养工艺进一步提高兽用狂犬疫苗的质量和产量，是目前本领域的研究热点和难点。
发明内容
本发明的目的是提供一种培养狂犬病毒的方法。具体是通过无血清培养技术，结合悬浮培养的方式，实现狂犬病毒的大规模扩增，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。
本发明一方面提供了一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法，包括如下步骤：
1)种子细胞活化
将液氮冻存的种子细胞先用血清含量为5％的培养基活化，培养两代后，再用血清含量为2％的培养基培养2代；
2)种子细胞的无血清驯化
从2％浓度开始，逐渐降低培养基中血清的含量，连续驯化种子细胞，检测细胞活力；待细胞完全适应无血清悬浮培养基之后，停止驯化；
3)种子细胞在生物反应器中的培养
在生物反应器中接入驯化后的种子细胞(初始密度50万/ml)，反应器参数设定为：转速为80转/分，培养温度为37℃，溶氧为30-45％，pH值为7.2-7.4；采用半连续流加方式培养细胞；
4)狂犬病毒株的增殖
将狂犬病毒株以2％(v/v)比例接种生长良好的单层种子细胞，培养48-72小时，当病变达到80-100％时，收获狂犬病毒液，测定病毒滴度；
5)接种病毒
当生物反应器中种子细胞的浓度达到100万/mL时，按MOI＝0.1接种步骤4)获得的狂犬病毒液；
6)病毒大规模扩增
生物反应器设定参数为：转速80转/分钟，DO值40％，温度为32℃；
7)病毒收获
狂犬病毒接种72小时后开始收毒，每次收毒2/3体积，隔天再收一次并添加新鲜无血清培养基，收毒2-5次之后，细胞活力降低到80％以下，停止收毒；毒液收集于塑料容器中，-80℃保存备用。
其中所述种子细胞为BHK21细胞或vero细胞；
所述生物反应器为搅拌式生物反应器，反应器容积为5L、50L或300L；
步骤3)所述半连续流加方式培养细胞，是将50倍氨基酸-维生素浓缩液，按照第3天10％(v/v)，第5天10％(v/v)，第6天10％(v/v)，第7天10％(v/v)，第8天5％(v/v)，第9天5％(v/v)，第10天5％(v/v)，第11天5％(v/v)流加入反应器中用于培养细胞；
所述狂犬病毒株为Flury或AG毒株；
本发明另一方面提供了上述方法在狂犬病毒疫苗制备中的应用。
有益效果
利用本发明所述方法，BHK21种子细胞的活力高于95％，密度达到5×10⁶cell/ml，狂犬病毒滴度大于或等于10⁸。所述方法生产工艺稳定，重复性好，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。
附图说明
图1为BHK21细胞无血清驯化过程。
图2为无血清批式培养的BHK21细胞生长曲线。
图3为无血清批式培养的BHK21细胞活力变化情况。
图4为BHK21细胞无血清流加培养生长曲线。
图5为培养12天的BHK21细胞涂片。
具体实施方式
实施例1：BHK21细胞的无血清驯化
1.1种子细胞培养：
在150ml摇瓶中添加30ml细胞基本培养基，按2％(v/v)比例加入新生牛血清(石家庄宏伟生物)，制备得到低血清培养基；使用该培养基连续换液扩增BHK21悬浮细胞株。
1.2无血清驯化：
从2％的浓度起始，逐渐降低培养基中血清的含量，增加无血清培养基 (Sfm-NB207，北京钮因公司)的比例，按照图1所述方式连续驯化细胞，用细胞活力是否能够稳定在90％以上作为驯化是否良好的一个指标。
具体方法如下：按50万/ml初始密度接入种子细胞，采用血清含量为2％的培养基进行细胞培养。然后依循如下顺序逐步降低培养基中血清的含量至1％、0.5％、0.1％、0％，分这四个阶段驯化细胞，各阶段驯化稳定的标志为：连续3天细胞活力保持高于90％，每个阶段驯化稳定之后再进入下一阶段。等待细胞完全适应无血清悬浮培养之后，停止驯化。
在150ml摇瓶中，将驯化完毕的BHK-21细胞在无血清培养基(Sfm-NB207，北京钮因公司)中作模拟的批式悬浮培养，其生长曲线与细胞活力变化情况如图2，图3所示，最大细胞密度达到300万/ml以上，细胞活力大部分时间可以维持在90％以上。表明该细胞完全适应了无血清培养基。
实施例2：生物反应器半流加培养BHK21细胞
将驯化后的种子细胞按初始密度50万/ml接入7.5L搅拌罐生物反应器中，反应器转速为80转/分，培养温度为37℃，溶氧为30-45％；pH值为7.2-7.4.
采用半连续流加方式培养细胞。所述半连续流加方式培养细胞，是将50倍氨基酸-维生素浓缩液(Sfm-NB207-avt50，北京钮因公司)，按照第3天10％(v/v)，第5天10％(v/v)，第6天10％(v/v)，第7天10％(v/v)，第8天5％(v/v)，第9天5％(v/v)，第10天5％(v/v)，第11天5％(v/v)流加入反应器中用于培养细胞，，连续培养二周以上。BHK-21细胞在无血清培养基中，第5天达到最高活细胞密度400万以上(图4)，细胞生长状态良好(图5)，维持在80％以上存活率的时间达到12天，基本满足下一步进行无血清悬浮培养连续生产狂犬病毒的需要。
实施例3：狂犬病毒的大规模扩增
将狂犬病毒以2％(v/v)比例接种生长良好的单层BHK21细胞，培养48-72小时，当病变达到80-100％时，收获病毒液，测定病毒滴度。
当生物反应器中种子细胞的浓度达到100万/mL时，按MOI＝0.1接种上述获得的狂犬病毒液；生物反应器设定参数为：转速80转/分钟，DO值40％，温度为32℃，进行病毒大规模扩增。
接入病毒之后的72小时开始第一次收毒，每次收毒2/3体积，隔天收一次并添加新鲜培养基，收液2-5次之后细胞活力降低到80％以下停止收毒(同时病毒滴度也降低到了6.0logLD50/ml左右)，合并液病毒滴度在1×106-8个病毒/ml之间。其间最大细胞密度可以超过5×106cells/ml，病毒滴度峰值达到8.3logLD50/ml。