一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103554287 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103554287 A (21)申请号 201310480673.7 (22)申请日 2013.10.15 CCTCC NO ： M 2012113 2012.04.13 C08B 37/00(2006.01) A01G 1/04(2006.01) (71)申请人 甘肃省商业科技研究所 地址 730010 甘肃省兰州市城关区雁南路 18 号兰州高新技术创新园创新大厦 B 座 17 楼 (72)发明人 陈朋 严晓娟 梁宁 胡先望 (74)专利代理机构 兰州中科华西专利代理有限 公司 62002 代理。

2、人 李艳华 (54) 发明名称 一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法 (57) 摘要 本发明涉及一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取 方法， 该方法包括以下步骤 ： 制备马铃薯葡萄 糖斜面培养基 ； 制备种子培养基 ； 制备发酵 培养基 ； 将美味牛肝菌菌丝接种至马铃薯葡萄 糖斜面培养基， 经恒温培养得菌丝体 ； 菌丝体 接种至种子培养基， 经振荡培养得菌种种子液 ； 菌种种子液接种至发酵培养基， 经振荡培养得 发酵液 ； 离心、 洗涤、 烘干、 磨粉后， 得到菌丝体干 粉末 ； 菌丝体干粉末先超声提取再浸提得到多 糖浸提液 ； 多糖浸提液与正丁醇 - 三氯乙酸溶 液混合后离心后即得多糖提取液 ； 多糖提。

3、取液 加乙醇静置， 得沉淀物 ； 沉淀物离心、 洗涤、 干 燥， 即得美味牛肝菌多糖。本发明操作简单， 成本 低， 多糖得率高。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103554287 A CN 103554287 A 1/2 页 2 1. 一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法， 包括以下步骤 ： 制备马铃薯葡萄糖斜面培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 46 倍加水 煮沸 2535min 后用纱布过滤， 得到滤液 A， 该滤液 。

4、A 补足至 1.0L 依次加入 510g 葡萄糖 和 510g 琼脂， 使其 pH 值为 6.08.0， 在 90100温度下充分加热溶解后分装， 在压强为 1.05Kg/cm2、 温度为 121的条件下灭菌 20min 即得 ； 制备种子培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 46 倍加水煮沸 2535min 后 用纱布过滤， 得到滤液 B， 该滤液 B 补足至 1.0L 加入 510g 葡萄糖， 使其 pH 值为 6.08.0， 在90100温度下充分加热溶解后分装， 在压强为1.05Kg/cm2、 温度为121的条件下灭菌 20min 即得 ； 制备发酵培养基 ： 将马铃薯洗净去。

5、皮切碎， 按其质量的 46 倍加水煮沸 2535min 后 用纱布过滤， 得到滤液 C， 该滤液 C 补足至 1.0L 加入 510g 葡萄糖， 使其 pH 值为 6.08.0， 在90100温度下充分加热溶解后分装， 在压强为1.05Kg/cm2、 温度为121的条件下灭菌 20min 即得 ； 真菌的发酵培养 ： 接一环美味牛肝菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上， 于 28恒温培养 410 天后， 置于 4冰箱中， 得到活化培养后的菌丝体 ； 接一环所述活化培养后的菌丝体至装有 10mL 所述种子培养基的试管中， 并置于恒 温振荡器上， 在 28条件下以 100200 r/min 的速率。

6、进行振荡培养 410 天， 制得 pH 值为 5.07.0 的菌种种子液 ； 将所述菌种种子液按 520% 的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中， 并置于 恒温振荡器上， 在28条件下以100200 r/min的速率进行振荡培养410天， 即得发酵液 ； 所述发酵液在高速冷冻离心机中于 5000r/min 离心 20min， 得到菌丝体 ； 所述菌丝体用蒸馏 水洗涤后在真空干燥箱于 60下烘干至恒重后磨成粉， 得到菌丝体干粉末 ； 所述发酵培养 基在所述摇瓶中的装瓶量为 1030% ； 在所述菌丝体干粉末中按 1 g ： 5 mL 20mL 的料液比加入去离子水， 在功率为 100300W。

7、 的条件下超声提取 1020 min 后， 在温度为 7090的条件下浸提次数 24 次， 每 次 13h， 合并提取液， 得到多糖浸提液 ； 将所述多糖浸提液与正丁醇 - 三氯乙酸溶液按 1mL ： 1mL 的比例， 充分混合， 在转速 150 r/min 条件下， 振荡 15min， 再静置 45min， 用高速冷冻离心机 4000r/min 离心 20min， 除 掉变性蛋白质， 将水相再加入相当于其体积的正丁醇 - 三氯乙酸溶液， 反复多次直到上清 液与有机相中间有清晰的分界面为止， 视为蛋白质除尽， 即得多糖提取液 ； 在所述多糖提取液中按其体积的 24 倍加入质量浓度为 95% 的。

8、乙醇， 在 4下静置 24h， 得到沉淀物 A ； 将所述沉淀物 A 经高速冷冻离心机以 4000 r min 离心 10 min 后， 得到沉淀物 B， 该沉淀物 B 经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内， 经 50真空干燥至恒重， 即得美味 牛肝菌多糖。 2. 如权利要求 1 所述的一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法， 其特征在于 ： 所述步骤 中美味牛肝菌菌丝是指采集于陇南康县的美味牛肝菌Boletus edulis KX920NG按常规 方法经组织分离获得的美味牛肝菌菌丝 ； 所述美味牛肝菌Boletus edulis KX920NG 在中 国典型培养物保藏中心的保藏编号为 CCTCC 。

9、NO ： M 2012113， 其分子生物学鉴定后的核酸 权 利 要 求 书 CN 103554287 A 2 2/2 页 3 序列提交至 GenBank 的登录号为 JQ086386。 3. 如权利要求 1 所述的一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法， 其特征在于 ： 所述步骤 中正丁醇 - 三氯乙酸溶液是指正丁醇与三氯乙酸按 5mL ： 1mL 混合而成的混合液。 权 利 要 求 书 CN 103554287 A 3 1/5 页 4 一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法 技术领域 0001 本发明涉及真菌多糖技术领域， 尤其涉及一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法。 背景技术 0002 真菌多糖是从真。

10、菌子实体、 菌丝体及发酵液中分离出的活性物质， 具有调节机体 免疫力、 抗肿瘤、 抗病毒、 抗衰老、 抗辐射、 降血脂、 血糖和胆固醇、 健胃护肝等多种药理作 用。真菌多糖的多种生物活性功能在临床上的广泛应用， 使其已成为生命科学、 生物学、 医 学和食品科学等领域的研究热点。 0003 美味牛肝菌 （Boletus edulis） 属于担子菌亚门、 层菌纲、 伞菌目、 牛肝菌科中的一 种与高等植物共生的外生菌根真菌， 是一种药、 食兼用的珍稀食用菌。 我国美味牛肝菌资源 丰富， 主要分布于河南、 四川、 云南、 内蒙古、 福建、 陕西等地。研究表明， 美味牛肝菌菌丝体 中主要含有碳水化合物、。

11、 粗蛋白、 胞内多糖以及少量的脂类和纤维等成分， 具有降低血脂， 提高人体免疫力和明显的抗癌作用。由于其优良的食疗保健功效， 已成为我国出口创汇的 重要菌类产品。 美味牛肝菌多糖是一种有效的生物免疫调节剂， 具有调节血糖、 血脂及胆固 醇水平、 改善免疫系统功能以及显著的抗肿瘤等作用。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、 成本低、 多糖得率高的美味牛 肝菌菌丝多糖的提取方法。 0005 为解决上述问题， 本发明所述的一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法， 包括以下 步骤 ： 制备马铃薯葡萄糖斜面培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 46 倍加水 煮沸 253。

12、5min 后用纱布过滤， 得到滤液 A， 该滤液 A 补足至 1.0L 依次加入 510g 葡萄糖 和 510g 琼脂， 使其 pH 值为 6.08.0， 在 90100温度下充分加热溶解后分装， 在压强为 1.05Kg/cm2、 温度为 121的条件下灭菌 20min 即得 ； 制备种子培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 46 倍加水煮沸 2535min 后 用纱布过滤， 得到滤液 B， 该滤液 B 补足至 1.0L 加入 510g 葡萄糖， 使其 pH 值为 6.08.0， 在90100温度下充分加热溶解后分装， 在压强为1.05Kg/cm2、 温度为121的条件下灭菌 20m。

13、in 即得 ； 制备发酵培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 46 倍加水煮沸 2535min 后 用纱布过滤， 得到滤液 C， 该滤液 C 补足至 1.0L 加入 510g 葡萄糖， 使其 pH 值为 6.08.0， 在90100温度下充分加热溶解后分装， 在压强为1.05Kg/cm2、 温度为121的条件下灭菌 20min 即得 ； 真菌的发酵培养 ： 接一环美味牛肝菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上， 于 28恒温培养 410 天后， 置于 4冰箱中， 得到活化培养后的菌丝体 ； 接一环所述活化培养后的菌丝体至装有 10mL 所述种子培养基的试管中， 并置于恒 说 明 书 C。

14、N 103554287 A 4 2/5 页 5 温振荡器上， 在 28条件下以 100200 r/min 的速率进行振荡培养 410 天， 制得 pH 值为 5.07.0 的菌种种子液 ； 将所述菌种种子液按 520% 的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中， 并置于 恒温振荡器上， 在28条件下以100200 r/min的速率进行振荡培养410天， 即得发酵液 ； 所述发酵液在高速冷冻离心机中于 5000r/min 离心 20min， 得到菌丝体 ； 所述菌丝体用蒸馏 水洗涤后在真空干燥箱于 60下烘干至恒重后磨成粉， 得到菌丝体干粉末 ； 所述发酵培养 基在所述摇瓶中的装瓶量为 1030。

15、% ； 在所述菌丝体干粉末中按 1 g ： 5 mL 20mL 的料液比加入去离子水， 在功率为 100300W 的条件下超声提取 1020 min 后， 在温度为 7090的条件下浸提次数 24 次， 每 次 13h， 合并提取液， 得到多糖浸提液 ； 将所述多糖浸提液与正丁醇 - 三氯乙酸溶液按 1mL ： 1mL 的比例， 充分混合， 在转速 150 r/min 条件下， 振荡 15min， 再静置 45min， 用高速冷冻离心机 4000r/min 离心 20min， 除 掉变性蛋白质， 将水相再加入相当于其体积的正丁醇 - 三氯乙酸溶液， 反复多次直到上清 液与有机相中间有清晰的分界。

16、面为止， 视为蛋白质除尽， 即得多糖提取液 ； 在所述多糖提取液中按其体积的 24 倍加入质量浓度为 95% 的乙醇， 在 4下静置 24h， 得到沉淀物 A ； 将所述沉淀物 A 经高速冷冻离心机以 4000 r min 离心 10 min 后， 得到沉淀物 B， 该沉淀物 B 经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内， 经 50真空干燥至恒重， 即得美味 牛肝菌多糖。 0006 所述步骤中美味牛肝菌菌丝是指采集于陇南康县的美味牛肝菌Boletus edulis KX920NG按常规方法经组织分离获得的美味牛肝菌菌丝 ； 所述美味牛肝菌Boletus edulis KX920NG 在中国典型培养。

17、物保藏中心的保藏编号为 CCTCC NO ： M 2012113（保藏 单位地址 ： 中国 . 武汉 . 武汉大学 ； 保藏日期 ： 2012 年 4 月 13 日） ， 其分子生物学鉴定后的 核酸序列提交至 GenBank 的登录号为 JQ086386。 0007 所述步骤中正丁醇-三氯乙酸溶液是指正丁醇与三氯乙酸按5mL ： 1mL混合而成 的混合液。 0008 本发明与现有技术相比具有以下优点 ： 1、 本发明采用超声波辅助热水浸提法取代传统的水提醇析法， 与原来工艺相比， 降低 了提取液黏度、 缩短了提取时间， 多糖得率显著提高。同时， 超声波辅助提取能加速真菌胞 内多糖的释放、 扩散。

18、及溶解， 具有提取效率高、 时间短、 多糖结构稳定等优点。 0009 2、 本发明整个过程中无需试剂和化学反应， 不但设备简单， 可操作性强， 而且成本 低， 易于实现生产工艺的连续化和工业化。 0010 3、 本发明发酵菌丝体培养周期短， 生长快， 利于大规模工业生产， 从其发酵液或固 体培养物中得到菌丝体提取多糖， 对进一步深入开发美味牛肝菌资源具有重要意义。 具体实施方式 0011 实施例 1 一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法， 包括以下步骤 ： 制备马铃薯葡萄糖斜面培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 4 倍加水煮沸 25min后用纱布过滤， 得到滤液A， 该滤液A补足至1.。

19、0L依次加入5g葡萄糖和5g琼脂， 使其 说 明 书 CN 103554287 A 5 3/5 页 6 pH 值为 6.08.0， 在 90温度下充分加热溶解后分装， 在压强为 1.05Kg/cm2、 温度为 121 的条件下灭菌 20min 即得。 0012 制备种子培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 4 倍加水煮沸 25min 后 用纱布过滤， 得到滤液 B， 该滤液 B 补足至 1.0L 加入 5g 葡萄糖， 使其 pH 值为 6.08.0， 在 90温度下充分加热溶解后分装， 在压强为 1.05Kg/cm2、 温度为 121的条件下灭菌 20min 即得。 0013 制备发。

20、酵培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 4 倍加水煮沸 25min 后 用纱布过滤， 得到滤液 C， 该滤液 C 补足至 1.0L 加入 5g 葡萄糖， 使其 pH 值为 6.08.0， 在 90温度下充分加热溶解后分装， 在压强为 1.05Kg/cm2、 温度为 121的条件下灭菌 20min 即得。 0014 真菌的发酵培养 ： 接一环美味牛肝菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上， 于 28恒温培养 4 天后， 置于 4冰箱中， 得到活化培养后的菌丝体。 0015 其中 ： 美味牛肝菌菌丝是指采集于陇南康县的美味牛肝菌Boletus edulis KX920NG 按常规方法经组织分离。

21、获得的美味牛肝菌菌丝 ； 美味牛肝菌Boletus edulis KX920NG 在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为 CCTCC NO ： M 2012113 （保藏单位地址 ： 中国 . 武汉 . 武汉大学 ； 保藏日期 ： 2012 年 4 月 13 日） ， 其分子生物学鉴定后的核酸序列提 交至 GenBank 的登录号为 JQ086386。 0016 接一环活化培养后的菌丝体至装有 10mL 种子培养基的试管中， 并置于恒温振 荡器上， 在 28条件下以 100 r/min 的速率进行振荡培养 4 天， 制得 pH 值为 5.07.0 的菌 种种子液。 0017 将菌种种子液按 5%。

22、 的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中， 并置于恒温振 荡器上， 在 28条件下以 100 r/min 的速率进行振荡培养 4 天， 即得发酵液 ； 发酵液在高速 冷冻离心机中于 5000r/min 离心 20min， 得到菌丝体 ； 菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱 于 60下烘干至恒重后磨成粉， 得到菌丝体干粉末。 0018 其中 ： 发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为 10%。 0019 在菌丝体干粉末中按 1 g ： 5 mL 的料液比加入去离子水， 在功率为 100W 的条件 下超声提取 20 min 后， 在温度为 70的条件下浸提次数 2 次， 每次 1h， 合并提取液， 得到多 糖浸。

23、提液。 0020 将多糖浸提液与正丁醇 - 三氯乙酸溶液按 1mL ： 1mL 的比例， 充分混合， 在转速 150 r/min 条件下， 振荡 15min， 再静置 45min， 用高速冷冻离心机 4000r/min 离心 20min， 除 掉变性蛋白质， 将水相再加入相当于其体积的正丁醇 - 三氯乙酸溶液， 反复多次直到上清 液与有机相中间有清晰的分界面为止， 视为蛋白质除尽， 即得多糖提取液。 0021 其中 ： 正丁醇 - 三氯乙酸溶液是指正丁醇与三氯乙酸按 5mL ： 1mL 混合而成的混合 液。 0022 在多糖提取液中按其体积的 2 倍加入质量浓度为 95% 的乙醇， 在 4下静。

24、置 24h， 得到沉淀物 A。 0023 将沉淀物 A 经高速冷冻离心机以 4000 r min 离心 10 min 后， 得到沉淀物 B， 该沉淀物 B 经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内， 经 50真空干燥至恒重， 即得美味 牛肝菌多糖。 说 明 书 CN 103554287 A 6 4/5 页 7 0024 采用苯酚 - 硫酸法测定美味牛肝菌多糖含量， 并按下式计算 ： 粗多糖含量 (mg/g 菌丝干重 )= 粗多糖总质量 (mg)/ 菌丝体干粉末质量 (g) 。 0025 实施例 2 一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法， 包括以下步骤 ： 制备马铃薯葡萄糖斜面培养基 ： 将马铃薯洗净去。

25、皮切碎， 按其质量的 6 倍加水煮沸 35min 后用纱布过滤， 得到滤液 A， 该滤液 A 补足至 1.0L 依次加入 10g 葡萄糖和 10g 琼脂， 使其 pH 值为 6.08.0， 在 100温度下充分加热溶解后分装， 在压强为 1.05Kg/cm2、 温度为 121的条件下灭菌 20min 即得。 0026 制备种子培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 6 倍加水煮沸 35min 后 用纱布过滤， 得到滤液 B， 该滤液 B 补足至 1.0L 加入 10g 葡萄糖， 使其 pH 值为 6.08.0， 在 100温度下充分加热溶解后分装， 在压强为1.05Kg/cm2、 温度。

26、为121的条件下灭菌20min 即得。 0027 制备发酵培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 6 倍加水煮沸 35min 后 用纱布过滤， 得到滤液 C， 该滤液 C 补足至 1.0L 加入 10g 葡萄糖， 使其 pH 值为 6.08.0， 在 100温度下充分加热溶解后分装， 在压强为1.05Kg/cm2、 温度为121的条件下灭菌20min 即得。 0028 真菌的发酵培养 ： 接一环美味牛肝菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上， 于 28恒温培养 10 天后， 置于 4冰箱中， 得到活化培养后的菌丝体。 0029 其中 ： 美味牛肝菌菌丝同实施例 1。 0030 接一环活化培养。

27、后的菌丝体至装有 10mL 种子培养基的试管中， 并置于恒温振 荡器上， 在28条件下以200 r/min的速率进行振荡培养10天， 制得pH值为5.07.0的菌 种种子液。 0031 将菌种种子液按 20% 的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中， 并置于恒温振 荡器上， 在 28条件下以 200 r/min 的速率进行振荡培养 10 天， 即得发酵液 ； 发酵液在高 速冷冻离心机中于 5000r/min 离心 20min， 得到菌丝体 ； 菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥 箱于 60下烘干至恒重后磨成粉， 得到菌丝体干粉末。 0032 其中 ： 发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为 30%。 0033。

28、 在菌丝体干粉末中按 1 g ： 20mL 的料液比加入去离子水， 在功率为 300W 的条件 下超声提取 10 min 后， 在温度为 90的条件下浸提次数 4 次， 每次 3h， 合并提取液， 得到多 糖浸提液。 0034 将多糖浸提液与正丁醇 - 三氯乙酸溶液按 1mL ： 1mL 的比例， 充分混合， 在转速 150 r/min 条件下， 振荡 15min， 再静置 45min， 用高速冷冻离心机 4000r/min 离心 20min， 除 掉变性蛋白质， 将水相再加入相当于其体积的正丁醇 - 三氯乙酸溶液， 反复多次直到上清 液与有机相中间有清晰的分界面为止， 视为蛋白质除尽， 即得。

29、多糖提取液。 0035 其中 ： 正丁醇 - 三氯乙酸溶液同实施例 1。 0036 在多糖提取液中按其体积的 4 倍加入质量浓度为 95% 的乙醇， 在 4下静置 24h， 得到沉淀物 A。 0037 将沉淀物 A 经高速冷冻离心机以 4000 r min 离心 10 min 后， 得到沉淀物 B， 该沉淀物 B 经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内， 经 50真空干燥至恒重， 即得美味 牛肝菌多糖。 说 明 书 CN 103554287 A 7 5/5 页 8 0038 采用苯酚 - 硫酸法测定美味牛肝菌多糖含量， 并按实施例 1 中的公式计算。 0039 实施例 3 一种美味牛肝菌菌丝多糖。

30、的提取方法， 包括以下步骤 ： 制备马铃薯葡萄糖斜面培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 5 倍加水煮沸 30min后用纱布过滤， 得到滤液A， 该滤液A补足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g琼脂， 使其 pH 值为 6.08.0， 在 95温度下充分加热溶解后分装， 在压强为 1.05Kg/cm2、 温度为 121 的条件下灭菌 20min 即得。 0040 制备种子培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 5 倍加水煮沸 30min 后用 纱布过滤， 得到滤液 B， 该滤液 B 补足至 1.0L 加入 8g 葡萄糖， 使其 pH 值为 6.08.0， 在 95 温度下充分加。

31、热溶解后分装， 在压强为 1.05Kg/cm2、 温度为 121的条件下灭菌 20min 即得。 0041 制备发酵培养基 ： 将马铃薯洗净去皮切碎， 按其质量的 5 倍加水煮沸 30min 后 用纱布过滤， 得到滤液 C， 该滤液 C 补足至 1.0L 加入 8g 葡萄糖， 使其 pH 值为 6.08.0， 在 95温度下充分加热溶解后分装， 在压强为 1.05Kg/cm2、 温度为 121的条件下灭菌 20min 即得。 0042 真菌的发酵培养 ： 接一环美味牛肝菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上， 于 28恒温培养 7 天后， 置于 4冰箱中， 得到活化培养后的菌丝体。 0043 其中 。

32、： 美味牛肝菌菌丝同实施例 1。 0044 接一环活化培养后的菌丝体至装有 10mL 种子培养基的试管中， 并置于恒温振 荡器上， 在 28条件下以 150 r/min 的速率进行振荡培养 7 天， 制得 pH 值为 5.07.0 的菌 种种子液。 0045 将菌种种子液按 12% 的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中， 并置于恒温振 荡器上， 在 28条件下以 150 r/min 的速率进行振荡培养 7 天， 即得发酵液 ； 发酵液在高速 冷冻离心机中于 5000r/min 离心 20min， 得到菌丝体 ； 菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱 于 60下烘干至恒重后磨成粉， 得到菌丝体干粉末。

33、。 0046 其中 ： 发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为 20%。 0047 在菌丝体干粉末中按 1 g ： 12mL 的料液比加入去离子水， 在功率为 200W 的条件 下超声提取 15 min 后， 在温度为 80的条件下浸提次数 3 次， 每次 2h， 合并提取液， 得到多 糖浸提液。 0048 将多糖浸提液与正丁醇 - 三氯乙酸溶液按 1mL ： 1mL 的比例， 充分混合， 在转速 150 r/min 条件下， 振荡 15min， 再静置 45min， 用高速冷冻离心机 4000r/min 离心 20min， 除 掉变性蛋白质， 将水相再加入相当于其体积的正丁醇 - 三氯乙酸溶液， 反复。

34、多次直到上清 液与有机相中间有清晰的分界面为止， 视为蛋白质除尽， 即得多糖提取液。 0049 其中 ： 正丁醇 - 三氯乙酸溶液同实施例 1。 0050 在多糖提取液中按其体积的 3 倍加入质量浓度为 95% 的乙醇， 在 4下静置 24h， 得到沉淀物 A。 0051 将沉淀物 A 经高速冷冻离心机以 4000 r min 离心 10 min 后， 得到沉淀物 B， 该沉淀物 B 经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内， 经 50真空干燥至恒重， 即得美味 牛肝菌多糖。 0052 采用苯酚 - 硫酸法测定美味牛肝菌多糖含量， 并按实施例 1 中的公式计算。 说 明 书 CN 103554287 A 8 。