一种治疗心血管病症的香丹滴注液 【技术领域】
本发明涉及一种治疗心脑血管病的含中药丹参、降香的有效部位的药物组合物，具体为制备方法改进的含丹参、降香有效部位的滴注液即香丹滴注液。
背景技术
丹参是具有活血化瘀功效的传统中药，药理研究表明水溶性酚酸类成份为丹参活血化瘀的有效成分。降香具有抗凝、抗血栓形成的作用。现市售香丹注射液(小针剂)及复方丹参注射液(大输液)中含水溶性酚酸类成分和降香水溶性成分，其药效为扩张血管，增进冠状动脉血流量，用于防治心绞痛，亦可用于心肌梗塞等心血管疾病。
卫生部药品标准中，香丹注射液(WS3-B-3289-98)(小针剂)采用浓度为75％、85％二步醇沉方法。对于水溶性酚酸类成分，以水为溶媒提取较好，不过，水提取液中杂质非常多。按常法用两次醇沉法去除杂质，但是用此法有效成分损失较多，导致有效成分的含量低于质量标准。
大输液对制剂质量尤其是有效成份含量、稳定性、澄清度、杂质的要求与小针剂相比更为严格，且一旦产生不良反应，其后果更为严重。然而，目前市场上销售的复方丹参注射液(大输液)，工艺上沿用了小针剂两步醇沉的方法。对市售香丹注射液(小针剂)与复方丹参注射液(大输液)进行检测，其有效成分即水溶性酚酸类成分丹参酚和原儿茶醛的百分比仅为11-13％，只占国家药品监督管理局关于二类中药规定值的50％，而且稳定性差，杂质量偏高，并由此多次造成临床不良反应，如过敏反应(“复方丹参注射液致过敏性休克1例”，钟松才，《中国中药杂志》1994；19(10)：631)。
为了达到大输液所要求的稳定性、澄清度以及杂质控制，有人在两次醇沉时，采用高浓度乙醇，如两次使用95％乙醇沉淀杂质(参见CN1190006A，说明书第3页)。但是，这会使有效成份的含量更低。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是，对丹参、降香复方注射液的制备工艺进行改进，尤其是对丹参中酚酸类有效成份地提取工艺进行改进，使其有效成分的百分比达到国家药品监督管理局关于二类中药的规定值，增加稳定性，降低杂质，从而尽可能地减少临床不良反应，以达到理想的治疗效果。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术解决方案：
一种治心血管病症的香丹滴注液，按体积比，基本上由丹参的酚酸类提取物精制液0.2～4.0％、降香的蒸馏液0.2～4.0％，滴注液常规辅料92.0～99.2％滴注液常规辅料组成，其特征在于用如下方法制备：
取丹参水煎煮，浓缩水液至相对密度为1.04-1.06，冷却至40-50℃时，加5％明胶溶液至不产生沉淀为止，上清液浓缩至相对密度为1.15-1.17时，加乙醇使含醇量达50-60％，于0-10℃条件下静置后过滤，滤液回收乙醇后的浓缩液，加注射用水稀释至1ml相当于含丹参生药1～3g，过滤，调节滤液pH至1-2，用等量的醋酸乙酯萃取4～7次，合并醋酸乙醋萃取液，回收醋酸乙醋，得丹参酚酸提取物浸膏，加注射用水稀释至1ml相当于含丹参生药3g，加入4倍量的注射用水于0-10℃条件下静置后，过滤去除沉淀，滤液加热浓缩至1ml相当于含丹参生药10g，加入4倍量的注射用水于0-10℃条件下静置后，过滤去除沉淀，加入活性炭，加热煮沸，制得丹参酚酸提取物精制液，1ml相当于含丹参生药2.5g；
蒸馏降香，蒸馏液至1ml相当于含降香生药0.5g，低温静置后除去油层，水层重蒸馏，收集重蒸馏液至1ml相当于含降香生药2.5g；
取丹参酚酸类提取物精制液、降香重蒸馏液，与滴注液常规辅料混合，按常规调节等渗，调节pH至6.0-7.0。
所述的香丹滴注液，其特征在于滴注液辅料为等渗剂、抗氧剂与水。
所述的香丹滴注液，其特征在于其中等渗剂可以为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、乳酸钠、葡萄糖、木糖醇、山梨醇或/和大分子量的右旋糖酐、中分子量的右旋糖酐或小分子量的右旋糖酐。抗氧剂可以为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠或/和硫代硫酸钠。
本发明香丹滴注液较详细的制备方法如下：
丹参酚酸类有效成份精制液的制备
取丹参药材，去除杂质后，加8倍量的纯化水浸泡1小时后，煎煮2小时，过滤，保留第一次煎液。
药渣再用6倍量的纯化水煎煮2小时，过滤，保留第二次煎液，药渣再用5倍量的纯化水煎煮2小时，过滤，保留第三次煎液，去除药渣，然后合并三次煎煮液，加热浓缩至相对密度为1.04-1.06(70-80℃热测)。
将上述丹参浓缩液冷却至约40-50℃，加5％明胶溶液至不产生沉淀为止，调整药液浓度至相对密度为1.15-1.17(70-80℃热测)，加乙醇使沉淀，使含醇量达50-60％，于0-10℃条件下放置12-36小时后，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，加注射用水稀释至1ml相当于含丹参生药3g，过滤，滤液用盐酸调节pH至1-2，用等量的醋酸乙酯萃取5次，合并醋酸乙醋萃取液，减压回收醋酸乙醋，得丹参提取液浸膏，加注射用水稀释至1ml相当于含丹参生药3g，加入4倍量的注射用水于0-10℃条件下放置48-72小时后，过滤去除沉淀，滤液加热浓缩至1ml相当于含丹参生药10g，加入4倍量的注射用水于0-10℃条件下放置48-72小时后，过滤去除沉淀，加入活性炭，加热煮沸，制得丹参酚酸类有效成份精制液。
降香提取液的制备
取降香，刨成薄片，用纯化水10倍量，蒸馏，收集蒸馏液至1ml相当于含降香生药0.5g，冷藏12-36小时后，除去油层，水层重蒸馏，收集蒸馏液至1ml相当于含降香生药2.5g，制得降香提取液。
制备等渗浓配液：
取等渗剂加3倍量注射用水，用氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-7.0，加入活性炭，煮沸15分钟，经砂棒过滤制得浓配液。
制备香丹滴注液
取上述丹参精制液、降香提取液与等渗剂的浓配液按处方配比量进行合并，加8倍量注射用水，加活性炭煮沸15分钟，经砂棒过滤，滤液以氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-7.0，加注射用水至全量，测试中间体含量，经0.45μm微孔滤膜精滤后，用超滤器超滤，灌装于洗净的玻璃输液瓶或输液袋中，经灭菌、灯检、质检后得香丹滴注液成品。
本发明的有益效果表现在：通过对香丹滴注液制备工艺的改进，尤其是丹参中酚酸类有效成份提取分离工艺的改进，经明胶除鞣、低浓度醇沉、醋酸乙酯萃取及两次加水沉淀杂质，既获得符合标准含量要求的丹参酚酸提取物，又降低了杂质，保证了制剂的稳定性以及大输液所要求的澄明度。
本发明研究了影响丹参萃取的各因素，试验结果表明以药液pH偏酸性、药液浓度适中(每1ml相当于含生药1-3g)、萃取5-7次、每次醋酸乙醋用量为1倍最佳。可以使丹参有效成分提取利用率达到90-95％。由于本发明采用低醇沉浓度，与传统工艺两次醇沉法(75％、85％)比较，丹参素钠与原儿茶醛有效成分的含量可提高60％，有效成分占总固体物的比例由原来的13％提高至37％。测试结果见表3、表4。作为对比的市售香丹注射液(小针剂)有效成分百分比检测结果见表1。目前市场上销售的复方丹参注射液(大输液)，工艺上沿用了小针剂两步醇沉的方法，其有效成分百分比的检测结果见表2。
表1 香丹注射液(小针剂)有效成分百分比批号 上海小针 广东小针
001208 001268 001273 0011056 0012324 0012531丹参素钠含量(mg/g) 3.1486 3.2022 3.1517 2.9694 2.8859 2.8886原儿茶醛含量(mg/g) 0.4105 0.4108 0.4226 0.3726 0.3771 0.3735总固体(mg/g) 32.2090 32.2214 32.5528 27.1046 27.0083 27.1123有效成分百分比(％) 11.05 11.21 11.98 12.33 12.08 12.03
表2 市售复方丹参注射液(大输液)有效成分百分比批号 贵州输液 贵州输液 贵州输液
00111512 00112810 00112912丹参素钠含量(mg/g) 4.3283 4.5741 4.2918原儿茶醛含量(mg/g) 0.7214 0.7321 0.7210总固体(mg/g) 46.32 47.65 46.21实际总固体(mg/g) 38.49 40.02 39.17有效成分百分比(％) 13.12 13.26 12.80
从香丹注射液(小针剂)与复方丹参注射液(大输液)的检测结果来看，其有效成分百分比约为11-13％，只占国家药品监督管理局关于二类中药规定值的50％，杂质量偏高，易导致临床不良反应。
表3 萃取法与二次醇沉法制备丹参精制液有效成分百分比
样品 丹参素钠含量 原儿茶醛含量 总固体量 有效成分百分比
(mg/g) (mg/g) (mg/g)
萃取法样品 8.3245 1.5859 26.6122 37.24
二次醇沉法样品 5.2682 1.6666 54.0514 12.83
由上述丹参精制液制得香丹滴注液测试有效成分百分比，结果见表4。
表4 香丹滴注液有效成分百分比
样品 安徽天洋 安徽天洋 安徽天洋
20000617 20000619 20000713
丹参素钠含量(mg/g) 8.0807 8.1131 8.0918
原儿茶醛含量(mg/g) 0.9007 0.9213 0.9056
总固体(mg/ml) 30.64 30.37 30.59
实际总固体(mg/g) 24.29 24.20 24.27
有效成分百分比(％) 36.98 37.33 37.07
测试结果表明，采用一次醇沉后醋酸乙酯萃取方法制备的香丹滴注液，有效成分占总固体量的比例提高到2.8-3.0，达到中药二类要求。
本发明涉及对香丹滴注液制备工艺的改进。在丹参酚酸类提取物精制时，用一次低浓度醇沉后醋酸乙醋提取提取法，代替传统工艺两次醇沉除杂质方法，尤其是革除了用高浓度乙醇沉淀杂质的步骤，即有效去除了杂质，又提高了有效成份的含量。从而使采用本发明方法制备的香丹滴注液，不但稳定性增加，杂质降低，而且其有效成分的百分比达到国家药品监督管理局关于二类中药的规定值，如下药理试验证明该制备方法制备的产品具有理想的治疗效果。
用本发明方法制得的香丹滴注液的检验报告如下：
品名：香丹滴注液
制备单位：安徽天洋药业有限公司
检测单位：安徽省药品检验所
检测项目与结果：
性状：本品为黄棕色的澄明液体
鉴别：呈正反应
pH：5.0-7.0
其他：符合注射剂项下要求
无菌：合格
热原：合格
丹参素钠与原儿茶醛含量(HPLC法)：合格
等渗剂含量为标示量％ 95-105％
对上述三个批次的香丹滴注液进行一年半的稳定性考察，试验结果表明，在香丹滴注液产品有效期内，色泽达到规定要求，澄明度合格。
根据国家药品监督管理局关于二类中药注射液要求，对工艺改进后香丹滴注液进行了刺激试验、过敏试验及溶血试验报告如下：
样品：香丹滴注液。
检测单位：国家沈阳新药安全评价重点实验室。
试验一：香丹滴注液静脉注射血管刺激性试验
试验目的通过动物试验观察香丹滴注液对家兔血管的刺激性，为临床应用提供安全性评价依据。
试验材料受试药物：香丹滴注液，规格：40g生药(丹参20克，降香20克)/250mL。由安徽天洋药业有限公司提供。
受试动物：白色家兔，雌雄不限(雌未孕)6只，体重2.0-2.5kg，外耳壳正常。沈阳药科大学实验动物研究中心提供。合格证号：辽实合字033号。
试验方法白色家兔，雌雄不限(雌未孕)6只，体重2.0-2.5kg，均分成2组，每组3只。将家兔固定于固定箱内。给药组将香丹滴注液用一次性来菌输液装置经左侧耳缘静脉6ml/kg、1mL/min静注给药，对照组经左侧耳缘静脉以6ml/kg、1mL/min静注给5％葡萄糖注射液，连续给药三天。给药期间每日观察血管注射液部位及整个外耳壳无变化。在末次给药后24小时处死动物，取给药处血管及周围组织，以10％甲醛液固定，切片染色，切片部位为进针部位。
试验结果肉眼观察结果：给药组未见血管充血、出血、组织水肿、坏死。5％葡萄糖注射液对照组也未见异常病理改变。
病理组织检查结果：给药组、5％葡萄糖注射液对照组动物耳缘静脉血管内无血栓形成，血管内皮细胞及周围组织未见水肿、炎性浸润或坏死等异常改变。表明香丹滴注液对家兔静脉血管无刺激作用。
结论：香丹滴注液对家兔静脉血管无明显刺激作用。
试验二：香丹滴注液被动皮肤过敏试验。
试验目的考察香丹滴注液是否具有IgE样抗原作用，为临床安全用药提供参考。
试验材料受试药物：香丹滴注液，规格：40g生药(丹参20克，降香20克)/250mL，批号：20000619。由安徽天洋药业有限公司提供。
卵蛋白(AlbuminEgg)：北京邦定泰克生物技术公司，SigmaA 5253。
吸附百日咳、白喉、破伤风类毒素混合制剂：卫生部长春生物制品研究所，批号：991008-1-3；
伊文思蓝：(0589-60)Koch-Light进口分装。
试验动物：Wistar大鼠，150-200g体重，由沈阳药科大学试验动物中心提供，合格证号：033。
试验方法1、致敏血清的制备：Wistar大鼠(雌雄各半)12只，体重150-200g，随机分成卵蛋白组和香丹滴注液组。卵蛋白组大鼠于后腿两侧肌注1％孵蛋白生理盐水0.05ml，香丹滴注液组肌注香丹滴注液0.1ml/只大鼠(0.2g/只)，同时分别腹腔注射百白破疫苗(内含百日咳2×1010)，以第一次致敏时间为第1天，分别于第5、10天再致敏2次。14天后颈动脉采血，分离血清，各组分别合并后，置冰箱中保存备用。
2、被动皮肤致敏：另取大鼠16只，雌雄各半，体重160-180g，随机分成2组，即卵蛋白组和香丹滴注液组。大鼠用乙醚浅麻后，在腹部两侧剪毛，每侧两点。取上述两组抗血清用生理盐水稀释成1∶5和1∶10两种浓度。两组动物于剪毛处分别皮内注射相应的两种浓度的抗血清各0.1ml。致敏后48小时后，卵蛋白组用1％孵蛋白生理盐水(含0.5％伊文思蓝)尾静脉注射1ml/只，进行抗原攻击；香丹滴注液组尾静脉注射香丹滴注液(含0.5％伊文思蓝)1ml/只，进行抗原攻击。攻击后30min处死大鼠，翻转腹部皮肤，观察有无蓝斑形成。
试验结果孵蛋白组皮注射1∶5和1∶10抗血清后均形成蓝斑，香丹滴注液组两种血清浓度下均蓝斑形成。结果见表5、表6。
表5 1∶5血清浓度下两组动物蓝斑形成情况
组别 阳性(有蓝斑) 阴性(无蓝斑)
孵蛋白组 16 0
香丹滴注液组 0 16
表6 1∶10血清浓度下两组动物蓝斑形成情况
组别 阳性(有蓝斑) 阴性(无蓝斑)
孵蛋白组 16 0
香丹滴注液组 0 16
注：X2检验，p＜0.01与对照组比较
结论：香丹滴注液无IgE样抗原作用。
参考文献：
药理实验方法学(第二版)，徐叔云主编，人民卫生出版社，1196。
试验三：香丹滴注液的过敏试验。
试验目的通过动物试验观察香丹滴注液是否有致敏作用。
试验材料受试药物：香丹滴注液，规格：40g生药(丹参20克，降香20克)/250mL，批号：20000619。由安徽天洋药业有限公司提供。
受试动物：白色豚鼠，雄性，体重250-350g，随机均分成3组。按无菌操作，给药组隔日腹腔注射香丹滴注液0.5ml/只，5％葡萄糖注射液组、阳性致敏组隔日分别腹腔注射5％葡萄糖注射液、2％新鲜鸡蛋清各0.5ml/只，共3次。首次注射后的第14日，每组分别取3只豚鼠，给药组静脉注射药物2ml/只，5％葡萄糖注射液组静脉注射5％葡萄糖注射液2ml/只，阳性致敏组静脉注射2％新鲜鸡蛋清2ml/只攻击。每组作下3只动物于首次注射后的第21日按以上方法进行攻击，观察过敏反应现象，按表7进行过敏反应分级。
方法进行攻击，观察过敏反应现象，按表7进行过敏反应分级。
表7 豚鼠过敏反应级数
反应级数 反应症状
0 无明显反应
1 只有轻微抓鼻、颤抖或竖毛
2 有几次咳嗽、有抓鼻、颤抖或竖毛
3 多次或连续咳嗽、伴有呼吸困难或痉挛、抽搐
4 痉挛、抽搐、大小便失禁、休克死亡
反应级数2级以上(包括2级)时，可认为过敏试验不合格。
试验结果示：重复使用香丹滴注液，未引起受试动物出现过敏反应。
表8 豚鼠过敏反应级数
组别 动物数 过敏反应级数
(只) 14天(n＝3) 21天(n＝3)
香丹滴注液 6 0 0
5％葡萄糖注射液 6 0 0
2％蛋清 6 4 4
结论：香丹滴注液对豚鼠无致敏作用。
试验四：香丹滴注液的溶血试验。
试验目的 观察香丹滴注液在体外溶血试验中对家兔红细胞是否有溶血作用，为临床应用提供安全性评价依据。
试验材料 受试药物：香丹滴注液，规格：40g生药(丹参20克，降香20克)/250mL，批号：20000619。由安徽天洋药业有限公司提供。
受试动物：白色家兔，沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：辽实合字033号。
试验方法：取家兔1只，耳缘静脉取血10ml，用竹签搅拌去除纤维蛋白，然后将血移入该度离心管内，2000rpm离心5分钟，去除上清液，加生理盐水注射液5ml混匀后2000rpm离心5分钟，反复4次，将所得红细胞按体积用生理盐水稀释成2％混悬液备用。再取试管7支，按表11加入各种溶液，其中第6、7管分别为5％葡萄糖注射液对照管和溶血的阳性对照管。将各管摇匀后，37℃水浴内温育3小时，按标准判断各管在0.5-3小时内是否出现溶血或凝集。
表9 体外溶血试验加样表
试管编号 1 2 3 4 5 6 7
香丹滴注液 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0
5％葡萄糖注射液 2.3 2.1 1.9 1.7 1.5 2.5 0
蒸馏水 0 0 0 0 0 0 2.5
2％红细胞混悬液 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
试验结果表明：香丹滴注液各浓度0.5-3小时内对家兔红细胞均无溶血或凝集反应；蒸馏水组在各时间点全溶血。
试验五：香丹滴注液肌肉刺激性试验
试验目的 通过动物试验观察香丹滴注液对家兔肌肉的刺激性，为临床应用提供安全性评价依据。
试验材料 受试药物：香丹滴注液，规格：40g生药(丹参20克，降香20克)/250mL。由安徽天洋药业有限公司提供。
受试动物：白色家兔，雌雄不限(雌未孕)3只，体重2.0-2.5kg。沈阳药科大学实验动物研究中心提供。合格证号：辽实合字033号。
试验方法 白色家兔，雌雄不限(雌未孕)6只，体重2.0-2.5kg。将家兔固定于固定箱内。各例于左侧股四头肌以无菌操作方法注入药液2mL；右侧股四头肌以无菌操作方法注入葡萄糖输液2mL。给药后48小时放血处死动物，解剖后取股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应，并且取注射部位肌肉组织制作病理切片，观察有无病理改变。
肉眼观察结果表明：给药后各只家兔健康如常。给药侧和对照组侧未见异常病理改变。
病理组织检查结果表明：对照侧未见异常，香丹滴注液侧高倍镜下给药部位肌肉组织强见轻度炎症细胞浸润，未见变性、坏死等异常改变。刺激反应结果表明香丹滴注液对肌肉无明显刺激作用。
从上述五个试验可以表明，本发明的香丹滴注液的安全性试验符合规定要求。
【具体实施方式】
实施例：
取丹参10kg，去除杂质后，加8倍量的纯化水浸泡1小时后，煎煮2小时，过滤，保留第一次煎液。药渣再用6倍量的纯化水煎煮2小时，过滤，保留第二次煎液，药渣再用5倍量的纯化水煎煮2小时，过滤，保留第三次煎液，去除药渣，然后合并三次煎煮液，加热浓缩至相对密度为1.04-1.06(70-80℃热测)。待冷却至约40-50℃，加5％明胶溶液至不产生沉淀为止，调整药液浓度至相对密度为1.15-1.17(70-80℃热测)，加乙醇使沉淀，使含醇量达55％，于0℃条件下放置24小时后，过滤去除沉淀，滤液减压回收乙醇，加注射用水稀释至1ml相当于含丹参生药3g，过滤，滤液用盐酸调节pH至1-2，用等量的醋酸乙酯萃取5次，合并醋酸乙醋萃取液，减压回收醋酸乙醋，得丹参提取液浸膏，加注射用水稀释至1ml相当于含丹参生药3g，加入4倍量的注射用水于0℃条件下放置48小时后，过滤去除沉淀，滤液加热浓缩至1ml相当于含丹参生药10g，加入4倍量的注射用水于5℃条件下放置72小时后，过滤去除沉淀，加入活性炭，加热煮沸，制得丹参酚酸类有效成份精制液4000ml，1ml相当于含丹参生药2.5克。
取降香10kg，刨成薄片，用纯化水10倍量，蒸馏，收集蒸馏液至1ml相当于含降香生药0.5g，冷藏24小时后，除去油层，水层重蒸馏，收集蒸馏液至1ml相当于含降香生药2.5g，制得降香提取液即重蒸馏液4000ml。
取葡萄糖6250克，按重量比，加3倍量注射用水，用氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-7.0，加入活性炭，煮沸15分钟，经砂棒过滤制得等渗剂浓配液。
取上述丹参精制液、降香提取液与等渗剂的浓配液按体积比4∶5∶19进行合并，加8倍量注射用水，加活性炭煮沸15分钟，经砂棒过滤，滤液以氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-7.0，加注射用水至全量，测试中间体含量，经0.45μm微孔滤膜精滤后，用超滤器超滤，灌装于洗净的250毫升玻璃输液瓶或输液袋中，经灭菌、灯检、质检后得香丹滴注液成品。
使用剂量：静脉滴注250ml/天。