多功能纳米装置(nanodevice)平台 【发明领域】
本发明涉及新型治疗和诊断系统。本发明尤其涉及用于疾病诊断和治疗(例如，癌症诊断和治疗)的基于树状体的多功能组合物和系统。该组合物和系统通常包含两种或多种单独的用于导向(targting)、成像(imaging)、感应(sensing)、和/或触发治疗或诊断物质的释放和监测细胞或组织(例如，肿瘤)对治疗反应的组分。
【发明背景】
化学治疗和放射药剂学中的创新已经改善了具有多种形式肿瘤的患者的存活。目前一些癌症80％以上具有五年生存率。然而，尽管取得了这些成功，关于癌症治疗仍然存在很多问题。例如，许多常见肿瘤(例如结肠癌)对现有的治疗手段反应较差。
对于那些对现有方法有反应的肿瘤形式，只有一部分癌症对治疗反应较好。另外，尽管对许多癌症的治疗都有所改善，但大多数现今使用的治疗剂都具有严重的副作用。这些副作用经常限制了化学治疗剂的使用，并导致相当一部分癌症患者没有任何治疗选择。其他形式的治疗革新，如基因治疗或免疫治疗，可能证明比化学治疗更加特异和具有更少的副作用。然而，由于仅在很少的临床试验中显示了某些进展，这些方法的实际使用在现今仍有一定程度的局限性。
尽管现有治疗取得有限的成功，但对于肿瘤细胞基本生物学的理解却一直在进步。现在已经鉴定了参与肿瘤形成和细胞生长改变地细胞事件，并且已经证明了一些人类肿瘤的癌症发生的多个步骤(例如参见，Isaacs，Cancer 70：1810[1992])。已经鉴别了导致失控的细胞生长的致癌基因，并对其遗传学起源和功能进行了鉴定。已经对调节细胞复制周期的特异性途径进行了详细鉴定，并且已经克隆和鉴定了参与该调节的蛋白质。同样也已经详细阐明了参与介导细胞凋亡和负相调节细胞生长的分子(Kerr等，Cancer 73：2013[1994])。现在已经证明操纵这些细胞调节途径能够使肿瘤细胞停止生长，并引发肿瘤细胞的细胞凋亡(例如参见，Cohen和Tohoku，Exp.Med.，168：351[1992]和Fujiwara等，J.Natl.Cancer Inst.，86：458[1994])。肿瘤细胞中控制细胞生长和复制的代谢途径是重要的治疗靶标。
尽管取得了如此巨大的成就，在将这些治疗方法用于体内治疗癌细胞之前仍存在许多障碍。例如，这些治疗需要鉴定个体独特肿瘤细胞的特异性病理生理学变化。这需要机械侵入肿瘤(活检)，并通常通过体外的细胞培养和测试进行诊断。因而必须分析肿瘤表型，然后才能选择和实施治疗方法。这些步骤费时、复杂和昂贵。
现在需要与正常细胞相比对肿瘤细胞具有选择性的治疗方法。目前的治疗对于肿瘤细胞仅有相对的特异性。尽管肿瘤导向强调该选择性问题，但不够充分，因为大多数肿瘤并不具有独特的抗原。此外，理想上该治疗应当具有几个不同的作用机制，其平行作用来防止抗性肿瘤的选择，并且在确定了肿瘤的位置和类型后医生可以开展此治疗。最后，理想上该治疗应当使医生在治疗前和治疗后即刻就能鉴定残余的或最小限度的病变状况，并监测对治疗的反应。这是十分关键的，因为少数剩余细胞可能会引起再生长，或恶化，导致肿瘤对治疗产生抗性。在治疗最后(而不是肿瘤再生长之后)对残余病变的鉴定将帮助根除少数剩余的肿瘤细胞。
因而，理想的治疗应当具有导向肿瘤、对肿瘤程度成像和鉴定治疗试剂在肿瘤细胞中的存在的能力。它最好能使医生确定细胞转化成肿瘤的原因、基于肿瘤细胞病理生理学异常选择治疗分子、仅在异常细胞中激活治疗试剂、证明对治疗反应和鉴定残余病变。
发明概述
本发明涉及新型治疗和诊断系统。本发明尤其涉及用于疾病诊断和治疗(例如，癌症诊断和治疗)基于树状体的多功能组合物和系统。该组合物和系统通常包含两种或多种不同的用于导向、成像、感应、和/或触发治疗或诊断物质的释放和监测细胞或组织(例如，肿瘤)对治疗反应的组分。
例如，本发明提供了包含树状复合物的组合物，该树状复合物包含第一和第二树状体，该第一树状体包含第一试剂，第二树状体包含第二试剂，其中第一试剂不同于第二试剂。在优选的实施方案中，第一和所述的第二试剂选自治疗试剂、生物监测试剂、生物成像试剂、导向试剂和能够鉴定细胞异常的特异标志物的试剂。在一些实施方案中，第一树状体共价连接至第二树状体。在特定实施方案中，树状体复合物包括另外的树状体。例如在一些实施方案中，该复合物包含第三树状体(例如，共价连接至第一和第二树状体的第三树状体)。在另外的实施方案中，树状体复合物包含第四、第五，或另外的树状体。每种树状体都可能包含试剂。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含：包含第一试剂的第一树状体；包含第二试剂的第二树状体，其中第一和第二树状体与至少一种树状体(例如互相之间，与共同的第三树状体，或每种分别单独与第三和第四树状体)复合(例如，共价结合)，并且其中第一试剂与第二试剂不同，其中第一和第二试剂选自治疗试剂、生物监测试剂(即能够监测生物物质或事件的试剂)、生物成像试剂(即能够将生物物质或事件成像的试剂)、导向试剂(即能够导向生物物质的试剂——即特异性与生物物质相互作用)，和能够鉴定特异细胞身份标志物的试剂(即能够鉴定有助于从其他细胞形式中区分细胞的细胞特征——例如，对特定细胞异常特异性的细胞蛋白质)。本发明并不受树状体性质的限制。适合于本发明的树状体包括，但并不局限于聚氨基酰胺(polyamidoamine)(PAMAM)、聚丙胺(POPAM)、聚氮丙啶、iptycene、脂肪族聚醚、和/或芳族聚醚树状体。树状体复合物中的每种树状体可能与其他树状体的化学性质相似或不同(例如，第一树状体可能包含PAMAM树状体，而第二树状体可能包含POPAM树状体)。在一些实施方案中，第一或第二树状体可能还包含另外的试剂。
在本发明的一些实施方案中，树状体复合物还可能进一步包含一种或多种另外的树状体。例如，组合物可能还包含第三树状体；其中第三树状体与至少一种其它树状体复合。在一些实施方案中，第三种试剂与第三树状体复合。在一些实施方案中，第一和第二树状体都与第三树状体复合。在优选的实施方案中，第一和第二树状体包含PAMAM树状体，第三树状体包含POPAM树状体。在特定实施方案中，本发明还包含第四和/或第五树状体，其包含试剂(例如第三和第四试剂)，其中第四和/或第五树状体同样与第三树状体复合(例如共价结合)。本发明并不受互相复合的树状体的数目限制。
在本发明的一些实施方案中，第一试剂是治疗试剂，第二试剂是生物学监测试剂。在优选的实施方案中，治疗试剂包括但并不局限于，化学治疗试剂、抗癌剂、抗血管化试剂、抗微生物或抗病原试剂，以及包含编码治疗蛋白质的核酸的表达构建体。在一些实施方案中，治疗试剂由选自对光不稳定的、对放射不稳定的和对酶不稳定的保护基团的保护基团保护。在优选的实施方案中，化学治疗试剂包括但并不局限于铂复合物、戊脉安(verapamil)、鬼臼毒素、卡铂(carboplatin)、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺(ifosfamide)、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、bisulfan、亚硝基脲(nitrosurea)、亚德里亚霉素(adriamcycin)、放线菌素D、道诺红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素、光辉霉素(plicomycin)、丝裂霉素、鬼臼亚乙基苷(etoposide)、三苯氧胺、紫杉醇、反铂(transplatinum)、5’-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤。在一些实施方案中，抗癌试剂包含反义核酸。在特定的实施方案中，反义核酸包含与癌基因RNA互补的序列。在优选的实施方案中，癌基因包括，但并不局限于abl、Bcl-2、Bcl-x1、erb、fms、gsp、hst、jun、myc、neu、raf、ras、ret、src、或trk。在一些实施方案中，编码治疗性蛋白质的核酸编码的因子包括，但并不局限于肿瘤抑制因子、细胞因子、受体、细胞凋亡诱导物、或分化剂。在优选的实施方案中，肿瘤抑制因子包括但并不局限于，BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p21、p53、p73、Rb和p27。在优选的实施方案中，细胞因子包括但并不局限于，GMCSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β-干扰素、γ-干扰素、和TNF。在优选的实施方案中，受体包括但并不局限于，CFTR、EGFR、雌激素受体、IL-2受体、和VEGFR。在优选的实施方案中，细胞因子诱导物包括但并不局限于，AdE1B、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakid和ICE-CED3蛋白酶。在一些实施方案中，治疗试剂包含短半衰期的放射性同位素。
在本发明的一些实施方案中，生物监测试剂包含测量治疗试剂效果的试剂(例如直接或间接测量由治疗试剂引起的细胞因子或反应)，但本发明并不受生物监测试剂的性质的局限。在一些实施方案中，监测试剂能够测量由治疗试剂引起的细胞凋亡的量和检测细胞凋亡。
在本发明的一些实施方案中，成像试剂包含放射性标记，其包括但并不局限于，14C、36CI、57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111In、152Eu、59Fe、67Ga、32P、186Re、35S、75Se、Tc-99m和169Yb，但本发明并不受成像试剂的性质的局限。
在本发明的一些实施方案中，导向试剂包括，但并不局限于抗体、受体配体、激素、维生素和抗原，但本发明并不受导向试剂的性质的局限。在一些实施方案中，抗体特异性针对疾病特异性抗原。在一些优选的实施方案中，疾病特异性抗原包含肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，受体配体包括，但并不局限于CFTR、EGFR、雌激素受体、FGR2、叶酸受体、IL-2受体、糖蛋白和VEGFR的配体。
在本发明的一些实施方案中，第一和第二树状体(和第三、第四……)通过接头基团互相结合在一起。在一些优选的实施方案中，接头基团包含核酸接头。例如，在一些实施方案中，第一树状体包含第一核酸接头，第二树状体包含第二核酸接头，其中第一核酸接头与第二核酸接头杂交。在一些实施方案中，由第一接头与第二接头杂交形成的双螺旋包含裂解位点(例如核酸酶识别位点如限制性内切酶位点)。
本发明还提供了用树状体复合物治疗细胞的方法，其包含：提供细胞和包含有树状体复合物的组合物，并将细胞暴露于树状体复合物。在一些实施方案中，树状体复合物包含含有第一试剂的第一树状体，和含有第二试剂的第二树状体，其中第一和第二树状体与至少一种树状体复合，并且其中第一试剂不同于第二试剂，其中第一和第二试剂选自治疗试剂、生物监测试剂、生物成像试剂、导向试剂和能够鉴定细胞异常的特异标志物的试剂；并且将细胞暴露于组合物上。本发明并不受细胞类型或暴露步骤的性质的局限。例如，本发明的细胞包括，但并不局限于存在于体外的细胞(例如，细胞培养的细胞)和存在于体内的细胞(例如，人或动物受试者的细胞或病原细胞)。在优选的实施方案中，当细胞存在于受试者(例如，人或动物受试者)时，该受试者患有疾病(例如，该细胞是疾病细胞如肿瘤细胞)。在一些实施方案中，疾病包括，但并不局限于癌症、心血管疾病、炎症、和朊病毒(prion)类型疾病(即与朊病毒有关或由朊病毒引起的疾病)。
在本发明的一些实施方案中，治疗剂是非活性形式的，在将组合物给予受试者后，其成为活性形式。例如，在暴露于光或pH变化后(例如由于暴露于特定细胞内环境)试剂改变而呈现其活性形式。在这些实施方案中，试剂可能附着于保护性接头上(例如，光-裂解的、酶-裂解的、pH裂解的)使之处于非活性状态，并且在暴露于适当的活化剂(例如，UV光、裂解酶、或pH变化)时变成活性状态。
在本发明的一些实施方案中，受试者具有肿瘤或被怀疑有癌症。在特定实施方案中癌症包括，但并不局限于肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌、肾癌、睾丸癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胚(germ)癌、上皮癌、前列腺癌、头和颈癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、上突神经胶质瘤、室鼓膜瘤、神经纤维肉瘤、脑膜瘤(meningia)、肝癌、脾癌、淋巴结癌、小肠癌、结肠癌、胃癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、皮肤癌、食道癌、和骨髓癌。在一些实施方案中，将包含纳米装置的组合物和其他任何所需的组分(例如，可药用的载体、佐剂和赋形剂(exipients))给予受试者。本发明并不受给药途径的限制。这些给药途径包括但并不局限于内窥镜、气管内、切口内(intralesion)、经皮的、静脉内、皮下和肿瘤内给药。
【附图说明】
下列附图组成了本说明书的一部分，并且用来进一步阐明本发明的某些特征。通过参考这些附图中的一个或多个，并结合此处介绍的具体实施方案的详细描述，会有助于更好理解本发明。
图1显示几代球形、树状聚合物，其中每一代其大小、分子量和在聚合物表面伯氨基基团数都有所增加。
图2显示设计基于树状体纳米装置的不同选择。
图3显示本发明一些实施方案中的用于乳腺癌和结肠癌的纳米装置的组分结构。
图4A-D显示本发明一些实施方案中治疗性纳米装置的功能。图4A显示了“导向和成像”的应用，其中纳米装置通过细胞表面部分(moiey)导向肿瘤细胞，并且通过受体介导的内吞作用将其摄入细胞。肿瘤OO通过MRI成像。图4B显示“感应肿瘤标志物”的应用，其中肿瘤标志物的存在激发红色荧光(通过量子点类似的凝集或损失1个淬灭检测Muc1、Her2、或突变的p53)。图4C显示“触发的治疗释放”的应用，其中激光被导向发红光的细胞，并且从药物裂解对光不稳定的保护基团(例如，从树状体矩阵上释放的铂或紫杉醇)。上图4D显示了“监测对治疗的反应”的应用，其中药物引发细胞内的凋亡，并且崩溃酶(caspase)活性激活绿色荧光。凋亡的癌细胞变为橙色而残余癌细胞仍呈红色。正常细胞如果发绿色荧光就表明被诱导至凋亡(间接损害)。
图5显示本发明较大的PAMAM树状聚合物(第9代，分子量800kDA)原子力显微镜(atomic force microscopy)(AFM)成像后的图象。大小和形状均一。图中同样显示了三个较大的、非共价结合的树状体的簇(clusters)。
图6显示本发明一些实施方案中成簇(clustered)的树状体的水相合成。
图7显示本发明一些实施方案中树状体的合成过程。
图8显示本发明一些实施方案中树状体的合成过程。
图9显示表明包含治疗试剂的特定树状体的毒性水平图。
图10为本发明一些实施方案中核心-壳结构图。
图11为本发明一些实施方案中包含核酸接头的核心(Gx)-壳结构图。
发明总体描述
本发明涉及新型治疗和诊断复合物。本发明尤其涉及用于疾病诊断和治疗(例如，癌症诊断和治疗)的基于树状体的多功能组合物和系统。该组合物和系统通常包含两种或多种单独的用于导向、成像、感应、和/或触发治疗或诊断物质的释放和监测细胞或组织(例如，肿瘤)对治疗反应的组分。
例如，本发明提供了含有两种或多种树状体的纳米装置，每种与一种或多种导向、成像、感应、和/或触发治疗或诊断物质的释放和监测细胞或组织(例如，肿瘤)对治疗反应的组分复合。在本发明的一些实施方案中，该纳米装置包含与另外包含上述功能的树状体亚基复合(例如，共价连接)的核心树状体。本发明证明这些组合物无毒，并且为治疗、检测和监测各种生理学状态提供了新方法。例如，在一些实施方案中，纳米装置含有将该纳米装置导向至特定细胞或组织(例如含有识别和特异性针对细胞组分的结合试剂)的树状体亚基。在其他实施方案中，纳米装置含有对细胞、细胞的组分或细胞反应成像的树状体亚基(例如，当暴露于细胞、组分或反应时提供可检测的信号)。在其他实施方案中，纳米装置含有树状体亚基，其能够提供标志物鉴定试剂，因此能直接或间接地鉴定细胞或细胞状态的存在(例如，通过标志物鉴定试剂与肿瘤特异性因子相互作用鉴定肿瘤)。在另外的实施方案中，纳米装置含有树状体亚基，其能够提供递送(delivery)或释放到细胞内或受试者内的治疗或诊断试剂。
因此，本发明提供多种用于治疗和鉴定具有各种病理学或生理学状态的细胞或受试者的治疗和诊断组合物。本发明的纳米装置包含许多树状体组分以提供所需的功能。例如，在肿瘤治疗中，本发明提供包含共价连接至单独的树状体单位的核心树状体的纳米装置，其中单独的树状体单位分别含有标志物鉴定试剂、成像试剂、治疗试剂、导向试剂、和监测试剂。例如，对于乳腺癌(例如参见，图3显示用于乳腺癌和结肠癌的复合物；图4如上所述)，核心树状体与含有钆造影剂的第一树状体复合，用于通过MRI方法的组织成像、与含有治疗剂(例如，紫杉醇或顺铂)的第二树状体复合用于治疗肿瘤、与含有配体的第三树状体复合用于与叶酸受体结合来导向肿瘤细胞、与含有荧光组分的第四树状体复合用于检测突变的p53蛋白来鉴定肿瘤标志物、与含有细胞凋亡荧光标记的第五树状体复合用于监测使用治疗剂的治疗。在一些实施方案中，核心树状体包含任何所需的组分。在另外的实施方案中，在单一的树状体上提供两种或多种功能。
在本发明优选的实施方案中，构建了包含有上述功能的单独的树状体的文库用于产生任何目的纳米装置复合物。例如，构建了每种树状体都含有许多治疗剂中的一种的树状体文库。对导向剂、成像剂等进行了同样的过程。这些文库提供了“混合匹配”组分的能力以产生用于目的应用的最佳治疗和诊断复合物。纳米装置可能由合理地制备，或随机制备并筛选出目的活性。因此，本发明提供具有广范的治疗和诊断用途的非毒性系统。
定义
为了帮助理解本发明，如下定义一些术语和短语：
此处所用的术语“树状体复合物”指含有物理上相互联系的两种或多种树状体的复合物(例如，共价或非共价相互结合)。例如，两个互相共价相连接的树状体(例如，直接或通过连接基团)提供一种树状体复合物。
此处所用的术语“试剂”指具有生物学相关活性或性质的组分。生物学相关活性指与生物学反应或事件相关联的活性，或能够进行检测、监测、或鉴定生物学反应或事件的活性。生物学相关活性包括，但并不局限于，治疗活性(例如，改善生物学健康或防止与某种不适的生物学状态相关的连续的恶化的能力)、导向活性(例如，与生物分子或复合物结合或关联的能力)、监测活性(例如，监测生物学事件的进程或检测生物学组分的变化的能力)、成像活性(例如，观察或检测生物学组分或反应的能力)、和标志物鉴定活性(例如，识别某些细胞的组分或状态并产生可检测的预示该组分或状态存在的反应的能力)。本发明试剂并不局限于这些特定的阐述性实施例。事实上可能使用任何有益的试剂，包括递送或破坏生物学物质的试剂、化妆试剂等。在本发明优选的实施方案中，试剂与至少一种树状体相结合(例如，结合到树状体中、表面暴露于树状体表面等)。在本发明的一些实施方案中，组合物中存在两种或多种树状体，其中任何一种树状体可能具有“不同于”其他树状体试剂的试剂。“不同于”指化学组成和/或功能上彼此不同的试剂。
此处所用的术语“纳米装置”(“nanodevice”)指含有或结合一种或多种“试剂”的小型(例如，人肉眼无法看到的)组合物。纳米装置最简单的形式中包含结合至少一种提供生物学功能(例如，治疗试剂)的试剂的物理组合物(例如，树状体)。但是，纳米装置可能包含另外的组分(例如，另外的树状体和/或试剂)。本发明优选的实施方案中，纳米装置的物理组合物包含至少一种树状体和至少由一种与树状体结合的试剂提供生物学功能。
此处所用的术语“生物学活性的”指蛋白质或其它生物学活性分子(例如催化性RNA)，其具有天然产生的分子的结构性、调节性或生物化学功能。
此处所用的术语“激动剂”(agonists)指与生物活性分子相互作用时，使生物学活性分子产生变化(例如增强)，从而调节生物学活性分子的活性的分子。激动剂可能包括蛋白质、核酸、碳水化合物或其他任何能够与生物学活性分子结合或相互作用的分子。例如，激动剂可以通过直接或通过转录因子与RNA聚合酶相互作用改变基因转录的活性。
此处所用的术语“拮抗剂”(antagonist)或“抑制子”指当与生物学活性分子相互作用时，能够阻断或调节生物学活性分子的生物学活性的分子。拮抗剂和抑制子可能包括蛋白质、核酸、碳水化合物或其他任何能够与生物学活性分子结合或相互作用的分子。抑制子和拮抗剂能够影响整个细胞、器官或生物体的生物学(例如，能够减缓肿瘤生长的抑制子)。
此处所用的术语“调节”指生物学活性分子的生物学活性的变化。调节作用可以是生物学活性分子的活性增加或降低、结合特征的变化、或其他任何生物学、功能或免疫学性质变化。
术语“基因”指包含产生多肽或前体所必需的的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何一部分编码，只要能够保持所需的全长或片段的活性或功能性质(例如，酶活性、配体结合、信号传导等)即可。该术语还包括结构基因的编码区，以及位邻于编码区5’或3’末端每端大约1kb或更长的序列，该基因对应于全长mRNA。位于编码区5’端且存在于mRNA中的序列被称为5’非翻译区序列。位于编码区3’端或编码区下游且存在于mRNA中的序列被称为3’非翻译区。术语“基因”包括cDNA和基因组形式的基因。基因的基因组形式或克隆含有由称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”的非编码区序列中断的编码区。内含子是基因的一部分，其能够转录成核RNA(hnRNA)；内含子可能含有调节因子如增强子。内含子被从核上或初始转录产物上去除或“剪切掉”；因而内含子不出现在信使RNA(mRNA)转录产物中。在翻译中mRNA发挥确定新生多肽的序列或氨基酸顺序的功能。
此处所用的术语“核酸分子编码”，“DNA序列编码”，和“DNA编码”指脱氧核糖核酸链上脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因此DNA序列编码氨基酸序列。
此处所用的术语“互补”或“互补性”用以指由碱基配对规则相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可能是“部分的”，依照碱基配对规则其中只有一部分核酸碱基匹配。或者，核酸分子之间存在着“完全”或“全部”的互补性。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有很大影响。在扩增反应以及依靠核酸之间结合的检测方法中其具有重要意义。
此处所用的术语“杂交”是用来指互补核酸之间的配对。杂交和杂交强度(即核酸之间的结合强度)受诸如核酸之间的互补程度、所用条件的严谨程度、形成的杂合子的Tm、以及核酸内部的G∶C比等因素的影响。
此处所用的术语“Tm”是用来指“熔解温度”。熔解温度是指全部双链核酸分子中有一半解链成为单链时的温度。计算核酸Tm的公式本领域众所周知。如标准参考文献所示，当核酸在1M NaCl水溶液中时，可以由如下计算公式而简单估计Tm值∶Tm＝81.5+0.41(％G+C)(例如参见，Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization，Nucleic Acid Hybridization[1985])。其他参考文献包含更复杂的计算，即计算Tm时将结构以及序列特征同时考虑进去。
此处所用的术语“严谨性”是用来指进行核酸杂交时的温度、离子强度、存在其他化合物如有机溶剂等条件。本领域的技术人员将会意识到“严谨性”条件可以通过单种或一起调节如上所述的参数而改变。对于“高严谨性”条件，只有具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间才会发生核酸碱基配对(例如，在“高严谨性”条件下，只有具有大约85％同一性、优选地70-100％同一性的同源体之间才会发生杂交)。对于中等严谨性条件，在具有中等频率互补碱基序列的核酸之间会发生核酸碱基配对(例如，在“中等严谨性”条件下，在具有50-70％同一性的同源体间发生杂交)。因此，来源于遗传上不同的生物体的核酸通常需要“微弱”或“低”严谨性条件，因为其互补序列的频率通常较低。
在核酸杂交时所使用的“高严谨性条件”包含等同于以下的条件：当使用长度为大约500个核苷酸的探针时，在42℃、含有5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4·H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH调至pH7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt’s试剂和100ug/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中结合或杂交，然后在含有0.1×SSPE、1.0％SDS的溶液中、42℃下漂洗。
在核酸杂交时使用的“中等严谨性条件”包含等同于以下的条件：当使用长度为大约500个核苷酸的探针时，在42℃、含有5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4·H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH调至pH7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt’s试剂和100ug/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中杂交，然后在含有1.0×SSPE、1.0％SDS的溶液中、42℃下漂洗。
“低严谨性条件”包含等同于以下的条件：当使用长度为大约500个核苷酸的探针时，在42℃含有5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/lNaH2PO4·H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH调至pH7.4)、0.1％SDS、5×Denhardt’s试剂[每500ml 50×Denhardt’s含有：5g Ficoll(Type 400，Pharmacia)、5g BSA(Fraction V；Sigma)]和100ug/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中杂交，然后在含有5×SSPE、0.1％SDS的溶液中、42℃下漂洗。
此处所用的术语“反义”是用来指与特定的DNA或RNA序列(例如mRNA)互补的DNA或RNA序列。包含于此定义之中的反义RNA(“asRNA”)分子参与细菌的基因调节。反义RNA可由任何方法产生，包括通过将目的基因反向拼接至能够合成编码链的病毒启动子来合成反义RNA的方法。一旦引入胚胎，该转录链与胚胎产生的天然mRNA结合而形成双螺旋。然后该双螺旋阻断mRNA的进一步转录或其翻译。以这种方式可产生突变表型。术语“反义链”是用来指能够与“正义”链互补的核酸链。符号(-)(即“负”)有时用来指反义链，而符号(+)有时用来指正义(即“正”)链。
此处所用术语“抗原决定簇”是指与特定抗体接触的抗原部分(即表位)。当使用蛋白质或蛋白质片段免疫宿主动物时，蛋白质的多个区域都可能诱导抗体的产生，抗体会特异性地与蛋白质的该区域或三维结构相结合；这些区域或结构被称为抗原决定簇。抗原决定簇可能会与完整的抗原(即用来引发免疫反应的“免疫原”)竞争结合抗体。
在抗体和蛋白质或肽相互作用时使用的术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指相互作用取决于蛋白质上特定结构的存在(即抗原决定簇或表位)；换句话说，抗体识别和结合特异蛋白质结构而不是蛋白质总体。例如，如果抗体对于表位“A”是特异的，在含有标记的“A”和抗体的反应中含有表位A(或游离的未标记的A)的蛋白质的存在将会减少结合到抗体上的标记的A的量。
此处所用的术语“转基因”是指通过例如将外源基因引入至新的受精卵和早期胚胎的方法将外源基因置入到生物体内。术语“外源基因”指通过实验操作引入到动物基因组中的任何核酸(例如，基因序列)，其可能包含动物本身的基因序列，只要引入的基因不存在于与天然基因相同的位点即可。
此处所用的术语“载体”是指将DNA片段从一个细胞转移至另一个细胞的核酸分子。术语“载体(vehicle)”与“载体”有时交替使用。载体通常由质粒、细菌噬菌体、或植物或动物病毒衍生而来。
此处所用的术语“表达载体”指重组DNA分子，其含有的目的编码序列和在特定宿主生物体中表达有效连接的编码序列必需的合适的核酸序列。在原核生物中表达时必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选的)和核糖体结合位点，通常还有其他序列。已知真核细胞使用启动子、增强子和终止信号和聚腺者酸化信号。
此处所用的术语“基因转移系统”指将含有核酸序列的组合物递送至细胞或组织的任何手段。例如，基因转移系统包括但并不局限于载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和其他基于核酸的递送系统)、裸核酸微注射和基于聚合物的递送系统(例如，基于脂质体和基于金属颗粒的系统)。此处所用的术语“病毒基因转移系统”指含有病毒成分(例如，完整病毒和修饰的病毒)以协助将样品递送至目的细胞或组织的基因转移系统。此处所用的术语“腺病毒基因转移系统”指含有完整或改变了的隶属于腺病毒家族的基因转移系统。
此处所用术语“转染”指将外源DNA引入真核细胞。转染可由本领域已知的多种方法完成，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、1，5-二甲基-1.5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene)-介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染法(Lipofection)、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹(biolistics)。
此处所用术语“细胞培养”指任何体外细胞培养。此术语包括传代细胞系(例如，具有永生化表型)、原代细胞培养、有限细胞系(例如，非转化的细胞)和其他任何体外维持的细胞群体。
此处所用术语“体外”指人工环境和在人工环境内发生的过程或反应。体外环境包括但并不局限于试管和细胞培养。术语“体内”指天然环境(例如，动物或细胞)和天然环境内发生的过程或反应。
此处所用术语“测试化合物”指可用来治疗或预防疾病(disease)、病(illness)、小病(sickness)、或机体功能失调的任何化学实体、药剂、药物等。测试化合物既包含已知的也包含潜在的治疗化合物。可以通过使用本发明的筛选方法的筛选来确定化合物是否具有治疗性。“已知的治疗性化合物”指已经被证明(例如，通过动物试验或人类给药的预试验)在这类治疗或预防中有效的治疗化合物。
此处所用术语“样品”是最广义的，包括环境的和生物学样品。环境样品包括从环境如土壤和水中来源的物质。生物学样品可以是动物(包括人)样品、流体(例如，血液、血浆和血清)、固体(例如，粪便)、组织、液体食物(例如，牛奶)、和固体食物(例如，蔬菜)。
此处所用的术语“光敏剂”和“光促染料”指在暴露于光量子(hv)时能转变至激发态的物质。光敏剂和光促染料包括但并不局限于Photofrin2、苯并卟啉(benzoporphyrin)、间-四羟基苯基二氢卟酚(m-tetrahydroxyphenylchlorin)、本紫红素锡(tin etiopurpurin)、苯并二氢卟酚铜(copper benzochlorin)、和其他卟啉。
发明详述
本发明提供用于治疗和监测疾病(例如癌症)的新型系统和组合物。例如，本发明提供导向、成像、和感应病理生理学缺陷的系统和组合物，其基于疾病状态提供合适的治疗、监测对递送治疗剂的反应和鉴定残余的病变。在本发明优选的实施方案中，组合物小到足以直接进入患者或受试者细胞内。
在优选的实施方案中，本发明的系统和组合物用于在癌症治疗中的治疗和监测。但是，本发明的系统和组合物可用于许多疾病状态或其他生理学状况的治疗和监测，本发明并没有局限于任何特定疾病状态或状况的应用。本发明能特定应用的其他疾病状态包括，但并不局限于，心血管疾病、炎症和其他增生性疾病等。
在优选的实施方案中，本发明提供含有树状体亚基的纳米装置。在优选的实施方案中，纳米装置被限制在直径几百个纳米以协助内在化至细胞。
本发明优选的实施方案提供包含两种或多种不同的树状体结构的组合物，其中每种包括至少一种功能性组分，其包括但并不局限于治疗剂、生物监测组分、生物学成像组分、导向组分和鉴定细胞异常的标志物的组分等。这些组分最终形成治疗和/或诊断复合物，其中每一种不同组分定位于不同的树状体载体中。因此，治疗性纳米装置或复合物由至少两种独立的树状体载体组成，其中该载体与复合物中的至少一种其他树状体组合物特异性复合或共价连接。
下面的讨论描述了本发明一些实施方案中纳米装置的单独组分部分和制备和使用该装置的方法。为了阐明本发明的系统和组合物的设计和使用，该讨论着重于组合物用于治疗和监测乳腺癌和结肠腺癌的具体实施方案。这些具体实施方案仅旨在阐明本发明的特定优选的实施方案，并不旨在限制其范围。在这些实施方案中，本发明的纳米装置通过细胞表面部分导向肿瘤细胞，并被肿瘤细胞摄取(如通过受体介导内吞作用摄取)。本装置的成像组分使肿瘤被成像(如通过使用MRI)。在那些含有感应组分的装置中，在有特异性肿瘤标志物(例如，Muc1、Her2或突变的p53)存在时红色荧光被激发。这就使纳米装置的治疗组分中含有的治疗试剂触发性的释放。将治疗组分附着在光不稳定的保护基团上促进了释放，例如将顺铂附着在光不稳定的保护基团上，由于激光直射在那些发射如上所述激发的荧光颜色(例如，发射红色)的细胞上而被释放。可选地，治疗装置还可以具有监测肿瘤对治疗的反应的组分。例如，当药物引发细胞的细胞凋亡，细胞的崩溃酶活性可用来激发绿色荧光。这使得凋亡的细胞变为橙色(红色和绿色的混合)，然而剩余细胞仍呈红色。任何在间接损害中发生凋亡的正常细胞发绿色荧光。
正如以上示例清楚指出的那样，使用本发明的组合物有助于对肿瘤的非介入性感应、产生信号和干预。因为已经使用这项技术确定了肿瘤细胞分子改变的具体方案，所以可通过树状分子进行非介入性感应，并且其可能针对不同肿瘤表型以自动化形式使用。如果采用聚合物阵列方法，导向、感应、和治疗结合体就会被交替使用来针对不同肿瘤类型或不同的病理生理学改变。因此，阵列方法提供常见的可互换的治疗平台，其能适用于任何单独形式的肿瘤或细胞异常。
1.树状体
在本发明优选的实施方案中，纳米装置含有树状体。树状聚合物已被广泛描述(参见，Tomalia，Advanced Materials 6：529[1994]；Angew，Chem.Int.Ed.Engl.，29：138[1990]；此处全文引用作为参考)。树状体聚合物可以被合成为指定的球状结构，通常直径从1到20纳米。图1显示了几代聚氨基酰胺(polyamidoamine)(B-丙胺酸亚基)树状体。分子量和末端基团的数目作为聚合物代次(层数)的函数以指数增长。基于起始聚合过程的核心结构可以合成不同类型的树状体。
树状体核心结构决定分子的几个特征如总体形状、密度和表面官能度(functionality)(Tomalia-等，Chem.Int.Ed.Engl.，29：5305[1990])。球形树状体以氨作为三价引发剂(initiator)核心或乙(撑)二胺(EDA)作为四价的引发剂核心。最近描述的棒状树状体(Yin等，J.Am.Chem.Soc.，120：2678[1998])使用不同长度的聚乙烯亚胺线性核心；核心越长，棒越长。可以从商业途径获得千克级的、并且是在当前优质生产规范(GMP)下生产的树状体大分子用于生物技术应用。 树状体可以通过许多技术进行鉴定，其中包括但并不局限于，电子喷射-离子化质谱、13C核磁共振谱、高效液相色谱、具有多角度激光散射的大小排阻色谱、毛细管电泳和凝胶电泳。这些测试保证聚合物群体的均一性，并对于GMP应用和体内使用的树状体生产的质控的监测十分重要。已经对树状体进行了广泛的研究，体内研究中未发现其静脉给药时的毒性(Roberts等，J.Biomed.Mat.Res.，30：53[1996]和Bourne等，J.Magn.Reson.Imag.，6：305[1996])。
许多美国专利描述了生产树状体的方法和组合物。下面列出了这些专利中的一部分用以描述一些可能对本发明十分有用的树状体组合物。但是必须意识到这些仅仅是阐述性实施例，许多其他类似的树状体组合物也可用于本发明。
美国专利4,507,466、美国专利4,558,120、美国专利4,568,737、和美国专利4,587,329每一个都描述了制造末端密度大于常规星状聚合物的致密星状聚合物的方法。这些聚合物的均一反应性大于/多于常规星状聚合物，即第三代致密星状聚合物。这些专利进一步描述了氨基胺(amidoamine)树状体的性质和聚合物的三维分子直径。
美国专利4,631,337描述了水解稳定性聚合物。美国专利4,694,064描述了棒状聚合物。美国专利4,713,975描述了致密星状聚合物及其在鉴定病毒、细菌和蛋白质(包含酶)表面的应用。美国专利4,737,550描述了桥联致密星状聚合物。美国专利4,857,599和美国专利4,871,779描述了固定于核心上、用作离子交换树脂、鳌合树脂的致密星状聚合物以及制造这种聚合物的方法。
美国专利5,338,532涉及树状体的星爆(starburst)缀合体，其与至少一单位携带的农业、药物或其他物质相结合。该专利描述了使用树状体来提供递送每单位聚合物高浓度运载的物质、控制递送、导向递送和/或递送多种物质诸如药物抗生素、普通或特异的毒素、金属离子、放射性核素、信号发生器、抗体、白细胞介素、激素、干扰素、病毒、病毒片段、杀虫剂和抗微生物剂等的方法。
美国专利5,387,617、美国专利5,393,797和美国专利5,393,795中描述了其他有益的树状体形式组合物，其中通过带上能提供疏水外壳的疏水基团，对致密星状聚合物而进行修饰。美国专利5,527,524公开了氨基末端树状体在抗体缀合体中的应用。
美国专利5,560,929描述了树状体作为金属离子载体的用途。美国专利5,773,527公开了非交联的多分枝的具有梳爆(comb-burst)构型的聚合物以及制造它们的方法。美国专利5,631,329描述了生产高分子量多分枝的聚合物的方法，其首先形成避免其产生分枝的第一批分枝聚合物；嫁接至核心；第一批分枝聚合物去保护，然后形成避免其产生分枝的第二批分枝聚合物并嫁接至具有第一批分枝聚合物的核心上等等。
美国专利5,902,863描述了含有亲脂性有机硅氧烷和亲水性polyanicloamine nanscopic结构域的树状体网络。该网络由具有PAMAM(亲水性)或聚甲基吖丙啶(polyproyleneimine)内部和有机硅外层的共聚树状体前体制备。这些树状体具有可控制的大小、形状和空间分布。它们是具有有机硅外层的疏水性树状体，该外层可用于专业膜、保护性包被、含有有机的有机金属添加物或无机添加物的复合材料、表皮修补递送(skin patch delivery)、吸收剂、色谱个人防护产品和农业产品。
美国专利5,795,582描述了树状体作为流感抗原的佐剂的用途。使用树状体可以用减少的抗原剂量产生抗体滴度水平。美国专利5,898,005和美国专利5,861,319描述了确定分析物浓度的特异性免疫结合试验。美国专利5,661,025提供了包含树状体聚阳离子以帮助核苷酸至靶位点的递送的自我组装多核苷酸递送系统的详细内容。该专利提供将多核苷酸体外引入真核细胞的方法，其包含将细胞与含有多核苷酸和非共价耦联至多核苷酸的树状体聚阳离子的组合物接触。
用于体外诊断应用的树状体-抗体缀合体早已被证明(Singh等，Clin.Chem.，40：1845[1994])，可用于产生树状体-鳌合剂-抗体构建体，和用于构建硼化的树状体-抗体嵌合体(用于中子捕获治疗)；后面化合物中的每一种都可作为肿瘤治疗剂(Wu等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，4：449[1994]；Wiener等，Magn.Reson.Med.31：1[1994]；Barth等，Bioconjugate Chem.5：58[1994]；和Barth等)。
一些此类辍合体已被用于肿瘤的磁共振成像(Wu等，[1994]andWiener等，[1994]，同前)。该工作的结果证明，当体内给药时，抗体可指导树状体结合的治疗试剂至产生抗原的肿瘤。同时还表明树状体特异性地进入细胞，并携带化学治疗试剂或遗传治疗剂。研究尤其显示将顺铂装填至树状体聚合物增加了效率，并且毒性小于通过其他方式的递送的顺铂(Duncan和Malik，Control Rel.Bioact.Mater.23：105[1996])。
树状体也可以与荧光染料或分子标志(molecular beacons)缀合并显示进入了细胞。然后可以与感应装置兼容的方式在细胞内部检测到，用于评估细胞内部的生理学变化(Baker等，Anal.Chem.69：990[1997])。最后，已构建了为分化的模块共聚物的树状体，其中分子的外面部分可以被酶或光诱导的催化作用降解(Urdea和Hom，Science261：534[1993])。这将使聚合物可控制的降解以在疾病位点释放治疗试剂，并且提供外源触发释放治疗试剂的机制。
尽管已表明单一聚合物具备这些特定的功能，但至今还没有具有明确结构的、包含一种以上该特征的装置的说明。本发明提供这类纳米装置，其中两种或多种树状体，每种具有特异性功能，组合成单一的复合物。例如，本发明优选的复合物由单一树状体组分(modules)围绕核心树状体构建而成。这提供了图2所示的核心-壳树状体或簇分子。在构建多树状体复合物之前，制备每种具有不同活性的单独的缀合体，例如产生用于感应的树状体缀合体、用于导向的树状体缀合体和用于治疗剂载体的另外的树状体缀合体。然后将这些不同的树状体组分簇合在一起并且共价连接，以产生单一的治疗装置或复合物。
在这个方法中，一种树状体作为核心，其他壳型树状体围绕核心共价连接。在优选的实施方案中，核心分子是胺末端树状体。壳试剂树状体拥有羧酸/酯基团，使其通过形成酰胺而共价连接至核心。将相同的或更高代次的有不同功能性基团的氨基末端树状体的高度浓缩混合物加入到核心树状体中。然后通过在核心的末端胺基团和功能性外层树状体的自由末端羧酸基团之间形成酰胺而形成簇。由于空间诱导的化学计量，在核心树状体和每个外层树状体之间会形成有限数目的键。在一些实施方案中，使用摩尔数过剩的外层树状体来倾斜反应，使每个外层核树状体仅与单一的核心分子反应。
I.治疗试剂
本发明使用了广泛的治疗试剂。任何可与树状体结合的治疗试剂都可以使用本发明的这种方法、系统和组合物递送。为了阐述治疗试剂的递送，下面的讨论主要着重于治疗癌症的顺铂和紫杉醇的递送。也讨论了多种光促治疗化合物和多种抗微生物化合物。
i.顺铂和紫杉醇
顺铂和紫杉醇具有明确的诱导肿瘤细胞凋亡的作用(例如参见，Lanni等，Proc.Natl.Acad.Sci.，94：9679[1997]；Tortora等，Cancer Research 57：5107[1997]；和Zaffaroni等，Brit.J.Cancer77：1378[1998])。但是，使用这些和其他化学治疗试剂治疗很难避免产生明显毒性作用。现今使用的试剂通常水溶性很差、毒性较大，并且使用剂量通常会在作用于病变细胞的同时也作用正常细胞。例如，发现的一种极具希望的抗肿瘤化合物紫杉醇(paclitaxel)(紫杉醇)很难溶于水。紫杉醇在许多肿瘤模型(例如B16黑色素瘤、L1210白血病、MX-1乳腺肿瘤和CS-1结肠肿瘤异种移植)中显示出极好的抗肿瘤活性。但是，紫杉醇较差的水溶性导致在给人用药时出现问题。因此，现今使用的紫杉醇制剂需要克列莫佛(cremaphor)来溶解药物。人临床剂量范围是200-500mg。该剂量溶于乙醇：克列莫佛(1∶1)溶液，并稀释至1升静脉给药流体中。现今使用的克列莫佛为聚乙氧基化蓖麻油。将药物溶于克列莫佛混合物并用至大体积的水样载体稀释后进行输注。直接给药(例如，皮下)会导致局部毒性和低水平活性。因此，这些化学治疗试剂需要更有效的递送系统。
本发明通过提供特异性药物递送方法和组合物克服了这些问题。本发明还提供施用组合试剂的能力(例如，两种或多种不同治疗试剂)来产生额外的效果。多种试剂的使用可用来对抗对任何单个试剂有抗性的疾病。例如，已有一些肿瘤对单个药物(紫杉醇)的抗性的报道(Yu等，Molecular Cell.2：581[1998])。本发明中所进行的实验证明缀合至树状体的顺铂甚至能够有效杀灭对顺铂有抗性的肿瘤细胞(参见实施例4)。尽管实践本发明不必去理解机制，并且本发明并不受此局限，但可以预期的是树状体缀合体能够防止多药物耐药通道将顺铂泵到细胞外。
本发明还提供在给受试者递送顺铂和/或紫杉醇后监测治疗成功性的机会。例如，有报道表明测量这些药物体外引发凋亡的能力可以作为体内效率的标记(Gibb，Gynecologic Oncology 65：13[1997])。因此，除了一种或全部药物的定向递送来产生有效的抗肿瘤治疗和减少毒性外，还可以通过本发明的监测调亡的诱导技术来测量治疗效率。重要的是，每种治疗针对许多肿瘤类型都有活性，其中包括但并不局限于乳腺癌和结肠癌(Akutsu等，Eur.J.Cancer 31 A：2341[1995])。
尽管上述讨论描述了两种特异性试剂，但任何常规用于癌症治疗的药剂都可以用于本发明。在本发明的癌症治疗中，纳米装置的治疗性组分可能包括，但并不局限于亚德里亚霉素、5-氟尿嘧啶、鬼臼亚乙基苷、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、或优选地顺铂化合物。如此处描述，该试剂可以通过免疫治疗试剂组合制备或用作联合的治疗组合物或试剂盒。
在本发明的一些实施方案中，树状体系统还包含一种或多种试剂(其能直接交联核酸(例如DNA)用以促进DNA损伤)而产生本发明的增效、抗肿瘤试剂。可以使用诸如顺铂和其他DNA烷化剂。顺铂广泛应用于治疗癌症，其临床应用的有效剂量为每三周5天，每天20mg/M2，总共为3个疗程。纳米装置可经由任何合适的方法递送，包括但并不局限于，静脉、皮下、肿瘤内、腹腔内或局部注射(例如，粘膜表面)。
导致DNA损伤的试剂还包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这些化学治疗化合物包含亚德里亚霉素(也被称作阿霉素)、鬼臼亚乙基苷、戊脉安、鬼臼毒素等。广泛用于临床肿瘤治疗的这些化合物通过快速静脉注射给药，剂量为给予25-75mg/M2的亚德里亚霉素，间隔21天后，给予35-50mg/M2的鬼臼亚乙基苷，或口服两倍于静脉的剂量。
破坏核酸前体和亚基合成和忠实性的试剂也导致DNA损伤，并且可用于本发明的化学治疗试剂。已经开发了许多核酸前体。尤其有用的试剂是经过了广泛测试和容易得到的试剂。同样地，优选5-氟尿嘧啶用于肿瘤组织，使该试剂对于导向肿瘤细胞尤其有用。递送剂量可以为3-15mg/kg/天，尽管按照不同因素如病程、细胞对治疗的顺从性、对试剂抗性大小等，其他剂量可能变化较大。
本发明使用的抗癌治疗试剂是那些容易结合到树状体结构内的试剂，或与树状体结构结合的试剂，这样它们就不会损失其抗癌效果的忠实性而被递送至受试者、组织、或细胞。有关癌症治疗试剂诸如铂复合物、戊脉安、鬼臼毒素、卡铂(carboplatin)、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、二液体三氧化硫(bisulfan)、亚硝基脲(nitrosurea)、亚德里亚霉素、放线菌素D、道诺霉素、阿霉素、博来霉素、光辉霉素(plicomycin)、丝裂霉素、鬼臼亚乙基苷(etoposide)(VP16)、三苯氧胺、紫杉醇、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱、和甲氨蝶呤以及其他类似的抗肿瘤试剂的详细描述，本领域技术人员可参考许多的指导手册，包括但并不局限于，Physician’s Desk Reference andto Goodman and Gilman’s“Pharmaceutical Basis of Therapeutics”ninth edition，Eds.Hardman等，1996.
在优选的实施方案中，将药物优选地通过光可裂解的接头被附着在纳米装置上。例如，Ottl等描述了本发明使用的几种异双功能、光可裂解接头(Ottl等，Bioconjugate Chem.，9：143[1998])，这些接头可以是水溶性或有机溶性的。它们含有活化的能够与胺或醇反应的酯和与硫羟基反应的环氧化物。在两个基团之间是3，4-二甲氧基-6-硝基苯基光异构化基团，当其暴露于近紫外光(365nm)下时，释放出完整形式的胺或醇。因此，当使用这类接头将治疗试剂连接至本发明组合物时，其可通过靶区域暴露于近紫外光以生物活性或可激活形式而被释放。
在一个示范性实施方案中，紫杉醇的醇基与有机溶解性的接头活化的酯基反应。该产物接着与合适的树状体的部分硫羟化的表面反应(通过与亚化学计量的2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolano)反应，树状体上的伯胺可以部分地转变为含有硫醇的基团)。对于顺铂，药物的氨基基团与水溶性形式的接头反应。如果氨基基团活性不够，可以使用含有伯氨基的顺铂活性类似物，如Pt(II)二氯磺胺嘧啶(Pasani等，Inorg.Chim.Acta 80：99[1983]和Abel等，Eur.J.Cancer 9：4[1973])。因此缀合以后，药物呈惰性，将不会损害正常细胞。当缀合体定位于肿瘤细胞内时，其暴露于合适的近紫外光波长的激光时，使活性药物释放进细胞。
类似地，本发明的其他实施方案中，将顺铂的氨基(或其类似物)与高度疏水的光可裂解的保护性基团(例如2-硝基苄氧基羰基基团(Pillai，V.N.R.Synthesis：1-26[1980])连接。附着于这个疏水基团后，通过疏水腔药物被装载至并非常优选地停留在PAMAM树状体内(例如参见，Esfand等，Pharm.Sci.，2：157[1996])，与水环境绝缘。当暴露于近紫外光(大约365nm)时，疏水基团被裂解，剩下完整的药物。因为药物本身是亲水性的，它从树状体扩散出来并且进入到肿瘤细胞内，并在肿瘤细胞内启动凋亡。
光可裂解接头的替代物是酶可裂解接头。许多光裂解接头被证明是有效的抗癌缀合体，并且其可通过合适的短肽接头附着肿瘤治疗剂(如阿霉素)至水溶性聚合物而进行制备(例如参见，Vasey等，Clin.Cancer Res.，5：83[1999])。该接头在细胞外是稳定的，但一旦进入细胞就被硫醇蛋白酶裂解。在优选的实施方案中，使用PK1缀合体。作为光可裂解接头方案的替代物，可以使用酶可降解接头，如Gly-Phe-Leu-Gly。
本发明并不受治疗技术的性质的局限。例如，本发明使用的其他缀合包括，但并不局限于，使用BNCT的缀合的硼吸尘器(borondusters)(Capala等，Bioconjugate Chem.，7：7[1996])、使用放射同位素和将缀合毒素如蓖麻毒蛋白缀合至纳米装置。
ii.光促治疗
在本发明中也可使用光促治疗试剂作为治疗试剂。在一些实施方案中阐述了本发明的含有光促化合物的树状体组合物，其能够产生可扩散出无纤维辐射状效应器的单线态氧和自由基来作用于生物学靶标(例如，肿瘤细胞或细菌细胞)。一些优选的光促化合物包括，但并不局限于那些能够参与II型光化学反应的物质：
其中PS＝光敏剂，PS*(1)＝激发的单线态PS，PS*(3)＝激发的三线态PS，hν＝光量子，*O2＝激发的单线态氧，T＝生物靶标。其他用于本发明的光促化合物包含那些能够通过不同于单线态氧产生的机制导致细胞毒性的物质(例如，苯并二氢卟酚铜，Selman等，Photochem.Photobiol.，57：681-85[1993]，在此引用作为参考)。用于本发明光促化合物实施例包括，但并不局限于，Photofrin2、酞菁(phtalocyanins)(例如参见，Brasseur等，Photochem.Photobiol.，47：705-11[1988])、苯并卟啉(benzoporphyrin)、四羟基苯基卟啉、萘菁(naphtalocyanines)(例如参见，Firey和Rodgers，Photochem.Photobiol.，45：535-38[1987])、sapphyrins(Sessler等，Proc.SPIE，1426：318-29[1991])、卟吩酮(porphinones)(Chang等，Proc.SPIE，1203：281-86[1990])、本红紫素锡(tin etiopurpurin)、酯置换的卟啉(Pandey等，Photochem.Photobiol.，53：65-72[1991])和阳离子染料如吩噁嗪等(例如参见，Cincotta等，SPIE Proc.，1203：202-10[1990])。
在其他实施方案中，将直接产生自由基的毒性试剂(即不产生单线态氧)在聚合过程中结合至无纤维辐射性的效应器。该方法可使用更大和寿命更长的无纤维辐射性效应器，并且不受局部氧供应的限制。这类毒性试剂包括但并不局限于2-甲基-4-硝基-喹啉-N-氧化物(Aldrich)和4，4-二硝基-(2，2)双吡啶基(bipyridinyl)-N，N-二氧化物(Aldrich)，当用360-400nm光照射时，它们能产生羟基自由基(Botchway等，Photochem.Photobiol.67(7)：635-40[1998])；孔雀绿和异呋喃(isofuran)蓝(Molecular Probes)，在大约630nm光激发下它们产生羟基自由基(Jay等，PNAS 91：2659[1994]；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，6th ed.，Molecular Probes，Eugene，OR[1994])；亚硝酰基五氯钌酸钾(Molecular Probes)(abs＝516nm)，Roussin’s黑盐和Roussin’s红盐(abs 313-546nm)是对细胞产生毒性的NO的来源(Murphy等，Neuropharm.33：1375-85[1994]；Bourassa等，JACS 119：2853-60[1997])；和其他光解氮氧化物以及羟基供体(De Leo和Ford，JACS121：1980-81[1999])。
iii.抗微生物治疗试剂
抗微生物治疗试剂在本发明中同样可以作为治疗试剂。可以使用任何可以杀灭、抑制、或减弱微生物功能的试剂，以及任何预计具有这些功能的试剂。抗微生物试剂包括但并不局限于，天然和合成的抗生素、抗体、抑制性蛋白质、反义核酸、膜破裂剂等，单独或组合使用。事实上，任何类型的抗生素都可以使用，其包括，但并不局限于抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂等。
III.标志物鉴定试剂
在特定实施方案中，本发明的纳米装置含有一种或多种能够被标志物组分(“标志物”)激活，或能够与标志物相互作用的标志物鉴定试剂。在优选的实施方案中，该标志物鉴定试剂是能够特异性结合标志物(例如，待导向细胞特异性的细胞表面分子)的抗体，优选地是单克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，肿瘤细胞被鉴定。肿瘤细胞具有多种标志物，包含已明确表达的癌症特异性抗原，诸如乳腺癌中的Muc1、Her-2和突变p53。这些分子作为癌症的特异性标志物，存在于30％(HER-2)到70％(突变p53)的乳腺癌中。在优选的实施方案中，本发明的纳米装置包含能够特异性结合乳腺癌中的突变形式p53的单克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，鉴定了表达易感基因的癌细胞。例如，在一些实施方案中，有两种能够作为乳腺癌特异性标志物的乳腺癌易感基因：17号染色体上的BRCA1和13号染色体上的BRCA2。当个体携带有BRCA1或BRCA2的突变时，在其生命的一些时刻被诊断出乳腺癌或卵巢癌的风险就会增大。这些基因参与修复双链DNA中辐射诱导的断裂。据推测BRCA1或BRCA2上的突变可能会使这个机制失活，导致DNA复制中更多的错误，并最终导致肿瘤样生长。
此外，多种不同细胞表面受体的表达可作为结合和摄取纳米装置的靶标。这类受体包括，但并不局限于EGF受体、叶酸受体、FGR受体2等。
在本发明的一些实施方案中，标志物组分为与染色体畸变相关联的基因表达的变化。例如，Burkitt淋巴瘤是由涉及Myc基因的染色体易位导致的。染色体易位意味着染色体断裂，使其与其他染色体的一部分结合。Burkitt淋巴瘤中的典型的染色体易位涉及8号染色体，Myc基因的位点。这改变了Myc基因的表达方式，由此破坏了它控制细胞生长和增值的正常功能。
在其他实施方案中，与结肠癌相关联的基因表达被鉴定为标志物组分。已知有两个关键基因参与了结肠癌：2号染色体上的MSH2和3号染色体上的MLH1。正常情况下，这些基因的蛋白质产物帮助修复DNA复制过程中的错误。如果MSH2和MLH1蛋白质发生突变，该复制错误无法修复，导致DNA损伤和结肠癌。参与多种内分泌瘤形成的MEN1基因已经被发现多年，位于11号染色体上，于1997年被精确定位，并作为此类癌症的标志物。在本发明优选的实施方案中，将特异性针对变化了的蛋白质或表达的待检测的基因的抗体复合至本发明的纳米装置上。
在另外的实施方案中，结肠腺癌明确表达CEA和突变p53，两者都是充分证明的肿瘤标志物。在一些细胞系中p53的突变与一些乳腺癌细胞中观察到的相类似，可在两种用于每种肿瘤的纳米装置之间共享p53感应组分(即在组装纳米装置时，含有相同标志物鉴定试剂的树状体可以用于每种癌症类型)。使用细胞系在裸鼠中产生肿瘤可准确研究结肠癌和乳腺癌细胞，并能在动物中优化和鉴定。
从以上讨论可以清楚地认识到本发明使用了许多不同的肿瘤标志物，其中的一些对某种特定癌症类型特异，而其他的起源比较混杂。本发明并不局限于任何特定的肿瘤标志物或其他任何疾病特异性标志物。例如作为本发明标志物的肿瘤抑制因子包括，但并不局限于p53、Muc1、CEA、p16、p21、p27、CCAM、RB、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-1、MEN-II、p73、VHL、FCC和MCC。
IV.生物成像组分
在本发明的一些实施方案中，纳米装置包含至少一种基于树状体的纳米范围的能够容易成像的该试剂可以通过(nanoscopic)结构单元。本发明并不受所用成像组分的性质的限制。在本发明的一些实施方案中，成像组分包含表面修饰的量子点(例如参见，Chan和Nie，Science 281：2016[1998])，如耦联至生物分子的锌硫加帽的镉硒化物(Sooklal，Adv.Mater.，10：1083[1998])。
但是，在优选的实施方案中，成像组分包含符合“纳米组合物”概念的树状体(Balogh等，Proc.of ACS PMSE 77：118[1997])和Balogh and Tomalia，J.Am.Che.Soc.，120：7355[1998])。在这些实施方案中，通过反应性胶囊化产生树状体，其中一种反应物被树状体模板预先有机化，其随后通过另一种反应物被固定于聚合物分子内/上。这些纳米颗粒的大小、形状、大小分布和表面官能度(functinality)由树状大分子决定和控制。这些物质具有可溶性和宿主兼容性，并且具有客体(guest)分子(即允许成像的分子)的光学或生理学特性。树状体宿主按照介质不同可能会有不同，有可能使用不同化合物和在不同的客体浓度水平充填(load)树状体宿主。复合物和组合物可能涉及使用许多金属或其他无机物。这些高电子密度的物质大大简化了电子显微镜成像和相关散射技术。此外，在存在或缺少干扰性生物学物质的情况下，无机原子的性质给成像引入了新的和可测量的性质。在本发明的一些实施方案中，将金、银、钴、铁原子/分子和/或有机染料分子诸如荧光素封装至树状体，用于纳米范围(nanoscopi)的组合物标记/示踪剂，尽管可以使用任何协助成像或检测的物质。
在本发明的一些实施方案中，成像基于被调查的复合物物质的选定的物理性质局部密度差别的被动或主动观察结果。这些差别可能是由于不同的形状(例如，通过原子力显微镜检测到的质量密度)、改变的组合物(例如，通过X射线检测的辐射不透过)、不同的光发射(例如，由分光光度测定法检测的荧光染料)、不同的光衍射(例如，由TEM检测的电子束)、对比吸收(例如，由光学方法检测的光)、或特异的辐射发射(例如，同位素方法)等。因此，成像的质量和灵敏度取决于观察的性质和所使用的技术。针对癌细胞的成像技术必须提供足够水平的灵敏度以观察小的、局部浓度的选定细胞。癌症标志物的最早期鉴定需要高度的选择性(即通过合适导向提供的高度特异性的识别)和最大可能的灵敏度。
A.磁共振成像
一旦被导向的纳米装置附着在(或被内在化于)肿瘤细胞，装置上的一种或多种组分负责其位置的成像。已经采用树状体作为生物医学成像试剂，可能最著名是用于磁共振成像(MRI)对比增强试剂(例如参见，Wiener等，Mag.Reson.Med.31：1[1994]；使用PAMAM树状体的例子)。通常将鳌合的顺磁性的(paramagnetic)离子如Gd(III)-二乙烯基三胺戊乙酸(Gd(III)-DTPA)缀合至水溶性树状体来构建这些试剂。本发明中可使用的其他顺磁性离子包括，但并不局限于钆、锰、铜、铬、铁、钴、铒、镍、铕、锝、铟、钐、镝、钌、镱、钇、和钬离子以及其组合物。本发明的一些实施方案中，树状体还缀合至导向基团如表皮生长因子(EGF)，使缀合体特异性地结合至目标细胞类型(例如，对于EGF，表达EGFR的肿瘤细胞)。本发明优选的实施方案中，如Wiener的描述(Wiener等，Mag.Reson.Med.31：1[1994])，DTPA经由DTPA的异硫氰酸盐附着于树状体上。
树状体的多价性、大小和构造使树状MRI试剂特别有效，产生了较大质子松弛增强性、高分子松弛性、和在靶位点高效浓度的偏磁性离子的分子。使用动态MRI树状钆造影剂甚至用于区分良性和恶性乳腺癌，基于怎样使后者类型肿瘤的脉管系统成像更致密(Adam等，Ivest.Rad.31：26[1996])。因此，MRI提供了本发明非常有用的成像系统。
B.显微成像
肿瘤细胞和组织的静态结构显微成像通常在患者体外进行。典型的组织活检组织学提供了精确的阐述例，并且证明是肿瘤诊断和治疗的强有力的辅助手段。样品取出后被切成薄片(例如，小于40微米)、染色、固定、并由病理学家检查。如果获得了图象，则通常是2-D透射亮视野投影图。应用特殊染料来提供选择性对比度，其在未染色组织中几乎看不到，还提供异常细胞构成物的鉴定。由于样品极薄和缺乏整体3-D信息而引起组织学内容的丢失，使用计算机辅助分析对亚细胞结构特征量化(如核倍数性确定)时经常会混淆。尽管静态成像方法的局限性，但它在活检组织中的肿瘤鉴定中的价值是非常重要的。此外，它的使用通常是决定开展介入性和风险组合治疗的关键性因素，组合治疗包含化学治疗、外科程序、和放射治疗，这些方法通常伴有严重的间接组织损伤、并发症、甚至患者的死亡。
本发明的纳米装置能进行肿瘤的功能性显微成像和提供改进的成像方法。该方法可体内、体外和离体内(ex vivo)使用。例如，在本发明的一个实施方案中，本发明的树状体被设计成暴露于光时能够发射光或其他可检测信号。尽管标记的树状体可以在物理学上小于显微镜技术的光学分辨率极限，但当受激发时它们变成自我发光的物体，并可使用光学技术容易地观察和测量。在本发明的一些实施方案中，显微镜的感应荧光生物传感器涉及使用可调激发和发射滤色片和多波长光源(Farkas等，SPEI 2678：200[1997])。在成像试剂位于深层组织的实施方案中，使用处于近红外(NIR)的长波(例如参见，Lester等，Cell Mol.Biol.44：29[1998])。近红外的树状生物传感已通过树状生物传感天线状构造得以证明(Shortreed等，J.Phys.Chem.，101：6318[1997])。本发明使用的生物传感器包括，但并不局限于荧光染料和分子标志。
在本发明的一些实施方案中，使用功能性成像技术来达到体内成像。与静态结构成像相比，功能性成像是一个补充性和更强有力的潜在技术。功能性成像以其在宏观(macroscopic)范围的应用而著名，例如包括功能性磁共振成像(MRI)和正电子放射X线断层术(PET)。但是，功能性显微成像也可在体内和离体内分析活组织中开展和应用。功能性显微成像是3-D成像、3-D空间多光谱容积分配、和临时采样的有效组合，简言之，是一类3-D光谱显微影片循环(microscopic movieloop)。有趣的是，细胞和组织会自发荧光。当被几个波长激发时，不用特殊标记，就可以提供鉴定几种细胞组分(例如，核)所需的大量基本3-D结构。倾斜光照射对于收集结构信息也十分有用，并被常规应用。与结构光谱显微成像相反，功能性光谱显微成像也可用于生物传感器，其能在细胞或组织内部定位生理学信号。例如，在本发明的一些实施方案中，本发明含有生物传感器的树状体用于对上调的受体家族如叶酸或EGF类的成像。在这类实施方案中，功能性生物传感因此参与癌发生或恶性肿瘤相关的生理学异常的检测，甚至在早期都能实现。许多生理学状态都可以用本发明的组合物和方法进行成像，其包括但并不局限于，用于检测pH、氧浓度、Ca2+浓度、和其他生理学相关分析物的纳米范围树状生物传感器。
V.生物学监测组分
本发明纳米装置的生物学监测或感应组分是能够监测由试剂(例如，由纳米装置治疗组分提供的治疗试剂)引起的肿瘤细胞特定反映的物质。而本发明并不局限于任何特定的监测系统，本发明由监测肿瘤治疗的方法和组合物而阐明。在本发明优选的实施方案中，试剂引起细胞凋亡和监测涉及凋亡的检测。在特定实施方案中，监测组分是凋亡发生时在特定波长下发生荧光的试剂。例如，在优选的实施方案中，崩溃酶活性激活监测组分中的绿色荧光。凋亡的肿瘤细胞)由于被含有红色标记的特定标志物的导向而成为红色(变为橙色，而剩余肿瘤细胞仍保持红色。如果存在被诱导进行凋亡的正常细胞(例如，通过间接损伤)，其则呈绿色荧光。
在这些实施方案中，监测组分中采用了荧光基团如荧光素。经由异硫氰酸盐衍生物(可由Molecular Probes，Inc获得)，荧光素极易被附着于树状体表面。这就使纳米装置和细胞能够通过共焦显微镜而成像。
优选地通过使用荧光性肽酶底物来达到感应纳米装置的效果。例如，治疗试剂造成的凋亡导致多肽酶崩溃酶-1(ICE)的产生。Calbiochem出售用于产生荧光部分的这种酶的许多肽底物。用于本发明的尤其有用的肽是：
MCA-Tyr-Glu-Val-Asp-Gly-Trp-Lys-(DNP)-NH2(SEQ ID NO：1)
其中MCA是(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基，DNP是2，4-二硝基苯基基团(Talnian等，J.Bio1.Chem.，272：9677[1997])。在该肽中，由于荧光共振能量向DNP基团的转移(FRET)，MCA基团具有极度减弱的荧光。当酶在天冬氨酸和甘氨酸残基之间裂解该肽时，MCA和DNP分开，并且MCA基团发出强烈的绿色荧光(最大激发在325nm和最大发射在392nm)。
在本发明优选的实施方案中，将该肽赖氨酸末端连接至纳米装置，造成MCA基团在裂解时释放至细胞溶质。该肽赖氨酸末端是用于缀合的有用的合成柄，因为例如它能够与双功能接头如Mal-PEG-OSu的活化酯基团作用。因此使用这些方法在靶细胞中产生的绿色荧光提供了凋亡已经开始的清晰指示(如果细胞由于聚集的量子点的存在而具有红色的话，细胞由于颜色组合而呈橙色)。
本发明应用的其他荧光染料包括，但并不局限于吖啶橙(据报道其对于凋亡细胞的DNA变化较为敏感)(Abram等，Development 117：29[1993])和顺-十八碳四烯酸(其对于伴随凋亡的脂质过氧化作用较为敏感)(Hockenbery等，Cell 75：241[1993])。必须注意的是肽和荧光染料只不过是范例。可以预期本发明可以使用任何能够有效地作为由凋亡引起的崩溃酶底物的肽。
VI.导向组分
如上所述，本发明另一个组分是纳米装置组合物能够特异导向于特定细胞类型(例如肿瘤细胞)的组分。纳米装置通常通过细胞表面部分导向肿瘤细胞，并通过受体介导的内吞作用被摄入细胞。
任何已知位于靶细胞(例如肿瘤细胞)表面的部分都可用于本发明。例如，定向针对该部分的抗体导向本发明组合物于含有该部分的细胞表面。另外，导向部分可以是定向于呈现在细胞表面的配体或反之亦然。类似地，维生素也可用于导向本发明的治疗试剂至特定细胞。
在本发明的一些实施方案中，导向部分也可以发挥标志物组分的功能。例如，肿瘤特异性抗原包括，但并不局限于，癌胚抗原、前列腺特异抗原、酪氨酸酶、ras、唾液路易斯(sialyly lewis)抗原、erb、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、MN、gp100、gp75、p97、蛋白酶3、粘蛋白、CD81、CID9、CD63；CD53、CD38、CO-029、CA125、GD2、GM2和O-乙酰基GD3、M-TAA、M-胎或M-尿都可以在本发明中应用。另外，导向部分可以是肿瘤抑制因子、细胞因子、化学因子、肿瘤特异性受体配体、受体、凋亡诱导物、或分化试剂。
可用于导向的肿瘤抑制蛋白质包括，但并不局限于，p16、p21、p27、p53、p73、Rb、Wilms肿瘤(WT-1)、DCC、I型神经纤维瘤(NF-1)、von Hippel-Lindau(VHL)病肿瘤抑制因子、Maspin、Brush-1、BRCA-1、BRCA-2、多肿瘤抑制因子(MTS)、人黑色素瘤gp95/97抗原、肾细胞癌相关G250抗原、KS 1/4泛-癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺特异性抗原、黑色素瘤抗原gp75、CD9、CD63、CD53、CD37、R2、CD81、COO29、TI-1、L6和SAS等。当然这些仅为范例性的治疗抑制因子，本发明可能使用其他任何属于或成为本领域技术人员已知的治疗抑制因子的试剂。
在本发明优选的实施方案中，导向涉及致癌基因表达的因子。其包括，但并不局限于，酪氨酸激酶(不论膜结合的还是细胞质形式的)，例如Src家族成员，丝氨酸/苏氨酸激酶，如Mos，生长因子和受体，例如血小板衍生的生长因子(PDDG)，SMALL GTP酶(G蛋白)包括ras家族，细胞周期蛋白-依赖的蛋白质激酶(cdk)，myc家族成员包括c-myc、N-myc、和L-myc，以及bcl-2和家族成员。
可被本发明导向的细胞因子包括，但并不局限于，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、ILA1、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、TNF、GMCSF、β-干扰素和γ-干扰素等。可使用的化学因子包括，但并不局限于，M1P1α、M1P1β和RANTES。
可被本发明导向的酶包括，但并不局限于，胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、HSV胸苷激酶、和人胸苷激酶。
应用于本发明的受体和它们相应配体包括，但并不局限于，叶酸受体、肾上腺素受体、生长激素受体、促黄体素受体、雌激素受体、表皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体等。
用于本发明导向方面的激素和它们的受体包括，但并不局限于，生长激素、催乳素、胎盘催乳激素、促黄体素、促卵泡激素(foilicle-stimulating hormone)、绒毛膜促性腺激素、甲状腺刺激激素、肥胖蛋白(leptin)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、血管紧张素I、血管紧张素II、β-内啡肽、β-黑色素细胞刺激激素(β-MSH)、缩胆囊素、内皮素I、高良姜素(galanin)、肠抑胃肽(GIP)、胰高血糖素、胰岛素、糊精、促脂解素、GLP-1(7-37)后叶激素运载蛋白和促生长激素抑制素等。
此外，本发明还将包括置于纳米装置导向组分中的维生素(脂溶性或非脂溶性维生素)，可用于导向具有维生素受体的细胞或摄取维生素。其中特别优选的是脂溶性维生素，如维生素D及其类似物、维生素E、维生素A等或水溶性维生素如维生素C等。
本发明一些实施方案中，将许多肿瘤细胞导向基团附着于树状体。该导向树状体然后被缀合至核心树状体上。因此本发明的纳米装置属于特异性导向肿瘤细胞的装置(即更可能附着于肿瘤细胞而非健康细胞)。此外，树状体多价性允许其附着聚乙二醇(PEG)和聚乙基噁唑啉(PEOX)链以增加在血液循环中的时间和降低缀合体的免疫原性。
在本发明优选的实施方案中，导向基团通过短的(例如，直接耦联)、中等(例如，使用小分子双功能接头如SPDP，由Pierce Chemical公司出售)、或长的(例如，PEG双功能接头，Shearwater Polymers出售)连接缀合至树状体。因为树状体的表面具有大量功能基团，因此多个导向基团可以附着于每一个树状体上。结果在树状体和靶细胞之间存在多个结合事件。在这些实施方案中，经由这种“协同结合”或多价相互作用效应，树状体对于它们的靶细胞具有高度亲和性。
由于空间原因，配体越小就能越多地附着于树状体表面。最近，Wiener报道了附着了叶酸的树状体将特异性地累积在表达高亲和性叶酸受体(hFR)的肿瘤细胞表面和内部(Wiener等，Invest.Radiol.，32：748[1997])。hFR受体在上皮肿瘤(包括乳腺癌)中表达和被上调。缺乏hFR的对照细胞显示没有叶酸衍生化的树状体的明显累积。经由碳二亚胺耦联反应，叶酸可被附着于所有代次的PAMAM树状体上。叶酸由于其较小和简单的缀合步骤，因而是树状体良好的导向候选物。
一种稍大、但仍属于相对较小的配体是表皮生长因子(EGF)，它是具有53个氨基酸残基的单链肽。已经表明，用接头SPDP缀合至EGF的PAMAM树状体，结合到人神经胶质瘤细胞表面并被内吞，累积在溶酶体中(Casale等，Bioconjugate Chem.，7：7[1996])。因为EGF受体在脑肿瘤细胞中的密度比正常细胞高达100倍，EGF成为有用的针对这类肿瘤的导向试剂。因为EGF也在乳腺和结肠癌中过度表达，EGF也可用作这些细胞的导向试剂。类似地，成纤维细胞生长因子受体(EGER)也结合相对较小的多肽(FGF)，并且很多已知在乳腺癌细胞系(尤其FGF1，2和4)中能高水平表达(Penault-Llorca等，Int.J.Cancer 61：170[1995])。
本发明优选的实施方案中，导向部分是抗体或抗体结合抗原片段(例如Fab单位)。例如，糖蛋白p185是被深入研究、于许多肿瘤表面发现的抗原，其专有地表达于癌变细胞(Press等，Oncogene 5：953[1990])。重组人源化抗HER2单克隆抗体(rhuMabHER2)已显示能抑制过表达HER2的乳腺癌细胞的生长，并且正在治疗晚期乳腺癌III期临床试验中对其进行评估(结合传统的化疗)(Pegarn等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，14：106[1995])。Park和Papahadjopoulos已将rhuMabHER2的Fab段附着于单层脂质体，其然后可负载化学治疗剂阿霉素(dox)，并导向于过表达HER2的肿瘤异种移植物中(Park等，Cancer Lett.，118：153[1997]和Kirpotin等，Biochem.，36：66[1997])。这些负载了dox的“免疫脂质体”与非导向的负载dox的脂质体和游离dox相比显示出对肿瘤增大的细胞毒性，并与游离dox相比具有减小的系统毒性。
可以产生抗体以能够针对多种生物学靶标(例如，病原体、肿瘤细胞、正常组织)进行抗原或免疫原(例如，肿瘤、组织或病原体特异性抗原)导向。这些抗体包括，但并不局限于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab段、和Fab表达文库。
在一些优选的实施方案中，抗体识别肿瘤特异性表位(例如，TAG-72(Kjeldsen等，Cancer Res.48：2214-2220[1988]；美国专利5,892,020；5,892,019；和5,512,443)；人癌抗原(美国专利5,693,763；5,545,530；和5,808,005)；来源于骨癌细胞的TP1和TP3抗原(美国专利5,855,866)；来源于腺癌细胞的Thomsen-Friedenreich(TF)抗原(美国专利5,110,911)；来源于人前列腺癌的“KC-4抗原”(美国专利4,708,930和4,743,543)；人结肠直肠癌抗原(美国专利4,921,789)；来源于囊腺癌的CA125抗原(美国专利4,921,790)；来源于人乳腺癌的DF3抗原(美国专利4,963,484和5,053,489)；人乳腺肿瘤抗原(美国专利4,939,240)；人黑色素瘤p97抗原(美国专利4,918,164)；癌或血清类粘蛋白相关抗原(CORA)(美国专利4,914,021)；与人鳞状细胞肺癌但不与人小细胞肺癌相互作用的人肺癌抗原(美国专利4,892,935)；人乳腺癌糖蛋白上的T和Tn半抗原(Springer等，Carbohydr.Res.178：271-292[1988])，称为MSA的乳腺癌糖蛋白(Tjandra等，Br.J.Surg.75：811-817[1988])；MFGM乳腺癌抗原(Ishida等，Tumor Biol.10：12-22[1989])；DU-PAN-2胰腺癌抗原(Lan等，Cancer Res.45：305-310[1985])；CA125卵巢癌抗原(Hanisch等，Carbohydr.Res.178：29-47[1988])；YH206肺癌抗原(Hinoda等，(1988)Cancer J.42：653-658[1988])等。前述的每个文献均特别引用，作为参考。
在其他优选的实施方案中，抗体识别特异性病原体(例如，嗜肺性军团杆菌(Legionella peomophilia)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、流感嗜血菌(Hemophilus influenzae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、白喉棒状杆菌(Cornebacteriumdiphtheria)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒等)
可用本领域已知的多种方法产生多克隆抗体。为了产生抗体，可通过注射与目的表位相关的肽而免疫许多宿主动物，包括，但并不局限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在优选的实施方案中，将肽与免疫原载体(例如，白喉类毒素、牛血清白蛋白(BSA))，或匙孔血蓝蛋白(KLH))缀合。使用多种佐剂来增加免疫应管，佐剂取决于宿主种类，其包括但并不局限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物质胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳状液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、和潜在的人用佐剂如BCG(BacilleCalmette-Guerin)和小型棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
对于单克隆抗体的制备，可以使用任何能通过连续细胞系培养产生抗体分子的方法(例如参见，Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY)。其包括，但并不局限于，由Khler和Milstein首创的杂交瘤技术(Khler和Milstein，Nature 256：495-497[1975])、以及三瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(例如参见，Kozbor等，Imunol.Today 4：72[1983])、以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，在Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96[1985])。
在本发明另外一个实施方案中，单克隆抗体可通过使用最近的技术在无菌动物中产生(例如参见，PCT/US90/02545)。按照该发明，可以使用人抗体和通过使用人杂交瘤(Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030[1983])或通过用EBV病毒体外转化人B细胞(Cole等，在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96[1985])获得人抗体。
按照本发明，可采用描述用于产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778；在此引用作为参考)来产生特异性单链抗体。本发明另外的实施方案使用被描述用于构建Fab表达文库的技术(Huse等，Science 246：1275-1281[1989])来实现具有目的特异性的单克隆抗体Fab段快速和简单的鉴定。
可以使用已知的技术产生含有抗体分子独特型(idiotype)(抗原结合区)的抗体片段。例如，这些片段包括但并不局限于：通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片段；通过去除F(ab’)2片段的二硫桥产生的Fab’片段，以及通过用木瓜蛋白酶和还原剂剂处理抗体分子而产生的Fab段。
在抗体生产中，目的抗体的筛选可以通过本领域已知的技术来实现(例如，放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、Western印迹、沉淀反应、凝集试验(例如，凝胶凝集试验、血凝集试验等)、补体固定试验、免疫荧光测定法、蛋白A测定、和免疫电泳分析等)。
本发明的树状体系统比脂质体具有许多优越性，如更大的稳定性、更易控制大小和多分散性、和通常较低的毒性和免疫原性(例如参见，Duncan等，Polymer Preprints 39：180[1998])。因此，在本发明的一些实施方案中，抗HER2抗体片段，以及其他导向抗体被缀合至树状体，作为本发明纳米装置的导向试剂。
对于乳腺癌，细胞表面可用叶酸、EGF、FGF、和针对肿瘤相关抗原MUC1、cMet受体和CD56(NCAM)的抗体(或抗体片段)导向。一旦内在化至细胞内，纳米装置就结合至(经由缀合的抗体)HER2、MUC1或突变的p53。
双功能接头SPDP和SMCC和长的Mal-PEG-OSu接头对于抗体-树状体缀合十分有用。此外，许多肿瘤细胞含有与寡糖结合的表面凝集素，具有主要由寡糖的末端碳水化合物残基产生的特异性识别(Sharon和Lis，Science 246：227[1989])。将合适的单糖附着于非糖基化蛋白质如BSA形成缀合体，该缀合体结合肿瘤凝集素的牢固程度远大于自由单糖(Monsigny等，Biochemie 70：1633[1988])。
甘露糖基化PAMAM树状体结合甘露糖苷结合凝集素可高达400个，远大于单体的甘露糖苷(Page和Roy，Bioconjugate Chem.，8：714[1997])。唾液酸化(sialylated)树状体和其他树状聚合物能在体外和体内结合并抑制许多唾液酸结合(sialate-binding)病毒。通过将多个单糖残基(例如，对于半乳糖结合细胞的α-半乳糖苷)缀合至树状体，产生针对相关种类肿瘤细胞具有高亲和性的多价缀合体。通过末端胺和商品化的α-半乳糖苷-异硫氰酸苯酯的反应可以很容易地实现附着反应。较小的碳水化合物能在树状体表面产生较高的浓度。
噬菌体展示技术是鉴定和筛选合适肽导向基团的非常灵活的方法(例如参见，Cortese等，Curr.Opin.Biotechol.，6：73[1995])，该方法可以通过商业化试剂盒方便的实现。噬菌体展示方法产生附着于噬菌体表面的大量和多样性的肽组合文库，然后针对固定化表面受体进行筛选用于紧密结合。紧密结合后，分离和测序病毒构建体来鉴定该肽的序列。使用最好的多肽作为下一轮肽库的起始点重复该循环。最后，鉴定到适合的高亲和性肽，随后筛选其生物相容性和靶标特异性。通过这种方法，有可能产生能够缀合至树状体的肽，形成对靶细胞受体(例如，肿瘤细胞受体)或其他目的靶标具有高特异性和亲和性的多价缀合体。
与上述导向方法相关的是“预导向”方法(例如参见，Goodwin和Meares，Cancer(suppl.)80：2675[1997])。该策略的例子涉及使用肿瘤特异性单克隆抗体和链霉亲和素缀合体对患者进行初始治疗。剩余的溶解性缀合体用适当的生物素化清除试剂从血流中去除。当剩下的都是肿瘤局限性的缀合体时，引入放射标记的、生物素化试剂，其随后由于强烈和特异性的生物素-链霉亲和素相互作用定位于肿瘤位点。因此，接近肿瘤细胞的放射剂量达到最大，并且在能伤害健康细胞的身体其他部位的放射剂量最小。
已表明如果结合至聚苯乙烯孔上的链霉亲和素分子首先用生物素化的树状体处理，然后引入放射标记的链霉亲和素，大约每一个聚苯乙烯结合的链霉亲和素结合多达4个标记的链霉亲和素分子(Wilbur等，Bioconjugate Chem.，9：813[1998])。因此，生物素化树状体可用于本发明的方法，作为体内放射标记的多价受体，由此导致每个结合抗体缀合体的放射剂量得到扩增。在本发明优选的实施方案中，一种或多种位于成簇树状体上的多价生物素化组分形成放射标记的或硼化的(Barth等，Cancer Investigation 14：534[1996])亲和素或链霉亲和素的多价靶标，再次导致对肿瘤细胞放射剂量的扩增。
通过例如部分生物素化具有多价半乳糖或甘露糖表面的树状体，树状体和成簇树状体还可作为清除试剂。那么缀合体-清除试剂复合物对于相应的肝细胞受体将具有非常强的亲和性。
本发明的其他实施方案中，在导向过程中使用了增强的通透性和滞留(EPR)的方法。增强的通透性和滞留(EPR)效应是导向肿瘤的更加“被动”的方法(参见，Duncan和Sat，Ann.Oncol.，9：39[1998])。EPR效应是肿瘤微环境中大分子和小颗粒的选择性浓度，由肿瘤的超通透性脉管系统和较差的淋巴管引流(drainage)引起。本发明的树状体组合物提供了该应用的理想的聚合物，是由于它们是相对刚性的。较窄的多分散性、可控制的大小和表面化学性质，并且它们具有内部“载货”空间能携带并然后释放抗肿瘤药物。事实上，已经表明PAMAM树状体-铂酸盐，在固体肿瘤中累积(Pt水平比使用顺铂时高约50倍)，并在顺铂不起作用的固体肿瘤模型中具有体内活性(Malik等，Proc.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.，24：107[1997]和Duncan等，Polymer Preprints 39：180[1998])。
本发明的导向部分可识别许多生物学靶标上的其他表位(例如，病原体上)。在一些实施方案中，结合分子识别组分来识别、导向或检测许多病原生物包括，但并不局限于，唾液酸来导向HIV(Wies等，Nature333：426[1988])、流感(White等，Cell 56：725[1989])、衣原体(Chlamydia)(Infect.Imm.57：2378[1989])、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、猪链球菌(streptococcus suis)、沙门氏菌(Salmonella)、腮腺炎、新城疫、和多种病毒，包括呼肠孤病毒、仙台病毒、和粘病毒；9-OAC唾液酸来导向冠状病毒、脑脊髓炎病毒、和轮状病毒；非唾液酸糖蛋白来检测巨细胞病毒(Virology176：337[1990])和麻疹病毒(Virology 172：386[1989])；CD4(Khatzman等，Nature 312：763[1985])、血管活性的肠内肽(Sacerdote等，J.of Neuroscience Research 18：102[1987])、和肽T(Ruff等，FEBS Letters 211：17[1987])来导向HIV；表皮生长因子来导向牛痘(Epstein等，Nature 318：663[1985])；乙酰胆碱受体来导向狂犬病(Lentz等，Science 215：182[1982])；Cd3补体受体来导向Epstein-Barr病毒(Carel等，J.Biol.Chem.265：12293[1990])；β-肾上腺素受体来导向呼肠孤病毒(Co等，Proc.Natl.Acad.Sci.82：1494[1985])；ICAM-1(Marlin等，Nature 344：70[1990])、N-CAM和髓磷脂相联的糖蛋白MAb(Shephey等，Proc.Natl.Acad.Sci.85：7743[1988])来导向鼻病毒；脊髓灰质炎病毒受体来导向脊髓灰质炎病素(Mendelsohn等，Cell 56：855[1989])；成纤维细胞生长因子来导向疱疹病毒(Kaner等，Science 248：1410[1990])；寡甘露糖来导向大肠杆菌(Escherichiacoli)；神经节苷脂GM1来导向脑膜炎奈瑟氏菌；和抗体来检测许多病原体(例如，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、创伤弧菌(V.vulnificus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、霍乱弧菌(V.cholerae)、和解藻酸弧菌(V.alginolyticus)等)。
在本发明的一些实施方案中，导向部分优选核酸(例如RNA或DNA)。在一些实施方案中，将核酸导向部分设计成通过碱基配对能与特定核酸(例如，染色体DNA、mRNA、或核糖体RNA)杂交。在其他一些实施方案中，核酸结合配体或生物学靶标。已鉴定出结合下列蛋白质的核酸：逆转录酶、HIV的Rev和Tat蛋白质(Tuerk等，Gene 137(1)：33-9[1993])；人神经生长因子(Binkley等，Nuc.Acids Res.23(16)：3198-205[1995])；以及血管上皮生长因子(Jellinek等，Biochem.83(34)：10450-6[1994])。结合配体的核酸优选地通过SELEX方法鉴定(例如参见，美国专利5,475,096；5,270,163；和5,475,096；和PCT公布WO97/38134，WO98/33941和WO99/07724，以上所有内容在此引用作为参考)，尽管许多方法在本领域已经众所周知。
VII.合成和缀合
本节描述了合成和形成纳米装置单独组分(即单独的含有一种或多种上述组分的树状体)和将这类组分缀合至纳米装置(例如，将一种或多种该树状体缀合至核心树状体)。
本发明优选的实施方案中，按照典型的发散(从起始核心构建大分子)合成来进行PAMAM树状体的制备。它涉及两步的生长次序，在丙烯酸甲酯(MA)双键上迈克尔(Michael)加成氨基基团，接着产生的末端甲酯基(-(CO2CH2)基团)与乙二胺(EDA)酰胺化。当用氨作为引发剂核心试剂时，该合成可用附图7所示的反应来表示。
在该方法的第一步，氨在惰性氮气气氛下与MA(摩尔比1∶4.25)在47℃下反应48小时。产生的化合物被称为0代，星状分枝的PAMAM三酯。下一步涉及该三酯与过量的EDA反应产生星状分枝的PAMAM三胺(G＝O)。该反应需要在惰性环境(氮气)下在甲醇中进行，并需要0℃48小时来完成反应。重复迈克尔加成和酰胺化次序产生1代。
该三胺的制备完成了PAMAM树状体发散合成的第一个完整循环。重复该反应次序合成更高代次(G＝1-5)树状体(即分别为酯-和胺-末端的分子)。例如，该次序第二次重复产生1代，分别具有六酯和六胺表面。对随后的1至9代以同样方式进行同样反应，逐步建立如上所述的具有精确分子量和许多末端基团的核心-壳结构的分枝细胞层。羧化物-表面化的树状体可通过酯-末端化的PAMAM树状体的水解，或琥珀酸酐与胺-表面化的树状体(例如，全部代次的PAMAM、POPAM或POPAM-PAMAM杂合树状体)的反应来产生。
基于引发聚合过程的核心结构可以合成各种树状体。这些核心结构决定树状体分子的几个重要特性如整体形状、密度和表面官能度(Tomalia等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，29：5305[1990])。从氨衍生出的球状树状体具有三键引发剂核心，而EDA是四键引发剂核心。最近，已有基于不同长度的线性聚(哌嗪)核心的棒状树状体的报道，核心越长，棒长度越长(Yin等，J.Am.Chem.Soc.，120：2678[1998])。
可以使用任何适当的分析技术鉴定树状体的大小和均一性。这些包括，但并不局限于，原子力显微镜(AFM)、电子喷射离子化质谱、MALDI-TOF质谱、13C核磁共振谱、高效液相色谱(HPLC)、大小排阻色谱(SEC)(装备有多角度激光光散射，双UV和折射率检测器)、毛细管电泳和凝胶电泳。这些分析方法保证树状体群体的均一性，并对于最终用于体内应用的树状体生产的的质量控制至关重要。最重要的是，大量已开展的利用树状体的工作表明当静脉给药时没有显示出毒性(Roberts等，J.Biomed.Mater.Res.，30：53[1996]和Bourne等，J.Magnetic Resonance Imaging，6：305[1996])。
为了产生具有多功能组分(用于活性感应、导向、成像和治疗递送)的单一的树状体装置，将多种PAMAM树状体组分(每种具有单独的区分功能)共价结合形成单一装置。这涉及针对每个需要的功能合成分离的缀合体或纳米合成物(例如，一种树状体缀合体用于感应、一种用于导向和另外一种用于治疗载体)。然后将这些不同的树状体自我组装，并共价连接以产生单一治疗装置。在特定实施方案中，一种树状体作为核心，其他树状体共价结合在它周围(即“成簇树状体”)。在优选的实施方案中，核心树状体是POPAM树状体，而外层树状体是PAMAM树状体。在另一个实施方案中，树状体可能互相复合而不需核心树状体(例如，四个树状体互相共价连接成线性的链)。
在本发明一个优选的实施方案中，成簇树状体的形成涉及使用酯氨解技术在核心和外层树状体之间形成酰胺键。该酯氨解技术涉及将多种聚(酰氨基胺)PAMAM树状体核心试剂与过量的酯末端化的PAMAM树状体壳试剂在甲醇中40℃下进行反应(例如参见，Uppuluri等，PMSE80：55[1999])。在另外的实施方案中，采用水作为反应介质。该方法涉及胺末端化核心试剂与过量的羧酸酯壳试剂的自我组装，随后加入耦联试剂(碳酰亚胺)，在核心和壳组分之间产生酰胺键。这些反应在室温下进行。当在生物分子如抗体存在下进行反应时这类实施方案是优选的。
这些分子的水相合成的第一步涉及壳试剂分子围绕核心树状体分子的自我组装，导致壳分子在核心周围的高效(即最大程度)包装。如图5所示，自我组装的簇代表了用于使共价结合的核心壳成簇化树状体的前体。在下一步中，使用耦联试剂(例如EDC，碳二亚胺试剂)，如图6所示，将核心和壳分子共价连接。反应过程由大小排阻色谱和羧酸酯官能度在红外区的降低以及1H/13C NMR和凝胶电泳来监测。这些反应如在室温进行通常需要1个小时来完成。
在本发明的一些实施方案中，通过原子力显微镜(AFM)和大小排阻色谱SEC测量这些高分子量产物的大小和形状，并与单独树状体比较。这些技术证明核心-壳树状体确实已经形成。如果需要，通过凝胶电泳可获得另外的证据，当反应完成后高分子量产物在凝胶电泳中是非常明显的。成簇树状体的绝对分子量可通过MALDI-TOF质谱或通过装备由多角度激光光散射检测器(MALLS)的SEC来确定。
通过这种方法形成的成簇树状体分子通过SEC显示具有较窄的多分散性(类似于那些大分子树状体的多分散性)。将PAMAM树状体的第6代转化为第9代需要3-4周，但合成具有类似大小、可接受的分散性和形状的成簇树状体只需大约1天(包含纯化步骤)。
对于多功能成簇树状体，任何关于外层树状体组分上的功能基团的交联反应问题都可以通过在参与反应的侧链上使用标准保护基团来克服。另一个解决方法是使用双功能接头策略，例如，首先，将核心氨基表面化的树状体表面与2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)反应产生硫醇表面，然后将产物与壳树状体上的马来酰亚胺接头基团反应。
如上所述，在本发明的一些实施方案中核心-壳结构用于把树状聚合物组分组装至单一分子复合物(例如参见图10)。这就能够将纳米装置的每个组分放在不同的聚合物上，并且把它们组装成单一的、超分子组装物。该技术的独特特征在于核心-壳构型决定和限制组装物；核心越大且壳分子越小，可与核心结合的壳树状体的数目就越多。例如，簇的核心可以是第7代、胺表面化的PAMAM树状体；具有大约110kDa的分子量，直径7nm和512个表面伯胺(Tomalia等，Angew.Chem.Int.Ed.，29：138[1990])。壳可以包含第5代羧基表面化的PAMAM树状体，具有大约27kDa的分子量，直径5nm和128个表面羧基基团。这将导致超分子复合物的自我组装(如果在过量的E5下进行)，其中平均12个E5分子包围一个E7核心。图10显示空间位阻限制了结合至核心的壳聚合物的数目。
在试图用这个方法使用共价连接至PAMAM树状体的多功能基团组装基于树状体的纳米装置时可能会出现问题。例如，在一些实施方案中，这些组分的自我组装需要在核心和表面聚合物中有不同的电荷。这将会在壳聚合物上造成过剩电荷，从而可能抑制该装置的功能，特别是涉及导向和内部化至细胞的功能。同样至关重要的是，在一些实施方案中，聚合物自我组装后，它们是共价连接的。此步骤涉及的化学性质会影响纳米装置的功能性亚基，并在一些情况下会破坏它们。因此，必须采用另外的技术来组装超分子复合物
在本发明一些实施方案中，通过使用接头组装多功能成簇树状体的单独树状体组分。例如，在一些实施方案中，通过采用共价或非共价的相互作用的接头基团将壳树状体附着在核心树状体上。这类连接的一个说明实施例通过使用核酸接头(其提供许多优点)而得到证明。
由于寡核苷酸很容易被缀合至其他物质、具有与互补碱基特异性的另外的寡核苷酸杂交的能力、序列的可计划性、形成的双螺旋结构的牢固性，寡核苷酸因此是将分子组装至所需结构排列的强有力工具。按此想法，在进行本发明时使用树状体和互补寡核苷酸产生了超分子核心-壳结构。与使用以前的组装技术产生的产物相比这些结构具有许多优点。例如，它们在低温下组装不需要苛刻的化学试剂，它们具有基于不同寡核苷酸互补性特异性耦联不同亚基的能力，并且它们具有在寡核苷酸耦联物中设计核酸酶切位点或其他可裂解位点能力，使得复合物具有“可降解性”，并使亚基通过肾而排泄出体外(例如，可以将它们设计成一旦到达靶位点就崩解的形式，这样小的片段就可通过肾排出体外)。图11为使用核酸接头组装的树状体复合物的简图。实施例5中提供了制备该复合物的方法。
本发明并不受用于接头基团的核酸的性质的限制。在一些优选的实施方案中，附着于树状体的核酸不含有链内二级结构。但是，在一些实施方案中，二级结构可用来提供目的功能或性质(例如，稳定性、裂解识别位点等)。可选择核酸接头的长度用来在核心树状体和壳树状体之间提供所需的距离。在本发明的一些实施方案中，修饰核酸来增强其稳定性(例如，在血流中的稳定性)和/或协助其进入细胞内。产生这种修饰的方法本领域众所周知。在一些实施方案中，标记核酸分子以进行这些组装物的检测或定位。
一旦核酸接头附着于树状体，就可以组装和分析树状体复合物(例如，来确保结构具有合适的构象)。因为这些物质尺寸较小，鉴定这些组装的复合物优选的方法是原子力显微镜。使用原子力显微镜清楚地证明树状体超分子组装物的存在，其为三种和四种组分有规律的组合(即，包含一个核心和多个壳树状体)。分析单独的簇证明两个组分之间的距离是21nm；几乎与从寡核苷酸杂合体长度预测的理论距离完全一致。然后对分子群体进行分析，发现组分之间都具有大约20nm的距离。这就证明超分子结构的均一性。如果这些超分子组装物能以一致的方式连接组分，它们几乎可用于从疫苗组分到药物到成像试剂的任何类型的物质的组合递送。
VIII.纳米装置的抗肿瘤效率和毒性的评估
使用本发明的纳米装置可以评估多种治疗性试剂对肿瘤细胞系和原代细胞培养物的抗肿瘤效应。例如，在优选的实施方案中，使用已建立的肿瘤细胞系模型或原代培养细胞在体外开展试验。优选地使用新鲜肿瘤细胞(相对于培养的细胞系)来确保毒性测试和效率，因为它能够进行更加相关的鉴定而没有由组织培养产生的人工产物(例如，肿瘤细胞选择等)。
A.定量体外诱导人肿瘤细胞的凋亡
在本发明一个示范例实施方案中，本发明的纳米装置用来在体外分析人肿瘤细胞的凋亡。细胞内凋亡的测试确定治疗试剂的效率。凋亡的多个特征能够并且必须被测量。这些特征包含上面所述的特征，以及包括，但并不局限于，磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞质膜内部到外表面的转位的测量、DNA断裂的测量、凋亡相关蛋白质的检测、和崩溃酶-3活性的测量等。
B.体外毒性
在本发明的一些实施方案中，为了获得特定纳米装置平台或该系统组分的安全性的全面观点，进行了毒性测试。可以从多种来源获得毒理学信息，其包括，但并不局限于，历史数据库、体外测试、和体内动物研究。
由于对替代动物实验方法不断增加的需求和对潜在伦理、商业和科学价值理解的增加，体外毒理学方法近几年得到普及。体外毒性测试系统具有多种优点，包括效率提高、费用减少、和实验间变异性减少等。这些系统也减少了动物的使用、消除了容易混淆的系统效应(如免疫)、和控制环境条件等。
尽管本发明可能使用任何体外测试系统，但用于体外试验的最常见方法是使用培养的细胞模型。这些系统包含新鲜分离的细胞、原代细胞、或转化的细胞培养物。由于可快速筛选多个培养物、有利于在细胞、亚细胞、或分子水平鉴定和分析毒性效应，细胞培养作为首要的体外毒理学研究方法具有很多优点。通过测量膜完整性、代谢活性、和亚细胞微扰，体外细胞培养方法通常能显示基本的细胞毒性。通常使用的膜完整性的指示包括细胞存活力(细胞计数)、克隆扩展测试、台盼蓝排除、细胞内酶释放(例如，乳酸脱氢酶)、膜对小离子(K1、Ca2+)通透性、和细胞内小分子(例如，51Cr，琥珀酸盐)的累积等。亚细胞微扰包括通过例如MTT测试来监测线粒体酶活性水平、确定腺嘌呤三磷酸(ATP)水平、中性红摄取入溶酶体、和总蛋白合成的定量等。代谢活性指示包括谷光甘肽含量、脂质过氧化作用、和乳酸/丙酮酸比率等。
C.MTT试验
MTT试验是获得细胞存活力测量的快速、准确、和可靠的方法学。MTT试验最初由Mosmann(Mosmann，J.Immuno1.Meth.，65：55[1983])建立。它是一个简单的显色试验，许多实验室曾用它来获得毒性结果(例如参见，Kuhlmann等，Arch.Toxical.，72：536[1998])。简言之，线粒体产生ATP来给细胞提供足够的能量。为了达到这个目的，线粒体代谢丙酮酸产生乙酰辅酶A。在线粒体内部，乙酰辅酶A与三羧酸循环中的多种酶作用，导致随后ATP的产生。MTT试验中尤其有用的酶是琥珀酸脱氢酶。MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2-二苯基溴化四唑)是一个黄色底物，其被琥珀酸脱氢酶裂解后形成一个紫色甲产物。这种色素改变确定了线粒体功能的变化。非存活细胞无法产生甲，因此，产生甲的量直接与存活细胞的量相关。用540nm处的吸收来测量甲产物的总量。
为了推断至活动物状况，体外测试的结果可与体内毒性测试的结果相比较。通常，评估单剂量物质的急性毒性。监测动物14天观察其任何的毒性征兆(体温增加、呼吸困难、死亡等)。传统上讲，急性毒性的标准是半数致死剂量(LD50)，其为使半数接受处理的治疗动物死亡的推测剂量。该剂量的确定是通过在可控制条件下将测试动物暴露于一个几何系列剂量下完成。其他测试包括亚急性毒性测试，其测量动物对重复剂量的纳米装置的反应，持续不超过14天。亚慢性毒性测试涉及对重复剂量的测试持续90天。慢性毒性测试类似于亚慢性毒性测试，但可能持续超过90天。同样可以开展体内测试来确定对特定组织的毒性。例如，在本发明的一些实施方案中，确定(例如，通过检测肿瘤组织大小和/或生长的变化)了肿瘤的毒性(即本发明组合物对肿瘤组织存活的影响)。
IX.基因治疗载体
在本发明特定实施方案中，纳米装置组合物包含用于体外、离体、体内递送和表达至靶细胞或组织的转基因。在这些实施方案中，树状体复合物包含表达载体构建体，其含有例如编码目的基因的异源DNA和多种协助在靶细胞内产生特定目的蛋白质的调节因子，而非含有一个确切的蛋白质。
在一些实施方案中，基因属于用于例如治疗肿瘤、替换缺陷基因的治疗性基因，或为用于选择或监测目的的标记或报告基因。在基因治疗载体部分中，基因可以是异源DNA片段。该异源DNA可从多种来源中获得(即多基因构建体或融合蛋白)。此外，该异源DNA可包含衍生于一种来源的调节序列和衍生于另一种来源的基因序列。
组织特异性启动子可用于影响在特异性组织或细胞中的转录。以降低对非导向组织的潜在毒性或不需要的影响。例如，象PSA、前列腺碱性蛋白(probasin)、前列腺酸磷酸酶或前列腺特异性腺血管舒缓素(hK2)这样的启动子可用于在前列腺中导向基因表达。类似地，启动子可用于在其他组织中的导向基因表达(例如，胰岛素、弹性蛋白淀粉酶、pdr-1、pdx-1和葡糖激酶启动子导向至胰腺；白蛋白PEPCK、HBV增强子、甲胎蛋白载脂蛋白C、α-1抗胰蛋白酶、卵黄原蛋白、NF-AB和甲状腺素运载蛋白启动子导向至肝；肌球蛋白H链、肌酸激酶、肌营养不良蛋白、钙蛋白酶p94、骨骼α-肌动蛋白、快速肌钙蛋白1启动子导向至骨骼肌；角蛋白启动子导向皮肤；sm22α；SM-α-肌动蛋白启动子导向平滑肌；CFTR；人细胞角蛋白18(K18)；肺表面活性蛋白A，B和Q CC-10；P1启动子导向肺组织；内皮素1；E-选择素；vonWillebrand因子；KDR/flk-1导向内皮；酪氨酸酶导向黑色素细胞)。
核酸可以是cDNA或基因组DNA。核酸可编码任何合适的治疗蛋白质。优选地，该核酸编码肿瘤抑制因子、细胞因子、受体、凋亡诱导剂、或分化试剂。该核酸可以是反义核酸。在这类实施方案中，反义核酸可结合至本发明纳米装置内(表达载体部分的外面)。
在优选的实施方案中，核酸编码肿瘤抑制因子、细胞因子、受体、或凋亡诱导剂。合适的肿瘤抑制因子包含BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p211、p53、p73、或Rb。合适的细胞因子包含GMCSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β干扰素、γ干扰素、或TNF。合适的受体包含CFTR、EGFR、雌激素受体、IL-2受体、或VEGFR。合适的凋亡诱导剂包含AdE1B、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakiri、或ICE-CED3蛋白酶。
X.组合治疗方法
肿瘤细胞对DNA损伤试剂的抗性是临床肿瘤学中的主要问题。本发明的纳米装置通过高效地施用组合治疗方法提供了改善这个问题的办法。但是，必须指出的是传统的组合治疗也可与本发明的纳米装置联合使用。例如，在本发明的一些实施方案中，纳米装置可在传统治疗方法之前、之后或与之组合使用。
为了杀灭细胞、抑制细胞生长、或转移、或血管生成、或逆转或减少恶性表型的肿瘤细胞而在组合治疗中使用本发明的方法和组合物，将“靶”细胞与此处描述的纳米装置组合物和至少一种其他试剂接触。这些组合物以有效杀灭和抑制细胞增殖的组合的总量提供。该过程可能涉及将细胞与免疫治疗试剂或因子同时接触。这可通过同时将细胞与单一组合物或包含全部试剂的药物制剂接触，或通过同时将细胞与两种不同的组合物或制剂接触来进行，其中一种组合物包含例如表达构建体，另一种则包含治疗试剂。
另外，纳米装置治疗可能先于或后于其他试剂的治疗，间隔从几分钟到几周。在其他试剂和免疫治疗分别应用于细胞的实施方案中，一般必须确保在每次给药之间维持相当长的一段时间不失效，这样试剂和纳米装置就仍能对细胞发挥优越的组合效应。在这种情况下，可以预计细胞将在大约12-24小时之内、更加优选地在大约6-12小时之内与每种模式互相接触，只有大约12小时的延迟时间是最优选的。但是在一些情况下，有时需要延长时段来达到治疗的显著性，在每次分别给药之间间隔几天(2到7)至几周(1到8)。
在一些实施方案中，使用了一种以上的本发明免疫治疗组合物或其他试剂的的给药方法。可采用多种组合，其中纳米装置是“A”和其他试剂是“B”，示例如下：
A/B/A，B/A/B，B/B/A，A/A/B，B/A/A，A/B/B，B/B/B/A，B/B/A/B，
A/A/B/B，A/B/A/B，A/B/B/A，B/B/A/A，B/A/B/A，B/A/A/B，B/B/B/A，A/A/A/B，B/A/A/A，A/B/A/A，A/A/B/A，A/B/B/B，B/A/B/B，B/B/A/B还包括其他组合。再次重申，为达到细胞杀灭作用，以有效杀灭或失能细胞的组合的量将两种试剂递送至细胞。
在与本发明纳米装置的组合治疗中使用的其他因子包括，但并不局限于，引起DNA损伤的因子如γ射线、X射线，和/或引起放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的因子。还包括其他形式的DNA损伤因子如微波和UV辐射。X射线的剂量范围从每天50-500伦琴(持续一段时间(3到4周)至2000-6000伦琴(单剂量)。放射性同位素的剂量范围变化较大，并取决于同位素的半衰期、放射发出辐射的强度和类型、以及治疗细胞的摄取。技术熟练人员可参考“Remington’sPharmaceutical Sciences”15th Edition，Chapter 33，具体在624-652页。依据治疗对象的状况，有必要对剂量做一些改变。在任何情况下，负责给药的人将确定个体受试者的合适剂量。而且，对于人的给药，制剂必须达到FDA Office of Biologics Standards所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准等。
在本发明优选的实施方案中，将纳米装置局部给药于癌症患者来达到递送试剂的最大治疗效果。类似地，因将化学或放射治疗定向于受试者身体的特定的、受疾病侵袭的部位。另外，在某些情形下，例如当发生广泛转移时，采用免疫治疗组合物和/或试剂的系统递送可能是比较适当的。
除了将纳米装置与化学和放射治疗组合之外，也可以使用传统的基因治疗。例如，伴随纳米装置的治疗的同时针对p53或p16突变的治疗提供了改善的抗癌治疗。本发明包括与其他肿瘤相关基因的共治疗(co-treatment)，所述基因包括，但并不局限于，p21、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、BCRA2、p16、FHIT、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC、ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl、和abl。
针对特定受试者采用适于特定构建体的基因递送的合适的方法进行体内和离体治疗。例如，对于病毒载体，通常递送1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011或1×1012个感染性颗粒至患者。通过比较相对摄取效率可以推断出用于脂质体或其他非病毒类型所需要的类似数字。
本发明一个吸引人的特征是治疗组合物，其通过医疗装置可以被递送至患者的局部位置。适用于本发明的医疗装置包含已知的用于治疗试剂局部化递送的装置。这些装置包括，但并不局限于，导管，如注射导管、气囊式导管、双气囊式导管、微孔气囊式导管、通道气囊式导管、输注导管、灌注导管等，例如这些装置被治疗试剂包被或通过这些装置给药；针注射装置如皮下注射针和针注射导管；无针注射装置如喷射注射器；包被的支架、分叉支架、脉管移植物、支架移植物等；和包被的血管闭合装置如线圈。
示范装置由以下专利描述，美国专利5,935,114；5,908,413；5,792,105；5,693,014；5,674,192；5,876,445；5,913,894；5,868,719；5,851,228；5,843,089；5,800,519；5,800,508；5,800,391；5,354,308；5,755,722；5,733,303；5,866,561；5,857,998；5,843,003；和5,933,145；以上专利全部内容在此引用作为参考。商业化并在本发明中使用的示范支架包括RADIUS(ScimedLife Systems，Inc.)、SYMPHONY(Boston Scient ific Corporation)、Wallstent(Schneider Inc.)、PRECEDENT II(Boston ScientificCorporation)、和NIR(Medinol Inc.)。通过已知的技术将这些装置递送至和/或植入在身体内的靶部位。
XI.光促治疗
在一些实施方案中，本发明的治疗复合物含有光促化合物和给予患者的导向试剂。因此在一些实施方案中，给导向试剂一段时间以结合“靶”细胞(例如，大约1分钟至24小时)，形成靶细胞-靶试剂复合物。然后在一些实施方案中，用光照射(例如，使用红色激光、白炽灯、X射线、或过滤的日光)含有导向试剂和光促化合物的治疗复合物。在一些实施方案中，光瞄准颈静脉或其他浅表层血管或淋巴管。在一些实施方案中，单线态氧和自由基从光促化合物扩散至靶细胞(例如，肿瘤细胞或病原体)使其毁灭。
XII.药物制剂
在本发明的一些实施方案中，将预临床应用的纳米装置以适合于目的应用的形式制备成药剂组合物的一部分。通常，这必须确保制备的组合物确实没有热原以及其他可能对人或动物有害的杂质。但是，在本发明的一些实施方案中，直链树状体制剂可通过此处描述的一种或多种途径给药。
在优选的实施方案中，将纳米装置与适当的盐和缓冲液结合使用，使递送组合物稳定，以有利于靶细胞摄取。当将纳米装置引入到患者内时也使用缓冲液。水样组合物含有对细胞有效量的纳米装置，其分散在药物可接受的载体或水样介质中。这类组合物同样被称作接种物(inocula)。短语“药物或药理可接受的”指当将分子实体和组合物给予动物和人时，其不产生不利的、过敏性、或其他不必要的反应。此处所用的药物可接受的载体包含任何和所有溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌剂、等渗或吸收延迟试剂(absorption delay agents)等。除了任何与本发明载体或细胞不相容的任何常规介质或试剂外，都可在治疗组合物中应用。补充性活性成分可掺入组合物。
在本发明的一些实施方案中，活性组合物包含典型的药物制剂。可经过任何常规途径进行本发明这些组合物的给药，只要经过该途径能到达靶组织即可。这包含口、鼻、颊、直肠、阴道或局部途径。另外，可经过常位、皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉注射给药。
活性纳米装置可通过肠胃外或腹膜内或肿瘤内给药。在水(适当混合有表面活性剂如羟丙基纤维素)中制备自由碱或药物可接受的盐形式的活性化合物溶液。分散剂可以在甘油、液体聚乙烯乙二醇、二者的混合物和油中制备。在普通的贮存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物的生长。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂和用于临时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，其包含，例如水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙烯甘油、和液体聚乙烯乙二醇等)、其适当的混合物和植物油。例如通过使用包被物如卵磷脂、通过在分散过程中维持所需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。可通过多种抗细菌或抗真菌试剂如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物生长。在许多情况下，优选的还包括等渗试剂，例如，蔗糖或氯化钠。可以通过在试剂组合物中使用吸收延迟剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现注射组合物的延迟吸收。
将所需量的活性化合物掺入到含有上述所需的其他多种成分的适当溶剂中，随后过滤除菌来配制无菌注射液。通常，通过将多种无菌的活性成分掺入到含有基本分散介质和所需的上述其他成分的无菌载体中来配制分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空抽干和冻干技术，该技术从预先无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何额外的所需成分的粉末。
对于制剂，树状体组合物以剂量制剂的方式和治疗有效的量给药。很容易通过多种剂量形式(如注射液、药物释放胶囊等)进行制剂给药。例如对于以水溶液通过肠胃外给药，如果需要的话，溶液经过适当缓冲，并且液体稀释液首先用足够的盐或葡萄糖使之等渗。这些特定水溶液特别合适于静脉、肌内、皮下和腹膜内给药。例如，一个剂量可以溶于1ml等渗NaCl溶液中，或者加入到1000ml皮下输注液中或者注射到打算输注的部位(参见示范例，“Remington’sPharmaceutical Sciences”15th Edition，1035-1038页和1570-1580页)。在本发明的一些实施方案中，将活性颗粒或试剂配制至治疗混合物中，其每个剂量含有大约0.0001至1.0毫克、或大约0.001至0.1毫克、或大约0.1至1.0或甚至大约10毫克等。在给药时可使用多个剂量。
适合于其他给药形式的另外的制剂包含阴道栓剂。也可以使用直肠栓剂。栓剂是各种重量和形状的固体剂量形式，通常是含药的，用于置入直肠、阴道或尿道。置入后，栓剂被软化、熔化或溶解于腔液中。通常对于栓剂来讲，可包含传统的结合剂和载体，例如，聚二醇或甘油三酯；这些栓剂可以由含有0.5％到10％、优选地1％到2％的活性成分的混合物形成。阴道栓剂通常呈球形或卵圆形，每个重约5g。阴道加药有多种物理形式，例如膏状、胶状或液状，其与典型的栓剂概念不同。另外，栓剂可以用于结肠癌。还可以将纳米装置配制成吸入剂形式用于肺癌等的治疗。
XIII.癌症和病源疾病的治疗或预防方法
本发明的具体实施方案中提供了癌症治疗中治疗肿瘤的方法和组合物。可以预计本治疗方法可用于治疗任何具有已被鉴定了的特异性标志物或能被导向的癌症的治疗。本发明的方法预计可以治疗的细胞增殖性疾病或癌症包括人类肉瘤和癌，其包括但并不局限于，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、尤因(Ewing’s)瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、皮肾胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤(Wilm’s tumor)、颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星状细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听觉神经瘤、少突神经胶质瘤、脑(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤；白血病、急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、前髓细胞性、髓细胞单核细胞性、单核细胞性和红细胞白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真红血球增多症、淋巴瘤(Hodgkin’s病和非Hodgkin’s病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrbm’s巨球蛋白血症和重链病等。
可以预计本治疗可用于治疗任何特异性标志物已被鉴定的或可导向至特定病原体的病原性疾病。可被本发明方法治疗的病原体实施例包括，但并不局限于，嗜肺军团菌(Legionela peomophilia)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、苍白密螺旋体(Treponemapallidum)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、布氏疏螺旋体(Borrellia bargdorferi)、白喉棒状杆菌(Cornebacterium diphtheria)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒等。
实施例
提供下列实施例来证明和进一步阐述本发明优选的实施方案，不能解释为用来限制其范围。
实施例1
定量MTT生物相容性/细胞毒性试验
该实施例描述了在小鼠和大鼠原代成纤维细胞中进行定量MTT生物相容性/细胞毒性试验，来测量各种单独的树状体和核心-壳树状体分子的细胞毒性。尤其是采用标准定量MTT试验分析了PAMAM树状体(G5和G7代)、POPAM树状体(2，3，4代)、和核心-壳树状体分子(即POPAM“核心”树状体分子共价连接2或3个PAMAM“壳”分子)的细胞毒性(参见Kuhlmann等，1998；Sladowski等，1993；Wang等，1996；Watanabe等，1994)
简言之，将小鼠和大鼠原代成纤维细胞与MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2-二苯基溴化四唑，3-(4，5-dimethylthiazol-2-yi)-2diphenyl tetrazolium bromide)和或者是PAMAM树状体POMAM树状体、或者是核心-壳树状体分子一起培养24小时。然后通过540nm处吸光度(用来检测仅存在于活细胞中的MTT(黄色)裂解而产生的甲产物(紫色))来测量存活细胞量。
这些试验的结果表明在本发明的POPAM树状体与PAPAM以及核心-壳树状体的细胞毒性之间有显著的差别。具体地，试验的PAPAM树状体(G5和G7代)在浓度高达40μg/ml时没有产生明显的体外细胞毒性。相反，三种类型的POPAM(2，3，4代)诱导了浓度相关的细胞毒性效应，其CL50浓度对于小鼠成纤维细胞分别为40、12和12μg/ml，对于大鼠成纤维细胞分别为30、9和9μg/ml。有趣的是，核心-壳树状体分子并没有POPAM树状体具有的细胞毒性问题，只是在核心-壳树状体浓度超过30μg/ml时产生了可检测到的细胞毒性，当暴露于40μg/ml时24小时后只有5-10％的细胞被杀死。这些结果证明了本发明的核心-壳树状体分子有利的生物相容性特性。
实施例2
多功能树状体分子的构建
该实施例描述了具有导向和信号发生亚基的多功能树状体分子的构建。该实施例尤其描述了缀合至叶酸和荧光素的第五代(G5)PAMAM树状体的构建，其中树状体上剩余的氨基表面基团被乙酸酐或缩水甘油“加帽(capped)”。
图8提供了产生树状体的简图。通过G5 PAMAM G5与荧光素异硫氰酸盐和N(Et)3反应进行G5 PAMAM树状体的缀合。然后将该荧光素构建体与叶酸和EDC反应。产物中剩余氨基表面基团与乙酸酐或缩水甘油的反应分别导致它们转变成乙酰胺(acetamido)或双(2，3-羟丙基)酰胺部分。这些生物学和电中性的“加帽”基团产生叶酸/荧光素产物，并具有高度的水溶性。通过pH中和的物质在1∶1 DMSO/水中的超滤来纯化G5 PAMAM树状体。
实施例3
体外筛选试验
可以在体外分析本发明纳米装置的毒性和效率。在优选的实施方案中，在细胞培养模型中测试纳米装置。例如，用于诊断、监测、和治疗乳腺癌的纳米装置的效率可在乳腺癌细胞系中分析。例如，导向乳腺癌细胞的树状体通过缀合特异性识别特定乳腺癌细胞系过度表达的受体的配体或抗体来产生。例如，SUM-52细胞系具有扩增的FGFR-2、c-MET、和NCAM-1基因，并过度表达上述基因。所有这些基因的产物在SUM-52细胞表面高水平表达，并在正常细胞或其他乳腺癌细胞中检测不到表达。将含有针对任何这些表面暴露的因子的候选结合配偶体的树状体文库暴露于细胞，并且鉴定具有特异性和高度结合亲和性的候选对象。用成像组分、治疗组分等可以进行类似的试验。例如，将含有不同治疗试剂的树状体文库暴露于细胞系。筛选具有改变细胞生长或杀死细胞、而不伤害正常细胞的能力的试剂。理想地，在多孔板上进行这类试验，以可以同时或在很短的时间内筛选大量候选对象。在优选的实施方案中，筛选试验是自动化的。例如，可以通过提供检测由凋亡诱导的颜色变化(例如，如上所述的由本发明成像组分产生的比色变化)的系统而自动进行诱导凋亡的抗癌化合物的筛选。
许多种类的细胞系均可用于筛选试验。例如，对于乳腺癌，细胞系SUM-190和SUM-225具有扩增和过度表达的HER-2。因此，可使用抗体(如人源化形式的4D5(herceptin))，将树状体特异性地导向这些细胞。SUM-149、SUM-159、和SUM-229均过度表达EGFR。因此，使用EGR、TGR-α、或安非调节素(amphiregulin)将树状体导向这些细胞。SUM-44细胞表达HER-4，因此可通过HER2的配体(heregulin)-树状体缀合体而被导向。可使用可从ATCC获得的许多人乳腺细胞系作对照，包括BT20、MCF7、UACC-893和UACC812。这些细胞在表达HER-2和MUCl方面有所不同。可在分离的细胞群体或混合细胞群体中进行筛选试验。
实施例4
杀灭抗药性细胞
该实施例描述了使用缀合于树状体的顺铂来杀灭顺铂抗性细胞。在这些实验中，细胞活性通过基于四唑的比色的MTT试验来评估(下面会详细讨论)(Mosmann，J.Immunol.Meth.，65：55[1983])。于无血清、补充5％BSA、胰岛素和氢化可的松的Ham’s F-12培养基中培养人细胞系16N2。细胞以1×104/孔种于96孔微量滴定板。24小时后，换掉培养基，并将顺铂(Stem Chemicals)或树状体/铂缀合体加入到孔中。72小时后通过MTT试验评估细胞活性。结果示于图9。在图9中，药物浓度为铂当量。结果表达为死亡细胞相对于不加药物的对照细胞的百分比。数据表示平均值+/-SEM(n＝4)。聚合物1和聚合物2样品均为缀合了不同含量铂(分别与19.25和20.26％Pt的E3.5-COONa：Pt)的第3.5代PAMAM树状体。水凝胶化合物是缀合了Pt(含有6.25％Pt的E4NH2：Pt胶)的第四代PAMAM树状体。
实施例5
制备寡核苷酸/树状体超分子组装体(assemblies)的方法
作为控制寡核苷酸缀合至树状体表面伯氨基基团的第一步，用乙酸酐进行胺的部分或全部修饰。缀合前后的氨基基团的数目用1H NMR和电位滴定来确定。
1)通过N-乙酰化进行G7和G5 PAMAM完全的乙酰胺加帽
将树状体贮存液(在MeOH中，10wt％；0.05g，0.43μmol)置于干氮气冲洗过的25mL圆底烧瓶中，并在4℃逐滴加入摩尔数过量4倍的乙酸酐。将三乙胺碱(Aldrich)(0.23g；2.3mmol)加入反应混合物，室温轻微搅拌24小时，随后加入1mL MeOH(Aldrich，99.8％)稀释混合物。然后使该溶液在室温下反应24小时。将产物溶液旋转蒸发去除MeOH，并转移至3.5K MWCO透析管道(Spectrum)。然后用双蒸水(18.2MΩ，MiliQ)透析3天，中间换DI水5次。透析后，样品在-52℃冻干24小时产生白色粉末(57mg，94％)。该产物用1H NMR分析。
2)G7和G5确切末端氨基基团的确定
用具有Corning玻璃复合电极的Corning420 pH计在20℃进行完整的G7和G5树状体水溶液的电位滴定。简言之，将冻干的G7和G5树状体分别溶于10mL 0.1N NaCl溶液中，以防止由氨基基团的强阳性电荷引起的任何树状体内部的静电相互作用(例如参见，Kabanov等，Macromolecules 32：1904[1999])。通过加入0.1N HCl标准溶液(Aldrich)使树状体完全质子化，然后用0.1N NaOH标准溶液滴定，间隔3min达到恒定来进行pH测量。
3)通过化学剂量的N-乙酰化进行G7和G5 PAMAM的部分乙酰胺加帽
使用树状体表面精确数目的伯NH2基团，确定乙酸酐与氨基基团的摩尔比，使用上述方法反应。按照摩尔比将89％乙酸酐加入至氨基基团，每种核心和壳树状体预计分别有89％和90％乙酰胺加帽。表1总结了对G7和G5 PAMAM树状体的部分乙酰化的计量化学。
表1.核心和壳树状体的部分乙酰化的计量化学核心g M.W. mol Eq.d(g/cm3)mL摩尔比E70.1 115243 8.68E-07 1～1 434乙酸酐0.0342 102.09 3.35E-04 386.26 1.0820.0316 434×0.89三乙胺0.0407 101.19 4.02E-04 463.512 0.7260.0561 434×0.89×1.2MeOH(溶剂)1壳g M.W. mo1 Eq. d(g/cm3)mL 摩尔比E50.1 28682 3.49E-06 1～1 119乙酸酐0.0381 102.09 3.73E-04 107.1 1.0820.0352 119×0.9三乙胺0.0453 101.19 4.48E-04 128.52 0.7260.0625 119×0.9×1.2 MeOH(溶剂)1
4)序列设计
一个50碱基寡聚物的头16个核苷酸作为间隔，后面的34个核苷酸作为互补靶序列的识别组分。选择连接杂交时识别片段能将核心和壳树状体紧密连接在一起的序列。此外，将识别区段设计成可被SfiI限制性酶切开，因此该构造树状体的任何片段形式可以在体内使用时被观察到。核心和壳寡核苷酸序列分析参见下面从NTI载体系统得到的数据。
核心ssDNA(50聚体)
5’-GGGGGGGGTTTTTTTTggccATATAggccTTTTggccTATATggccTTTT
-3’(SEQ ID NO：2)
MW 5,535.1
％G+C 8.0
Tm 0.7
％GCTm 66.1
ΔG -104.2
3’ΔG -16.7
ΔH -447.0
ΔS -1143.9
壳ssDNA(50聚体)
5’-GGGGGGGGAAAAAAAAggccATATAggccAAAAggccTATATggccAAAA
-3’(SEQ ID NO：3)
MW 5,679.1
％G+C 8.0
Tm 1.1
％GCTm 6.1
ΔG -104.4
3’ΔG -17.1
ΔH -446.1
ΔS -1140.1
该构建体事实上在每个寡核苷酸上排除了发夹形成，并极大地降低了核心/核心和壳/壳之间杂交的可能性。这还使得使用不同TM的核心/壳杂合子比核心/核心或壳/壳杂合子可以更精确控制核心/壳杂交。这将进一步减少不必要的交联(凝胶形成)的发生。此外，限制性位点3’末端和之间加入额外核苷酸将在体内接头可接近性/降解测试中改善SfiI识别和切割dsDNA识别位点的能力。因此，推测理论上核心/壳二聚体的形成如下。核心-5′-GGGGGGGGTTTTTTTTggccATATAggccTTTTggccTATATggccTTTT-3′
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3′-AAAAccggTATATccggAAAAccggATATAccggAAAAAAAAGGGGGGGG-5′-壳
上述说明书中提及的所有出版物和专利均在此引用作为参考。本发明描述的方法和系统的多种修饰和改变对于本领域熟练人员来说是十分明显的，没有超出本发明的范围和精神。尽管结合特别优选的实施方案对本发明进行了描述，但应当理解要求的该发明不应当局限于该具体的实施方案。事实上，为开展本发明对描述的方式进行的多种修饰对于那些在生物化学、免疫学、化学、分子生物学、医学领域或相关领域的技术人员是十分明显的，并包括在下面权利要求中的范围之内。