发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，它是包含乙肝表面
抗原的脂质体，它也可以包括或不包括免疫调节分子，它既能对HBV感染引起的
乙型肝炎发挥有效的治疗作用，又能对HBV再感染起到良好的预防作用。
本发明的另一目的是提供一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的制备方法。
为达上述目的本发明采用的技术方案是，将脂质体作为载体和佐剂，与乙肝表
面抗原结合在一起制备成的一种免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，这种疫苗既能激发
机体体液免疫反应，产生保护性抗体，清除血循环中的病毒，又能激发CTL的活性，
产生很强的细胞免疫反应，消灭肝细胞内的病毒，从而达到彻底清除病毒，治疗慢
性乙肝和乙肝病毒携带者。
该疫苗可以加免疫调节剂，如胸腺肽、白细胞介素-2、LAK细胞、免疫核糖核
酸、特异性转移因子、肝炎灵、猪苓多糖、香菇菌多糖、云苓、辅酶Q10、左旋咪
唑、脂质A、MPL、QuilA、BCG等。也可以不加免疫增强剂。
本发明的特征是所述的免疫脂质体治疗性乙肝疫苗中可以加入维生素E等抗氧
化剂，加入负电荷磷脂，防止脂质体凝聚、融合，改变剂型，制备冻干剂，避免渗
漏，延长脂质体保存时间。
本发明所述的乙肝表面抗原包括S，S+前S1，前S1+前S2，S+前S2，S+前S1+
前S2中的任一种。
本发明优选的乙肝表面抗原包括S+前S2、S+前S1+前S2，本发明最佳的乙肝
表面抗原是S+前S1+前S2。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含乙肝表面抗原的量是：1-80微
克。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含乙肝表面抗原的优选量是：
20-30微克。
本发明所涉及的脂质体是由磷脂、非磷脂、固醇类及它们的衍生物和膜材组成。
目前用于制备脂质体的有卵磷脂、豆磷脂，磷脂酰乙醇胺、胆固醇、脑磷脂、二棕
榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰脂质体、B-谷甾醇、牛胆酸钠、
蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰-DL-a磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘
磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、硬脂酰胺、二氧乙烯十六烷基
醚和四氧乙烯十二烷基醚等均可用于本发明。
本发明所涉及的膜材包括但不限于胆固醇、十八胺、磷脂酸等。胆固醇可以调
节双分子层流动性、通透性等，十八胺、磷脂酸可以改变脂质体表面电荷性质。
本发明优选的脂质体球径为20～5000nm，本发明较优选的脂质体球径是
100～200nm和950-1050nm。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含脂质体量0.3-1.5ml。
本发明免疫脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中含脂质体优选的量是0.5-1.0ml。
脂质体的制备工艺是本领域的技术人员所熟知的，其基本原理都是将油性材料
与水性防料经过适当处理后形成油包水的制剂，但包裹物质的性质可能具有较大的
差别，如化学合成物质，有机物质；生物物质如蛋白、多肽及核酸等。后者在处理
过程中较易受到制备条件的影响，如温度、时间、振荡及酸碱度等因素的影响。治
疗性乙肝疫苗属于生物制剂中的多肽。常规的脂质体制备方法，象薄膜法、逆相蒸
发法、加压挤出法、熔融法及冻干水化法或改进均可用于本发明制备免疫脂质体治
疗性乙肝疫苗。
本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的优选的制备工艺是逆相蒸发法、冻干水
化法。本发明最优选的脂质体的制备工艺是冻干水化法。
本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的冻干水化法制备工艺包括如下步骤：
(1)将脂质体、膜材及附加剂或免疫调节分子以摩尔比1∶1∶1溶于溶媒中，置
于旋转蒸发器中，除去有机溶媒，旋转蒸发形成磷脂膜；
(2)加入磷酸缓冲液，40-60℃，超声3-8分钟，形成脂质体悬液；
(3)将脂质体悬液与乙肝抗原溶液以摩尔比3∶1混合，加入冷冻保护剂，进行冷
冻干燥；
(4)采用湿热法或钴照射等方法灭菌，得到冻干粉剂；
(5)加无菌水、震荡、再水化融合；
(6)得到免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗。
本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的逆相蒸发法制备工艺包括如下步骤：
(1)将脂质体、膜材和附加剂或免疫调节分子以摩尔比1∶1∶1溶于溶媒中，加
入乙肝抗原溶液，40-60℃，短时超声3-8分钟，得到稳定的油包水乳液；
(2)40-60℃，减压蒸发，得到胶态物质；
(3)加入磷酸缓冲液，40-60℃旋转蒸发，减压蒸发10-20分钟，除去微量有机溶
媒，得到脂质体水性混悬液，放置20-40分钟，透析20-30小时，除去游离的未包
入脂质体的乙肝抗原；
(4)采用湿热法或钴照射等方法灭菌；
(5)得到免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗。
本发明的优点是本发明的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，它既能对HBV起到
良好的预防作用，又能对HBV感染引起的乙型肝炎发挥有效的治疗作用。这种疫
苗既能激发机体体液免疫反应，产生保护性抗体，清除血循环中的病毒，又能激发
CTL的活性，产生很强的细胞免疫反应，消灭肝细胞内的病毒，从而达到彻底清除
病毒，治疗慢性乙肝和乙肝病毒携带者。
本发明制备的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗可以采用皮下或静脉注射给药。
为了更好地理解本发明的技术方案和有益效果，下面结合具体的实验及实验结
果对本发明做进一步阐述。
实验一：免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的制备工艺对疫苗诱导能力的影响
我们在实验中摸索了几种制备工艺对抗原物质活性的影响，尤其是监测其免疫
诱导活性，实验结果证明应选择制备过程相对柔和、无剧烈的理化条件改变的方法。
我们以小鼠注射疫苗后足趾肿胀程度做为判断免疫反应强度的指标。其基本原理是
小鼠第一次接种疫苗后足趾，体内产生免疫记忆反应，再次借助同一抗原物质则产
生强烈的免疫应答。抗原在脚掌部位注射，因此处富含淋巴组织，极易诱导细胞免
疫反应，通过注射局部的肿胀程度判断免疫反应的强度。
实验方法：测量记录小鼠左前足趾厚度后，于左前足趾处接种治疗性乙肝疫苗
0.5ml，10天后再接种同样浓度的疫苗0.5ml，第二次接种3天后测量左前足趾厚度，
并计算足趾肿胀指数，即实验后厚度除以实验前厚度，肿胀指数越高，则表示局部
引起的免疫反应越强。
实验结果见表1
表1 免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的制备工艺对疫苗诱导能力的影响
制备方法
实验组例数(只)
足趾肿胀系数
薄膜法
10
0.58±0.22
逆相蒸发法
10
0.24±0.09
加压挤出法
10
0.67±0.21
熔融法
10
0.43±0.16
冻干水化法
10
0.75±0.12
实验结果表明：几种方法与对照相比均可以产生显著差异，冻干水化法引起的免疫
反应最强烈，是本发明的最优选的方法，逆相蒸发法虽然引起的免疫反应最弱，但
与正常对照相比，仍有显著差异，它的最大的优点是工艺过程相对较简单，易实现
大规模生产，仍是本发明优选的方法之一。
实验2脂质体类型对乙肝疫苗免疫诱导能力的影响
脂质体是由一层或多层类脂分子层所组成的封闭小囊，在其双分子层中或层间
可包含药物，其结构类似细胞膜。根据其球径大小可以分为四类(1)单室脂质体，
球径≤100nm；(2)大单室脂质体，球径100-200nm；(3)多室脂质体，球径
200-1000nm；(4)大多孔脂质体，球径约为1000-5000nm。不同球径的脂质体包裹
药物的量是不同的，且脂质体体积不同，其进入体内后的分布也是不同的。作为免
疫治疗制剂，我们期望其进入体内后优先被免疫辅助细胞/抗原提呈细胞即巨噬细胞
吞噬。我们以不同球径的脂质体和本发明的乙肝抗原相组合所诱发的特异性抗表面
抗原抗体的酶连吸附免疫反应做为指标进行实验。其中表面抗原标准品由深圳康华
公司提供。小鼠抗人IgG酶标记抗体购自华美生物公司。
实验结果见表2。
表2 脂质体球径与免疫诱导能力
脂质体球径(nm)
特异性抗体滴度(HBsAb)
≤100
1∶1000
100-200
1∶100,000
800-1200
1∶100,000
950-1050
1∶120,000
1200-5000
1∶10,000
单纯乙肝抗原对照
≤1∶1000
空白脂质体对照
≤1∶10
实验证明，球径在1000±200nm左右的脂质体和150 +50nm左右最易被巨噬细胞
吞噬，并引发强烈的免疫反应，较佳的球径是1000±200nm和150 +50nm，最优的球
径是950-1050nm。
实验3免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的保存时间对乙肝疫苗诱导能力的影响
脂质体类制剂由于其本身为油与水的结合物，在保存过程中必然纯在内容物的
渗漏现象，如何延缓、减少包封物的渗漏和脂质体的解离，是决定制剂质量的重要
技术指标。通过本发明方法制备的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗，由于抗氧化剂及
制备工艺及剂型的改进，大大延长了保存时间。我们用不同保存时间的本发明的免
疫性脂质体治疗性乙肝疫苗免疫小鼠0.5ml，10天后再接种同样浓度的疫苗1ml，
第二次接种4天，取其脾细胞体外培养，并加入特异性表面抗原。根据其淋巴细胞
增殖程度可以判定疫苗免疫效果。淋巴细胞增殖采用同位素氚标记的胸腺嘧啶的渗
入率为指标。
实验动物：Balb/c小鼠，由吉林大学基础医学院动物中心提供。
试剂：乙肝病毒表面抗原购自军事医学科学院5所
实验结果如下：
表3 免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗的保存时间对其免疫效果的影响
免疫性脂质体治疗性
乙肝疫苗的保存时间(天)
淋巴细胞增殖率(SI)
1
10.15
5
11.23
10
10.56
30
8.07
60
6.59
90
3.34
180
2.22
实验结果表明，本发明的方法制备的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗有较好疗效
的保存时间可以达到30天，即使60天也有一定的免疫效果。
实验4乙肝疫苗中所含的不同抗原成分对小鼠免疫反应的影响
乙肝疫苗中所含的抗原成分可以包括白蛋白，S蛋白、前S2及前S1蛋白。将
球径在1000±200nm左右的脂质体分别与各种组合的乙肝抗原结合，给小鼠接种，观
察抗体滴度及淋巴细胞增殖率。结果如表4。
表4 不同的乙肝抗原与脂质体结合对免疫效果的影响
组别
抗原类型
淋巴细胞增殖率
(SI)
抗体滴度(HBsAb)
1
S
9.14
1∶10,000
2
S+前S1，
9.15
1∶10,000
3
前S1+前S2
9.33
1∶100,000
4
S+前S2
13.96
1∶100,000
5
S+前S1+前S2
14.58
1∶100,000
6
白蛋白
1.36
＜1∶100
实验结果表明，1-5组间抗体滴度无显著差异；淋巴增殖率1、2、3组与4、5组比
较有显著差异，1、2、3组间淋巴增殖率无显著差异，4和5组间淋巴增殖率无显著
差异，1-5组与第6组比较都有显著性差异。
1-5组的淋巴增殖率及抗体滴度与6组比较均有显著差异。其中淋巴细胞增殖
率及抗体滴度较高的是S+前S2、S+前S1+前S2，本发明最佳的乙肝表面抗原是S+
前S1+前S2。
实验5单位剂量的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗中不同乙肝抗原含量和脂质体含
量引起的免疫诱导反应。
我们在实验中设计了以下的实验组合，通过实验4所述的免疫学常规技术淋巴
细胞增殖率确定单位剂量免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗引起免疫反应的不同组分组
合的用量范围和最佳的用量范围。
实验结果如表5
表5引起免疫反应的免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗
不同组分组合的用量范围和最佳的用量范围
单位剂量中
脂质体含量
淋巴细胞
增殖率
单位剂量中
乙肝抗原含量ug
0.3ml
1ml
0.8ml
0.5ml
1.5ml
1
8.33
8.98
9.01
8.74
8.98
10
10.02
10.23
10.23
10.22
10.27
20
10.15
11.96
12.26
11.87
12.08
25
10.21
12.56
12.58
11.99
12.37
30
10.27
12.39
12.44
12.45
12.36
80
11.03
12.35
12.45
12.30
12.34
实验结果表明：本发明免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗可以引起有效免疫反应单
位剂量中乙肝抗原的优选的含量范围是1-80ug，最优选的含量范围是20-30ug，脂
质体的优选的含量范围是0.3ml-1.5ml最优选的含量范围是0.5ml-1.0ml。本发明的
免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗单位剂量中乙肝表面抗原的体积其相对脂质体可以不
计。
实验6治疗性乙肝疫苗的临床试用结果
为了验证治疗性乙肝疫苗的临床效果，我们与国内具有完备检验条件和技术力
量的防疫站、医院进行合作，对其效果进行观察。
我们随机选择乙肝病毒携带患者，并且其体内乙肝病毒处于复制期，标准为血清
检测表面抗原阳性，e抗原阳性，核心抗原阳性(又称“大三阳”)，病程2年以上，
无急性发作征象，肝功正常。所有患者均进行定量PCR检测。对照组为裸疫苗接种。
为保证观测结果的客观性，采用双份血清检测，即患者治疗前的血清与治疗后血清
在相同条件下同时检测，以排除试剂、季节及操作人员的主观误差。
实验结果如下
表6免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(广东卫生防疫站)
组别
例数
表面抗原
阴转例数(％)
表面抗体
阴转例数
(％)
e抗原
阴转例数
(％)
HBVDNA
阴转例数
(％)
治疗结束
76
12(15)*
10(13)*
40(52)*
36(47)*
治疗后3个月
76
22(28)*
19(26)*
48(63)*
42(55)*
治疗后6个月
76
23(30)*
20(26)*
49(64)*
47(61)*
对照治疗结束
70
3(4)
3(4)
17(24)
14(20)
对照治疗3个月
70
4(5)
3(4)
16(22)
15(21)
对照治疗6个月
70
4(5)
4(5)
16(22)
15(21)
*p＜0.05
表7免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(临沂市人民医院)
组别
例数
表面抗原
阴转例数(％)
表面抗体
阴转例数
(％)
e抗原
阴转例数
(％)
HBVDNA
阴转例数
(％)
治疗结束
52
10(19)*
10(19)*
22(56)*
23(44)*
治疗后3个月
52
18(34)*
15(28)*
31(59)*
36(69)*
治疗后6个月
52
19(36)*
14(26)*
30(58)*
34(65)*
对照治疗结束
41
2(3)
2(3)
8(15)
9(17)
对照治疗3个月
41
3(5)
3(5)
9(17)
9(17)
对照治疗6个月
41
3(5)
2(3)
7(13)
8(15)
*p＜0.05
表8免疫性脂质体治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(邵东防疫站)
组别
例数
表面抗原
阴转例数(％)
表面抗体
阴转例数
(％)
e抗原
阴转例数
(％)
HBVDNA
阴转例数
(％)
治疗结束
142
24(17)*
19(14)*
93(52)*
88(62)*
治疗后3个月
142
36(26)*
37(26)*
96(63)*
82(58)*
治疗后6个月
142
38(27)*
37(26)*
90(64)*
86(61)*
对照治疗结束
65
2(3)
3(5)
8(13)
11(17)
对照治疗3个月
65
3(5)
3(5)
9(15)
10(16)
对照治疗6个月
65
2(3)
3(5)
11(17)
9(15)
*p＜0.05
为了更好地理解本发明的实质，下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详
细的说明。