半抗原标记的肽 本发明涉及一种产生半抗原标记肽的方法，按此方法产生的半抗原标记肽及其在免疫检测方法中的应用。
体液中，特别是人类血清中免疫球蛋白的测定用于诊断微生物感染，特别是病毒感染，例如HIV、肝炎病毒等。通常应用能与特异免疫球蛋白反应的一种或数种抗原与待检样品进行反应，以检测特异免疫球蛋白的存在。测定液体样品中特异免疫球蛋白的方法必须灵敏、可靠、简单易行且又快速。
近几年来，已经发展了越来越多的以非放射活性标记基团为基础的检测方法，在这些检测方法中，待测样品中的分析物，比如一种特异抗体，可在光学(例如发光的或荧光的)检测法、NMR-活性或金属沉淀检测方法的帮助下检测出来。
EP-A-0 307 149描述一种用两种重组多肽做为抗原的检测抗体的免疫学检测方法，其中一种多肽固定于固相上，另一种携带一个信号基团，两种多肽可在不同的菌内进行表达以提高检测的特异性。
EP-A-0 366 673中描述一种检测样品中抗体的方法。在此方法中，样品通过与纯化的标记抗原和同样纯化地与固相固定的抗原起反应来检测抗体。例如，公开了人类IgG做为一种抗原。
EP-A-0 386 713中叙述了一种应用两种固体支持物来检测抗HIV抗体的方法。在这一方法中，将不同的HIV抗原固定在这两种固体支持物上，且每种支持物都与样品及一种标记的HIV抗原相接触，这样通过至少一个实验中的阳性反应检测出抗体的存在。公开了重组产生的多肽作为HIV抗原。
EP-A-0 507 586叙述了一种检测特异免疫球蛋白的免疫学检测方法，此方法中将能与免疫球蛋白结合的两种抗原与样品相接触，第一种抗原携带一种适合与固相支持物相连接的基团，第二种抗原携带一种信号基团。信号基团可以是直接标记基团，比如一种酶、色原、金属颗粒，也可以是间接标记基团，即与抗原相连的标记基团可以与其受体相反应，而其受体携带一种产生信号的基团。提到荧光衍生物作为间接标记基团的例子，其受体是与一种酶相偶联的抗体。公开了如乙肝表面抗原一类的多肽作为抗原。通过衍生作用将SH基团导入这种抗原以与荧光剂相连。
EP-A-0 507 587描述了一种检测IgM抗体的特异方法。此方法中样品与可与待测抗体直接结合的标记抗原及可与待测抗体直接结合并能与固相相连的二抗一同孵育。
现有技术中测定抗体的免疫学方法中，通常所用的多肽抗原一般是用重组DNA的方法生产的。然而，使用此类多肽抗原时可能带来许多问题。这些重组多肽常常只能以融合多肽的形式产生，这样在检测中融合部分可导致假阳性结果。另外由重组表达产生的多肽在样品溶液中不很稳定并且易于凝聚。重组表达方法的另一个缺点是不能选择性地、可重复地将标记基团导入多肽。
此外，生产重组多肽抗原耗资高，免疫反应中大量不同的重组多肽抗原可发生大的变异。
因此，本发明的目的是提供一种产生免疫检测用抗原的简单有效的方法，本方法至少部分消除现有技术中已知抗原的缺点。另外，本方法还可选择性地、可重复地将标记基团导入抗原。
通过产生半抗原标记肽的方法达到本发明的目的，该方法具有以下特征：
(a)在固相上由其侧支反应性基团被保护基团阻断的氨基酸衍生物合成含有目标氨基酸序列的肽，选择伯氨侧支基团上的保护基团使得需要时可被选择性地裂解掉，
(b)除去保护基团以形成最少一个游离的伯氨基团，
(c)将半抗原-活性酯衍生物与肽上至少一个游离伯氨基团相偶连，并且
(d)如果需要将仍保留的保护基团裂解掉，
半抗原选自甾醇、胆酸、性激素、类皮质激素、强心甾、强心甾糖甙、蟾蜍二烯内酯、甾类皂角甙元及甾类生物碱。
根据本发明的方法产生的肽，最大长度优选50个氨基酸，特别优选30个氨基酸，它们十分适合于免疫检测方法并特别适于特异免疫球蛋白的测定。令人惊异地发现，根据本发明的方法产生的肽尽管携带着庞大的半抗原标记基团，但其对待测免疫球蛋白具有很高的亲和力和特异性。
本发明的方法能够从结合位点和数量上有选择地导入半抗原标记基团。在本发明的肽合成中，通过在氨基酸衍生物的伯氨基团上应用特定的保护基团来特异性选择肽上选择性除去保护基团后可与半抗原反应的位点，这种方法是可行的。这样就可提高检测的可重复性和敏感性。
本发明的方法的另一个优点是使用肽抗原能够测定出象IgM、IgG、IgE、IgA的所有类别抗体。这一检测方法使用所限定的小而稳定且不易凝聚的抗原，还对干扰不敏感。
根据本发明的方法与肽相偶联的半抗原是一种选自甾醇、胆酸、性激素、类皮质激素、强心甾、强心甾糖甙、蟾蜍二烯内酯、甾类皂角甙元和甾类生物碱的含有甾类骨架的分子。这些半抗原能够与特异受体结合，例如，与对抗半抗原的抗体或抗体片断结合。特别优选从强心甾和强心甾糖甙中选择出的半抗原。这些半抗原的代表是：异羟洋地黄毒甙元、洋地黄毒甙元、芰毒甙元、毒毛旋花甙元，地高辛、洋地黄毒甙、地托辛(ditoxin)和毒毛旋花甙K，优选异羟洋地黄毒甙元和地高辛。
本发明的方法中，半抗原活性酯衍生物和肽上的氨基末端和/或游离伯氨侧支基团相连。本发明中“活性酯”这一术语包括不会与肽的其它反应性基团产生干扰性副反应且能与游离氨基基团反应的活化酯基团。优选使用N-羟基-琥珀酰亚胺酯做为活性酯衍生物。半抗原活性酯衍生物的合适的代表为：地高辛-4-戊二酸半酯-N-羟基-琥珀酰亚胺酯、异羟洋地黄毒甙元-3-羧甲基醚-N-羟基琥珀酰亚胺酯、异羟洋地黄毒甙元-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、异羟洋地黄毒甙元-3-琥珀酸半酯-N-羟基琥珀酰亚胺酯、洋地黄毒甙-4-戊二酸半酯-N-羟基琥珀酰亚胺酯和洋地黄毒甙元-3-琥珀酸半酯-N-羟基琥珀酰亚胺酯。这些半抗原衍生物均由Boehringer mannheim Company GmbH(MannheimGER)销售。除了N-羟基琥珀酰亚胺酯外，也可能使对硝基苯酯、五氟苯酯、咪唑酯或N-羟基苯并三唑酯。
在本发明的方法中，含有所需氨基酸序列的肽是优选使用市售肽合成仪(例如、应用生物系统中的A 431或A 433)在固相上合成的。根据已知的方法用氨基酸衍生物优选从肽的羧基末端开始合成肽。优选使用偶联所需的氨基末端被芴基甲氧羰基(Fmoc)衍生化的氨基酸衍生物。所用氨基酸的反应性侧支基团含有肽合成完成后易于被除去的保护基团。这种保护基团的优选代表是：三苯甲基(Trt)、叔丁基醚(tBu)、叔丁基酯(O-tBu)、叔丁氧羰基(Boc)或2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)。位于肽上准备后期与半抗原进行衍生化位置上的含有伯氨基分支基团的赖氨酸或其它氨基酸衍生物的氨基侧链，与在特定反应条件下(比如，在酸性条件下)能定量除去的第一种氨基保护基团相偶联。酸不稳定性保护基团的适宜代表是BOC。含有伯氨侧支基团而不希望与半抗原偶联的赖氨酸或其他氨基酸残基的侧支基团与在第一种氨基保护基团可被除去的条件下本身不被除去的第二种氨基保护基团相偶联。在肽与固相分离及所有其他保护基团从肽上裂解下来的条件下，优选第二种保护基团仍是稳定的。这种第二保护基团的代表是象苯乙酰的耐酸保护基团。除了20种天然氨基酸外，肽也可以含有人工合成的氨基酸，例如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、正亮氨酸或鸟氨酸。这些人工合成的氨基酸以类似于天然氨基酸的保护方式用于合成肽。
合成结束后，包括第一氨基保护基团在内的位于半抗原所要偶联位置上的保护基团，在任选地肽从固相上释放下来之后被除去。然后这样得到的产品优选使用HPLC进行纯化。随后通过肽与所需的半抗原活性酯衍生物反应将半抗原标记物引入肽，半抗原活性酯衍生物与游离伯氨基团，即与肽的氨基末端基团或/和氨基侧支基团发生反应。每个游离的伯氨基团优选使用1.5至2.5当量的活性酯。然后产物经HPLC进行纯化。
如果肽仍然含有被第二保护基团如苯乙酰衍生的氨基基团，那么在合成的最后一步将这些保护基团除去。例如室温下，可在含有机溶剂的水溶液中用固定化或溶解的毒霉素G酰胺酶除去苯乙酰保护基团。
如果通过本发明的方法生产的肽含有分子内部的二硫键，那么在合成结束后在除去最后一个氨基酸N-末端的Fmoc保护基团之前，用(例如)六氟异丙醇/二氯甲烷中的碘(Kamber andHiskey in Gross E.and Meienhofer J.，The Peptides，AcademicPress，New York，1981，Pages 145-147)在固相上将这种肽序列氧化，然后再除去N-末端的Fmoc保护基团。
优选合成的肽含有一个免疫活性表位区，即抗体结合的肽序列，和一个间隔区。这样至少一个半抗原标记物优选与间隔区相偶联。标记物位于间隔区的肽在免疫检测中常具有较好的敏感性。
1至10个氨基酸长度的间隔区由于含有电荷或/和可形成氢键，因而具有稳定化和加溶的双重作用。另外，它可以在空间上促进几种受体，比如高分子量受体结合到半抗原标记的肽上。间隔区的氨基酸优先选自甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基已酸、赖氨酸和具有NH2-〔(CH2)nO〕x-CH2-CH2-COOH结构的化合物，其中n是2或3，X是1至10。另外，间隔区优选含有至少一些人工合成的氨基酸衍生物。间隔区位于肽的氨基末端或/和羧基末端。
根据本发明方法合成的肽优选含有来自病原体，例如细菌、病毒和原生物，或来自自体免疫抗原的表位区。免疫活性表位区优选是从病毒抗原，比如HIVI、HIVzzII、HIV O亚型或丙型肝炎病毒(HCV)的氨基酸序列衍生而来。
HIV I、HIV II或HIV O亚型的表位区优选自gp32、gp41、及gp120。HCV表位优选自非结构蛋白区HS3、NS4或NS5的核心/EnV。
HIV I、HIV II或HIV O亚型表位区的氨基酸序列特别优先选自以下氨基酸序列或其长度至少为6个氨基酸，优选至少8个氨基酸的部分氨基酸序列：NNTRKSISIG PGRAFYT (I)NTTRSISIGP GRAFYT (II)IDIQEERRMR IGPGMAWYS (III)QARILAVERY LKDQQLLGIW GASG (IV)LGIWGCSGKL ICTTAVPWNA SWS (V)KDQQLLGIWG SSGKL (VI)ALETLLQNQQ LLSLW (VII)LSLWGCKGKL VCYTS (VIII)WGIRQLRARL LALETLLQN (IX) 和QAQLNSWGCA FRQVCHTTVP WPNDSLT (X)
I至III的氨基酸序列是从HIV I的gp120区衍化而来，IV至IX的氨基酸序列是从HIV I的gp41区衍化而来，X的氨基酸序列是从HIV II的gp32区衍化而来。I至X的氨基酸序列还显示在序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10中。第V、VIII和X的氨基酸序列都含有两个以二硫键形式相连的半胱氨酸。这些序列优选含有一个如上文定义的N-末端或/和一个C末端间隔区，该间隔区携带一个半抗原标记物，优选异羟洋地黄毒甙元或地高辛标记物，特选优选异羟洋地黄毒甙元-3-羧甲基醚标记物。位于表位区内的赖氨酸残基也可任选地以被标记的形式出现。
HCV表位区的氨基酸序列优先选自以下的氨基酸序列或其长度至少为6个氨基酸、优选至少8个氨基酸的部分序列：SRRFAQALPV WARPD (XI)PQDVKFPGGG QIVGGV (XII)EEASQHLPYI EQ (XIII)QKALGLLQT (XIV)SRGNHVSPTH YVPESDAA (XV)PQRKNKRNTN RRpQDVKFPGGGQIVGVV (XVI)和AWYELTPAET TVRLRAYMNT PGLPV (XVII)XI序列是从HCV的NS5区衍化而来，XII和XIV序列是从HCV的核心区衍生而来，XIII、XIV XV序列从NS4区、XVII是从HCV的NS3区衍化而来。氨基酸序列XI至XVII也显示在序列表SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.17中。具有上述表位区的肽优选还含有一个携带半抗原标记物的间隔区。
本发明另外一个主题是一种最大长度为50个氨基酸、优选30个氨基酸的半抗原标记肽，其氨基末端或/和氨基侧支基团至少与一个半抗原活性酯衍生物相偶联。半抗原优选为异羟洋地黄毒甙元或地高辛，活性酯优选为N-羟基琥珀酰亚胺酯。
本发明的肽优选含有一个能与来自如人类血清的抗体反应的免疫反应表位区和一个携带至少一个半抗原标记物的非免疫反应间隔区。间隔区位于肽的氨基末端，其长度为1至10个氨基酸。表位区优选是从HIV I、HIV II或HCV(包括其变型如亚型，例如HIV的O亚型)的氨基酸序列衍化而来，是I至XVII氨基酸序列或其部分氨基酸序列之一。
本发明也涉及将半抗原标记肽作为抗原应用于样品液中特异抗体的测定。优选测定能指示微生物感染，比如细菌、病毒或原生动物感染的抗体。特别优选测定针对病毒的抗体，比如针对HIV或肝炎病毒的抗体。待测样品液优选血清，特别优选人类血清。另外，优选在桥式(bridge)检测模式的免疫方法中使用本发明的半抗原标记肽。
本发明也涉及一种测定样品液中特异抗体的免疫学方法，这一方法具有以下特征：样品液与(a)一种针对待测抗体且含有以上所定义的半抗原标记肽的第一标记抗原，(b)一种携带信号产生基团的半抗原受体共同孵育，通过与所述肽的结合来测定抗体。优选使用用地高辛或异羟洋地黄毒甙元标记的肽作为第一抗原，抗异羟洋地黄毒甙元或/和地高辛的抗体作为受体。本文中“抗体”这一术语也包含抗体片断，例如Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2片断，或者其他抗体片断，比如被遗传工程修饰过的片断。受体与一种信号产生基团相偶联，优选酶类，例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶或Q-β-复制酶。但信号产生基团也可以是一种产色素的、放射活性或NMR活性基团或是金属颗粒(比如金颗粒)。信号产生基团优选为酶类。
本发明中的免疫测定方法实际上可根据任何已知的检测模式进行，例如具有单一反应相的同质免疫测定法或具有1个以上反应相的异质免疫测定法。优选使用异质检测方法，其中抗体的检测是在固相存在的条件下进行的。这种检测方式的一个实例是所谓的双抗原桥式检测设计。这样在固相存在的条件下，样品液与第一抗原及针对待测抗体的第二抗原共同孵育，第二抗原能够(a)固定于固相上，或(b)以能与固相结合的形式存在。通过测定固相上或/和液相中的标记物来检测样品液中的待测抗体。第二抗原优选用生物素标记，且能与被链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包被的固相相结合。优选被生物素标记的肽作为第二抗原。
优选检测步骤包括：将第一抗原和固相上的第二抗原与样品液相混合，以获得一种含有第一抗原、抗体和与固相结合的第二抗原的标记的固定化复合物。与其他测定抗体的检测方式相比，桥式检测方式提高了检测的敏感性和特异性，即可检测出IgG、IgM、IgA和IgE等所有类别的免疫球蛋白且使非特异性反应降低。如果检测步骤分为两步，双抗原桥式检特异性和敏感性可进一步提高，第一步将第一和第二抗原与样品液混合，第二步加入携带信号产生基团的第一抗原的半抗原标记物的受体。
将固相结合的肽和半抗原标记的肽作为抗原的双抗原桥式检测方式的另一个优点是，作为Hook效应的结果，即通过提高每个肽上标记基团的数量，最好是2至10个标记基团，可降低含有高滴度待测抗体样品的假阴性评估结果。与携带直接可检测的标记基团的检测方法相比，增加每个肽上半抗原标记基团的数目通过受体的信号放大作用可提高Hook敏感性。
而本发明的另一主题是检测特异抗体的免疫检测方法中的试剂，它至少含有一个本发明的半抗原标记肽，与待测抗体相反应。如果这种试剂用于双抗原桥式检测，那么它优选包括(a)半抗原标记肽，(b)携带一个信号产生基团的半抗原受体，和(c)与固相结合或以能与固相结合的形式存在的可与待测抗体反应的另一种抗原。半抗原优选为强心甾或强心甾糖甙，特别是地高辛或异羟洋地黄毒甙元，半抗原受体优选抗半抗原的抗体，信号产生基团优选酶类，另一种抗原优选为被生物素标记的且能与被链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包被的固相相结合。
通过以下的实施例和序列表进一步描述本发明。
SEQ ID NO.1：显示来自HIV I gp120区表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.2：说明来自HIV I gp120区另一个表位的氨基酸列；
SEQ ID NO.3：来自在HIV I和HIV I O亚型的gp120区另一表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.4：来自HIV I gp41区表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.5：来自HIV I gp41区另一个表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.6：来自HIV I gp41区又一个表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.7：来自HIV I O亚型gp41区表位的氨基酸序列
SEQ ID NO.8：来自HIV I O亚型gp41区另一个表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.9：来自HIV I O亚型gp41区又一个表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.10：来自HIV II gp32区表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.11：来自HCV NS5区表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.12：来自HCV 核心区表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.13：来自HCV NS4区表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.14：来自HCV NS4区另一个表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.15：来自HCV NS4区又一个表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.16：来自HCV 核心区另一个表位的氨基酸序列；
SEQ ID NO.17：来自HCV NS3区表位的氨基酸序列。
实施例1
半抗原标记肽的产生
在一批肽合成仪上，例如来自应用生物系统的A431或A433合成仪上按芴基甲氧羰基(Fmoc)固相肽合成法合成半抗原标记肽。为产生半抗原标记肽，使用4当量如表1所示的各种氨基酸衍生物：
表 1
A Fmoc-Ala-OH C Fmoc-Cys(Trt)-OH D Fmoc-Asp(OtBu)-OH E Fmoc-Glu(OtBu)-OH F Fmoc-Phe-OH G Fmoc-Gly-OH H Fmoc-His(Trt)-OH I Fmoc-Ile-OH K1 Fmoc-Lys(苯乙酰)-OH K2 Fmoc-Lys(Boc)-OH K3 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH L Fmoc-Leu-OH M Fmoc-Met-OH N Fmoc-Asn(Trt)-OH P Fmoc-Pro-OH Q Fmoc-Gln(Trt)-OH R Fmoc-Arg(pmc)-OH S Fmoc-Ser(tBu)-OH T Fmoc-Thr(tBu)-OH U Fmoc-B丙氨酸-O H V Fmoc-Val-OH W Fmoc-Trp-OH Y Fmoc-Tyr(tBu)-OH Z Fmoc-∈-氨基己酸-OH Nle Fmoc-∈-正亮氨酸-OH Abu Fmoc-γ-氨基丁酸-OH
赖氨酸衍生物K1用于不需导入半抗原标记物的位置。赖氨酸衍生物K2用于导入半抗原标记物的位置。赖氨酸衍生物K3用于连接ε-氨基基团和肽的间隔区。
将氨基酸或氨基酸衍生物溶于N-甲基吡咯烷酮。在400～500mg容量为0.4～0.7mmol/g(JACS95(1973)，1328)的4-(2′，4′-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基树脂上(Tetrahedron Letters 28(1987)，2107)合成肽。以二甲基甲酰胺作为反应溶剂与相对Fmoc-氨基酸衍生物4当量的二环己基碳化二亚胺和4当量的N-羟基苯并三唑进行偶联反应20分钟。每步合成反应后，用二甲基甲酰胺中20％的哌啶在20分钟内除去Fmoc基团。
如果肽序列中存在半胱氨酸残基，那么在合成结束后立即用六氟异丙醇/二氯甲烷中的碘在固相上进行氧化。
室温下，用20ml三氟醋酸、0.5ml乙二硫醇、1ml硫代茴香醚、1.5g苯酚和1ml水处理合成树脂40分钟，将肽从合成树脂上释放出来并可除去苯乙酰保护基团以外的酸不稳定性保护基团。随后，反应液与300ml冷二异丙醚混合，0℃下保持40分钟以彻底沉淀多肽。过滤沉淀，用二异丙醚冲洗，然后溶解于少量的50％的醋酸，冻干。用制备性HPLC在大约120分钟处纯化粗制品，使用适当的梯度(洗脱液A：水、0.1％三氟醋酸，洗脱液B：乙腈，0.1％的三氟醋酸)在delta-PAK Rp C18材料(50×300mm柱，100A，15μ)上进行纯化。用离子喷雾质谱法测定洗脱物质。
用适当的活性酯衍生物和肽的游离氨基基团将半抗原标记物(比如异羟洋地黄毒甙元或地高辛标记物)导入溶液。将待衍化的肽溶于DMSO和0.1M PH为8.5的磷酸钾缓冲液的混合液中，随后在室温下滴加入溶于少量DMSO的活性酯并不断搅拌，每当量游离伯氨功能基团需加入2当量的活性酯。用分析型HPLC监控反应过程。用制备性HPLC纯化产品。
如果肽仍含有苯乙酰保护的赖氨酸，那么在最后一步反应中，用含有一定比例有机溶液的毒霉素G酰胺盐水溶液室温酶解除去保护基团。过滤分离出酶，用制备性HPLC纯化肽。用离子喷雾质谱法测定洗脱物质。
表2所示的从HIV I和HIV II的gp120、gp 41和gp32区衍生而来的肽化合物是用异羟洋地黄毒甙元-3-羧甲基醚-N羟基琥珀酰亚胺酯(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，GER)制备的。
表 2
gp120异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-NNTRKSISIGPGRAFYT异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZ-NTTRSISIGPGRAFY异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-IDIQEERRMRIGPGMAWYS gp41/1异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-AVERYLKDQQLLGIW异羟洋地黄毒甙元-3-cme-ZUZU-AVERYLKDQQLLGIW异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZ-QARILAVERYLKDQQLLGIWGASG异羟洋地黄毒甙元-3-cme-ZGGGG-QARILAVERYLKDQQLLGIWGASG异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-WGIRQLRARLLALETLLQN gp41/2异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-LGIWGCSGKLICTTAVLGIWGCSGK-(cme-3-异羟洋地黄毒甙元)-LICTTAV异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-LGIWGCSGK-(cme-3-异羟洋地黄毒甙元)-LICTTAV异羟洋地黄毒甙元-3-cme-ZU-GCSGKLICTTAVPWNASWSGCSGK-(cme-3-异羟洋地黄毒甙元-LICTTAVpWNASWSGCSGKLICTTAVPWNASWSK(cme-3-异羟洋地黄毒甙元)G异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-LSLWGCKGKLVCYTS gp41/3异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-KDQQLLGIWGSSGKL gp41/4异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-ALETLLQNQLLSLW gp32异羟洋地黄毒甙元-3-cme-z-NSWGCAFRQVCHTT
表3所示的肽是从HCV的NS5、NS4和核心区合成的。
表 3
NS5/1异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-SRRFAQALPVWARPD核心2异羟洋地黄毒甙元-3-cme-U-PQDVKFPGGGQIVGGVNS4/1异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UU-Nle-EEASQHLPYIEQNS4/2异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UU-QKALGLLQTNS4/3异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-SRGNHVSPTHYVPESDAA核心1异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZU-KNKRNTNRR核心1＋2异羟洋地黄毒甙元-3-cme-U-PQRKNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGVVNS3/1异羟洋地黄毒甙元-3-cme-UZ-AWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPV
生物素标记肽或者是在树脂上(生物素活性酯)通过衍生化从N-末端合成的或者通过在序列中使用生物素-ε-衍生的赖氨酸残基(Fmoc-LYS(生物素)-OH)合成的。实施例2
通过优选的检测步骤提高检测的特异性和敏感性。
用本发明的肽进行的双抗原桥式检测方法的特异性和敏感性，通过一定的检测步骤可一步提高.在这一检测步骤中，第一步混合样品、半抗原标记抗原和固相抗原；然后优选在1～4小时后，特别优选1.5至2.5小时后，加入抗半抗原的抗体。
将HIV的表位区gp41/1和gp41/2(表2)用作抗原。
优选的两步检测步骤的检测条件如下：-50mmol/L的中性磷酸钾缓冲液，PH7.2，
0.2％牛血清白蛋白(BSA)，0.2％月桂硫酸钠(SLS)去垢剂-孵育时间
-半抗原标记抗原和固相抗原与血清孵育120分钟
-与抗异羟洋地黄毒甙元的抗体和过氧化物酶的偶联物孵育(<Dig>-POD)60分钟-孵育温度：25℃-所有孵育步骤之间的结合状/游离态的分离。
两步检测方法的另一检测条件如下：-50mmol/L PH为7.2的中性磷酸钾缓冲液，0.2％BSA，0.2％SLS去垢剂-孵育时间
-固相抗原与血清孵育90分钟
-与半抗原标记抗原和<Dig>-POD孵育90分钟
-与ABST孵育60分钟-孵育温度：25℃-所有孵育步骤之间的结合态/游离态的分离。
一步检测法的检测条件如下：-50mmol/L PH为7.2的中性磷酸钾缓冲液，0.2％的BSA，0.2％的SLS的去垢剂-孵育时间
-两种抗原与血清和<Dig>-POD孵育120分钟
-与ABTS孵育60分钟-孵育温度：25℃-所有孵育步骤之间的结合态/游离态的分离
检测结果如表4所示。可以看出，在优选的检测方法中得到了非常高的信号区别，即测定的阳性样品的信号与阴性样品信号之比大。
表 4
样品数目一步检测法优选两步检测法1.样品与两种特异 抗原混合2.加入抗半抗原的 抗体以进行检测 反应可替代的两步检测法1.样品与壁结合 特异抗原混合2.加入特异检测 抗原和抗半抗原 抗体以进行检测 反应A)阴性样品信号(mA)信号(mA)信号(mA) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 19 21 17 19 18 28 20 21 18 19 17 19 22 20 24 19 20 23 20 16 7 12 6 5 4 7 10 7 10 11 8 12 7 5 40 10 4 6 8 11 7 9 5 7 8 16 9 11 7 8 9 7 7 17 8 7 8 8 7 7B)阳性样品信号(mA)信号(mA)s信号(mA) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 405 1080 158 760 1094 452 163 76 2405 293 303 37 19 63 74 60 86 106 962 815 2401 4836 1100 6210 3578 2296 1068 195 7803 3093 2430 132 9 218 297 253 509 1182 8782 7335 3681 4931 300 2155 1835 2954 136 14 2671 575 42 11 9 11 15 16 17 22 338 167
实施例3
在双抗原桥式检测法中将本发明的肽抗原与重组多肽抗原进行比较。在本发明的一个实例中，异羟洋地黄毒甙元标记的肽抗原gp41/2(表2)与具有相同序列的生物素标记肽抗原结合进行检测。在另一个对比实例中，异羟洋地黄毒甙元标记的多肽抗原rec gp41(Chang等.，Science 228(1985)，93-96)与具有相同序列的生物素标记多肽结合进行检测。
本检测的结果如表5所示。“NC”代表阴性对照，“PC”代表阳性对照。“截止”指数(cut-off index)是实验中阳性和阴性评价的界限。将其定义为2×NC。从表5中可以很明显地看出，用重组多肽抗原时，阴性和阳性样品之间可能没有区别，而用肽抗原可看出很明显的区别。
表 5
重组gp41-Bi/Dig 肽gp41-Bi/Dig 重组gp41-Bi/Dig 肽gp41-Bi/Dig 样品(稀释) 吸收度 吸收度 截止指数 截止指数 NC 768 36 0.5 0.5 PC 3066 2094 2.0 29.1 PC1∶2 2587 1410 1.7 19.6 PC1∶4 1681 867 1.1 12.0 阳性1 1466 9999 1.0 138.9 阳性2 497 9999 0.3 138.9 阳性3 801 9999 0.4 138.9 阳性4 1213 9999 0.8 138.9 阳性 5 952 8039 0.6 111.7 阴性1 738 50 0.5 0.7 阴性2 769 39 0.5 0.6 阴性3 747 40 0.5 0.5
序列表(1)一般信息(I)申请人：(A)姓名：Boehringer Mannheim GmhH(B)街道：Sandhcfer Str 116(C)城市：曼海姆(E)国家：德国(F)邮政编码：68305(ⅱ)申请题目：半抗原标记的肽(ⅲ)序列数目：17(ⅳ)电脑可读形式(A)资料载体：软盘(B)电脑：IBM PC兼容机(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release # 1.0 Version # 1.25(EPA)
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：17个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：1型人类免疫陷病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：gp120
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO 1：Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr1 5 10 15Thr
(2)SEO ID NO：2的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：1型人类免疫缺陷病毒
(ⅷ)在基团组中的位置：
(A)染色体/片断：gp120
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO 2：Asn Thr Thr Arg Ser Ile Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr1 5 10 15
(2)SEO ID NO：3的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：19个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：1型人类免疫缺陷病毒
(B)菌株：O亚型
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：gp120
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：3：Ile Asp Ile Gln Glu Glu Arg Arg Met Arg Ile Gly Pro Gly Met Ala1 5 10 15Trp Tyr Ser
(2)SEO ID NO：4的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：1型人类免疫缺陷病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：gp41
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：4：Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu1 5 10 15Leu Gly Ile Trp Gly Ala Ser Gly
20
(2)SEO ID NO：5的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：23个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：1型人类免疫缺陷病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：gp 41
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：5：Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val1 5 10 15Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser
20
(2)SEO ID NO：6的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：1型人类免疫缺陷病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：gp41
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：6：Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Ser Ser Gly Lys Leu1 5 10 15
(2)SEO ID NO：7的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：1型人类免疫缺陷病毒
(B)菌株：O亚型
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：gp41
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：7：Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Ser Leu Trp1 5 10 15
(2)SEO ID NO：8的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：1型人类免疫缺陷病毒
(B)菌株：O亚型
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：gp 41
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：8：Leu Ser Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15
(2)SEO ID NO：9的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：19个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：1型人类免疫缺陷病毒
(B)菌株：O亚型
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：gp 41
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：9：Trp Gly Ile Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu1 5 10 15Leu Gln Asn
(2)SEO ID NO：10的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：27个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：2型人类免疫缺陷病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：gp 32
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：10：Gln Ala Gln Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His1 5 10 15Thr Thr Val Pro Trp Pro Asn Asp Ser Leu Thr
20 25
(2)SEO ID NO：11的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：丙型肝炎病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：NS5
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：11：Ser Arg Arg Phe Ala Gln Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp1 5 10 15
(2)SEO ID NO：12的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：丙型肝炎病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：核心区
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：12：Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val1 5 10 15
(2)SEO ID NO：13的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：丙型肝炎病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：NS4
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：13：Glu Glu Ala Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln
1 5 10
SEO ID NO：14的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：丙型肝炎病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：NS4
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：14：Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr1 5
(2)SEO ID NO：15的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：18个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：丙型肝炎病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：NS4
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：15：Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp1 5 10 15Ala Ala
(2)SEO ID NO：16的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：28个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：丙型肝炎病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：核心区
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：16：Pro Gln Arg Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val
1 5 10 15Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Val Val
20 25
(2)SEO ID NO：17的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：25个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线形
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假拟：非
(ⅵ)原始来源：
(A)生物体：丙型肝炎病毒
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体/片断：NS3
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO：17：Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala
1 5 10 15Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val
20 25