复合胶原基组织工程支架及其制备方法 本发明属组织工程支架的制备。
胶原和粘多糖物质都是天然细胞外基质，在组织工程支架方面的研究中应用较广，其是构建人工皮肤、软骨、血管等组织工程器官的首选材料。但目前所应用的支架材料性能还不尽人意。
本发明的目的是提供一种复合胶原基组织工程支架及其制备方法，本发明是用于软组织细胞培养的组织工程支架，该支架提高了现有胶原材料的细胞粘附性能，降低了材料的细胞毒性并改善了支架材料的制备工艺。
本发明的重量组成是：胶原10份，硫酸软骨素1-5份，壳聚糖0.5-3份，聚乙烯醇0.5-2份。
复合胶原基组织工程支架的制备方法包括下述步骤：
(1)按计量配置固体含量为0.4-1.0％的胶原丙二酸溶胀液，用0.2M的醋酸溶液溶解壳聚糖，0.3％丙二酸溶液溶解聚乙烯醇，并将其加入胶原溶账液中，搅拌均匀得到胶原-壳聚糖-聚乙烯醇溶液；
(2)离心除去气泡，置于冻干容器中，控制冷冻温度-30℃至-10℃，得到多孔的胶原-壳聚糖-聚乙烯醇支架材料；
(3)用木瓜蛋白酶消化法从牛气管软骨中提取硫酸软骨素；将浓度为0.1-0.5％硫酸软骨素溶于交联溶液中，交联溶液为含有1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳化二亚氨(EDC)的2N-吗啡啉-乙磺酸(MES)的20-40％乙醇溶液；
(4)胶原-壳聚糖-聚乙烯醇支架材料浸泡在上述交联溶液中3-5小时，然后与硫酸软骨素结合得到复合胶原基组织工程支架，清洗；
(5)将得到复合胶原基组织工程支架再冷冻干燥，裁成所需的尺寸，灭菌，包装备用。
以上所说的清洗方法是用0.1M Na2HPO4清洗复合胶原基组织工程支架两小时，2MNaCl洗2小时，再用蒸馏水洗。
本发明得到的复合胶原基组织工程支架具有良好的物理、化学性能，生物相容性好，操作方便，并且可生物降解吸收；细胞培养实验表明，细胞在该支架中生长良好，无毒副作用；支架的孔径大小可以根据临床需要进行调节。本发明制备的组织工程支架可用于人工皮肤、软骨、血管等人工器官的构建，且成本低、方法简便易重复，具有较广泛的临床应用前景。
实例1：
将500g湿牛气管软骨脱脂粉碎，用含有木瓜蛋白酶的缓冲溶液在37℃下消化处理16小时，加入三氯醋酸至终浓度为15％(w/v),0℃沉降1小时，4℃,8000转/分钟离心30分钟除去蛋白质。上清液中加入NaOH和NaBH4至终浓度分别为0.5M和0.1M。4℃放置16小时，加入6MHCL进行中和。再加入三氯醋酸并离心除去蛋白质。上清液中加入5倍体积的100％乙醇，在-20℃下沉降16小时，4℃8000转/分钟离心30分钟，用70％乙醇洗所得的GAG并离心两次；用蒸馏水溶解并冷冻干燥。胶原溶胀液通过酶解法从牛肌键中提取，其固体含量为1.3％。
称取胶原溶胀液50g，用0.3％地丙二酸溶液作为分散液配成浓度为0.7％的溶液，搅拌均匀，离心除去气泡。称取0.06g壳聚糖溶于0.2M醋酸溶液中，0.06g聚乙烯醇溶于0.3％丙二酸溶液中，然后将其与胶原溶胀液混合，搅拌均匀并离心。将胶原溶胀液倒入冻干容器，用真空冷冻干燥机冻干成海绵状薄膜，厚度约为3mm。将该海绵状薄膜浸在200ml含有50mM MES的40％乙醇(pH5.5)中0.5小时。然后置于200ml含有0.25％(w/v)硫酸软骨素和30mM EDC的50mM MES的40％乙醇溶液中，反应4小时后，用0.1M Na2HPO4(pH9.1)清洗该海绵状薄膜两小时，2M NaCl洗2小时，再用蒸馏水洗，冻干并用γ-射线灭菌。
本发明最终得到的复合胶原基组织工程支架孔隙均匀，尺寸稳定，具有一定的韧性和强度。从图1中给出的复合胶原基组织工程支架的微观扫描电镜图(SEM)可以看出，该支架具有连续的三维纤维网络结构，孔径约为30-100μm。采用光电子能谱PHI5300 ESCA系统对材料表面的组成进行分析可知，壳聚糖的加入可使硫酸软骨素的结合量明显增加(见表1)；该复合胶原基组织工程支架材料具有很好的生物相容性，L929细胞在支架上培养7天后，细胞生长成片，图2、3是复合胶原基组织工程支架的微观扫描电镜图(SEM)，图中分别给出了细胞结合和未结合硫酸软骨素的复合胶原基组织工程支架中生长7天后的SEM图，结果表明，结合了硫酸软骨素的复合胶原基组织工程支架起到了促进细胞增殖的作用。
实例2：
硫酸软骨素和胶原溶胀液的提取如实例1。称取胶原溶胀液50g，用0.3％的丙二酸溶液作为分散液，配成浓度为0.6％的溶液，搅拌均匀，离心除去气泡。称取0.08g壳聚糖溶于0.2M醋酸溶液中，0.08g聚乙烯醇溶于0.3％丙二酸溶液中，并将其与胶原溶胀液混合，搅拌均匀并离心。将该溶胀液倒入冻干容器中，用真空冷冻干燥机冻干成厚约3mm的复合胶原基组织工程支架，将支架浸在200ml含有50mM MES的40％乙醇(pH5.5)中0.5小时，然后置于200ml含有0.20％(w/v)硫酸软骨素和30mMEDC的50mM的MES的40％乙醇溶液中，反应4小时后，用0.1MNa2HPO4(pH9.1)清洗2小时，2M NaCl洗2小时，再用蒸馏水洗并冻干，得到产品。
实例3：
硫酸软骨素和胶原溶胀液的提取如实例1。称取胶原溶胀液50g，用0.3％的丙二酸溶液作为分散液，配成浓度为0.8％的溶液，搅拌均匀，离心除去气泡。称取0.05g壳聚糖溶于0.2M醋酸溶液中，0.06g聚乙烯醇溶于0.3％丙二酸溶液中，并将其与胶原溶胀液混合，搅拌均匀并离心。将该溶液倒入冻干容器，用真空冷冻干燥机冻干成厚约3mm的复合胶原基组织工程支架，将该支架浸在200ml含有50mM MES的40％乙醇(pH5.5)中0.5小时，然后置于200ml含有0.3％(w/v)硫酸软骨素和30mMEDC的50mM MES的40％乙醇溶液中，反应4小时后，用0.1M Na2HPO4(pH9.1)清洗基质2小时，2M NaCL洗2小时，再用蒸馏水洗并冻干得到产品。
表1 ESCA分析基质表面元素组成 C N O S 胶原-CS 胶原-CS-壳聚糖 空白 67.46％ 62.71％ 74.80％ 19.52％ 23.28％ 15.78％ 12.02％ 12.57％ 9.25％ 1.00％ 1.43％ 0.17％