扰乱膜结合性化合物 【发明领域】
本发明涉及新颖的化合物、药物组合物和采用它们的新颖的治疗与诊断方法。
参考文献列表
下列参考文献被视为有助于理解本发明的背景：
Bevers，E.M.，等，Biochim.Biophys.Acta，1439：317-330，1999；
Bombeli，T.，等，Blood，89：2429-2442，1997；
Bratton，D.L.，等，J.Biol.Chem.，272：26159-26165，1997；
Bursch，W.，等，Trends Pharmacol. Sci.，13：245-251，1992；
Kockx M.M.，等，Cardiovasc.Res.，45：736-746，2000；
Mallat，Z.，等，Circulation，96：424-428，1997；
Martin，S.，等，J.Exp。Med.，182：1545-1556，1995；
Pugsley，W.，等，Stroke，25：1393-1399，1994；
Sims，P.J.，等，Thromb.Haemost.，86：266-275，2001；
Stary，H.C.，等，Circulation，92：1355-1374，1995；
Van den Eijnde，S.M.，等，Cell Death Diff.，4：311-316，1997.
下文在对上述参考文献进行引用时将在括号内指出第一作者和出版年份。
【发明背景】
完整真核生物细胞的生物膜是以高度组织化的结构为特征的。这种高水平的组织化尤其由下列因素决定：构成膜的特定脂质的分子结构；组成膜的各种脂质之间的比例；磷脂在膜的外部与内部小叶之间的分布；和膜的蛋白质组分。
维持高水平的膜组织化是正常细胞生理学的基础，正常膜组织化的实质性扰乱和改变(PNOM)发生在大量生理学和病理学条件中，表现为多种疾病(Martin，S.等，1995)。这类改变和扰乱可能在形态水平上(在经历细胞程序死亡的细胞中所观察到的膜起泡)和分子水平上都是明显的。伴有细胞活化、细胞疾病或细胞死亡的扰乱的范围尚未得到充分阐明。它们尤其包括膜磷脂地混杂和再分布，同时氨基磷脂向细胞表面运动，主要为磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)，它们在正常情况下几乎完全被限制在膜双分子层的内部小叶，还有鞘磷脂和磷脂酰胆碱从膜的外部小叶向内部小叶运动(Sims，P.J.等，2001)。这种再分布在本文中被称为细胞膜脂质不对称性(CMLA)的丧失。这些改变在使细胞表面成为若干凝血因子配合物(例如tenase和凝血酶原酶配合物)装配的催化平台中扮演不可缺少的角色(Bevers，E.M.等，1999)。因而，血小板在活化后经历PNOM，这些改变在正常血液凝固中以及在大量障碍中的异常、过度凝血的引发和/或传播中构成重要的因素。这些障碍尤其包括动脉或静脉血栓形成或血栓栓塞(例如脑中风、心肌梗塞、深静脉血栓形成(DVT)、播散性血管内凝血(DIC)、血栓性血小板减少性紫癜等)；不稳定的动脉粥样硬化斑、镰刀细胞疾病；β-地中海贫血；抗磷脂抗体综合征；系统性红斑狼疮(SLE)；与膜微粒脱落有关的障碍，例如与心肺旁路有关的神经功能障碍。
细胞程序死亡是发生细胞膜改变/扰乱的另一种主要情形(Bratton，D.L.，等，1997)。细胞程序死亡是细胞自我破坏或“自杀”的内在程序，这是每种真核生物细胞所固有的。响应于激发性刺激，细胞经历细胞皱缩、细胞膜起泡、染色质凝缩与碎裂、最后细胞转化为膜结合性粒子簇(细胞程序死亡体)等事件的高度特征性级联，然后被巨噬细胞吞噬(Bursch，W.，等，1992)。PNOM是细胞程序死亡的普遍现象，它发生在细胞程序死亡级联的早期，很可能在细胞进入死亡过程之时，还已显示是吞噬细胞对细胞程序性死亡的识别和除去中的重要因素(Vanden Eijnde，S.M.，等，1997)。
最近发现在PNOM与细胞程序死亡性细胞的有力促凝血活性之间存在密切关系(Bombeli，T.，等，1997)。细胞程序死亡性内皮细胞中的PNOM(例如在动脉粥样硬化斑中(Mallat，Z.，等，1997))很可能在血栓形成性血管障碍的发病机理中扮演重要角色。PNOM还是炎性细胞(即淋巴细胞、巨噬细胞)的特征，受各种激发物的活化。
与PNOM膜选择性结合的化合物因此充当重要的工具，用于检测和定向经历活化、损伤或死亡过程、尤其是细胞程序死亡的细胞。在临床意义上，与所述膜结合可以用于：(1)诊断(例如诊断疾病进程、监测疾病的过程与进展、监测各种治疗方法对疾病过程的效果)；(2)治疗(例如定向于PNOM细胞的药物，和/或与PNOM有关的障碍的调节)；和(3)廓清(选择性结合和除去体液中的PNOM要素)。
发明概述
本发明基于发现这样的化合物，它能够与经历正常膜组织化扰乱(PNOM)的细胞选择性结合，而与维持正常膜组织化的细胞结合的程度则低得多。
用于本发明的术语PNOM涉及具有至少一种下列特征的细胞：
(i)膜磷脂的混杂，伴有磷脂在细胞膜内部与外部小叶之间分布的正常不对称性下降；
(ii)氨基磷脂暴露在外部细胞表面上(主要是磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺的暴露)；
(iii)膜成分包装的减低；
(iV)脂质在每种膜小叶内的正常分布减低，例如单侧区域的形成，分别是特定脂质膜成分的富集或贫乏，例如磷脂酰丝氨酸或胆固醇。
术语“扰乱膜结合性化合物”(PMBC)涉及这样一种化合物，它与以PNOM为特征的膜选择性结合，而与正常膜结合的程度则较低。
PMBC在本发明中用于制备与扰乱膜选择性结合的药物。PMBC类化合物被指定为“NST700”。PMBC类包括新化合物和已知化合物。
因而，按照一个方面，本发明提供扰乱膜结合性化合物(PMBC)在药物制备中的用途，该药物用于与经历其正常膜组织化扰乱的细胞选择性结合，所述PMBC具有式Ce，其中e选自1、2和3，C是具有式(I)的基团：
或式(I)结构的药学上可接受的盐和水合物，其中所述C基团可以各自是相同或不同的；
Z代表由环烷基、环烯基、杂环基、芳基或杂芳基或这类基团的组合构成的环系，所述环系由5-10个原子组成；
X代表CH、CH2、N、NH、O或S；
n、m、r和p各自独立地是0或1；其中n+r＝1；m+p＝1；
R1可以各自是相同或不同的，独立地选自由A和L-A组成的组，其中L可以各自是相同或不同的，独立地选自由D、U、U-D、D-U、D-U-O、O-U-D、D-U-NH、NH-U-D、D-U-D和U-D-U组成的组；
U代表氢或者选自可选被取代的C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C3-C6支链亚烷基、C3-C6支链亚烯基、C3-C6亚环烷基、亚环烯基、芳基、亚杂环烷基、亚杂环烯基、杂芳基和所述基团的任意组合；
D选自由O、S、SO、SO2、SO2NH、NHSO2、NH、PO、PO2、POOH、PO(NH)2、NHPOOH、CO、C(O)O、NHCO、CONH、SO2NHCHCOOH、SO2NHCO或当D是二价原子团时上述列表的对应含义组成的组；
A可以各自是相同或不同的，当e是1时，A是在pH约7下带电的部分；或者当e是2或3时，A独立地选自极性不带电部分和在pH约7下带电的部分，所述带电部分是带正电的、带负电的或两性离子形式；
R2是WR3b，其中W缺无或者选自由仲或叔胺、氧、硫、碳和D组成的组，其中D是如上所定义的；
R3代表氢或C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C3-C8支链烷基、C3-C8支链烯基；R3部分可以是相同或不同的；
b是1、2或3；
当e是2或3时，C基团是彼此直接或者通过L部分连接的，其中L是如上所定义的。
在一种优选的实施方式中，e是2。
在另一种优选的实施方式中，上述式IPMBC的Z代表由环烷基、环烯基、杂环基、芳基或杂芳基构成的环系，所述环系由5或6个原子组成；
U代表可选被取代的C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、C3-C6支链亚烷基、C3-C6支链亚烯基和所述基团的任意组合；
和R2由WR3b组成，其中W缺无或者选自由仲或叔胺、氧和硫组成的组，R3和b是如上所定义的。
优选地，b是2，R3独立地选自下列组合：(a)甲基，(b)丁基，(c)己基，(d)丁基与甲基，(e)己基与甲基的组合。
在式(I)的PMBC中，每个R1和R2可选地可以包含Y，所述Y是连接基团，与任意下列连接：
1、固体载体；
2、成像标志，例如荧光、X-射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层照相术(PET)或放射性同位素扫描的检测剂；
3、另一种药物，医学上可用于预防或治疗特定疾病，经由与PMBC连接定向于病患细胞或组织。优选地，该药物可以是细胞程序死亡抑制剂(例如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂、抗氧化剂、Bcl-2系统调节剂)或细胞毒剂，例如细胞程序死亡激活剂(例如抗癌药)；作为替代选择，该药物优选地是抗凝血剂、抗血栓形成剂或血管溶解剂。在这类情况下，所述药物优选地选自抗血小板剂、肝素、小分子肝素、糖蛋白IIb/IIIa拮抗剂、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、或凝血因子抑制剂，例如凝血酶抑制剂或Xa因子抑制剂；进而作为替代选择，该药物优选地是抗炎药或免疫调节药。
优选地，当e是整数2或3时，PMBC的C基团是彼此直接或者通过L部分连接的，其中L是如上所定义的。
在另一种优选的实施方式中，用在本发明中的PMBC包含具有下式(II)的C基团：
包括式(II)结构的药学上可接受的盐和水合物，其中R1、R2、n、m、r和p都具有与上述定义相同的含义。
在另一种优选的实施方式中，式(I)的PMBC包含这样的C基团，其中所述C基团由萘基组成(也就是说Z是苯基环)，该萘基的一个环与选自结构-SO2-(NH)-(CH2)v-A、-SO2-O-(CH2)v-A的单元连接，其中v代表整数1-5；该萘基的第二个环与单烷基或二烷基氨基连接；A是由氨基和/或酸性基团构成的带电基团，酸性基团例如羧酸、磷酸、磷酸盐、磺酸或硫酸。
优选地，R3选自下列组合：(a)两个甲基，(b)两个丁基，(c)两个己基，(d)丁基与甲基的组合，(e)己基与甲基的组合。
按照另一种优选的实施方式，用在本发明中的PMBC具有下式(III)的C基团：
包括其药学上可接受的盐和水合物，
其中A是由氨基和/或羧酸基团构成的带电基团，至少一个R3是C2-C6烷基，L是-SO2-(NH)-(CH2)v(v代表整数1-5)。
更具体地，PMBC具有下式(IV)，被指定为NST701：
有些PMBC是新化合物，代表本发明的第二方面。这些新化合物具有结构Ce，其中C是如上所定义的，e是2(也就是说新化合物是二聚物)或1；其中在e＝1的情况下，PMBC包含除-(CH2)5-以外的L基团。
下列PMBC不是新化合物：N2，N6-双[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺酰基]-J-赖氨酸、N，N’-双[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺酰基]-L-胱氨酸、N，O-双[[5-(二甲氨基)-1-萘基]磺酰基]-L-酪氨酸和N，N”-双[[2-(5-(二甲氨基)萘-1-磺酰基)氨基乙基]氨基甲酰基甲基]二亚乙基三胺-N，N’，N-三乙酸。
优选地，本发明的新化合物具有下式(V)：
其中G1、G2、G3和G4可以是相同或不同的，独立地选自氢、COOH、C(O)NH2、NH2和-N+(CH3)3；
M选自缺无、NHC(O)、C(O)NH、NH、O、S、S-S、CH2、(CH2)2、NH-(CH)2NH、N(CH2)kCOOH和N+(CH3)(CH2)kCOOH；
Q1、Q2、Q3和Q4可以是相同或不同的，独立地选自缺无或(CH2)k；
k是整数1-6；
R3代表氢或C1-C6烷基。
优选地，R3是甲基、丁基或己基。
在特定的实施方式中，本发明的新化合物具有下式(VI)，被指定为NST740：
在另一种实施方式中，本发明的新化合物具有下式(VII)：
包括其药学上可接受的盐和水合物，其中R3具有与上述定义相同的含义，y是整数2-6，z是整数1-6，T选自缺无、氢和甲基。
优选地，R3选自甲基、丁基或己基，y是2或3，z是1、2或3。
在另一种特定的实施方式中，本发明的新化合物具有下式(VIII)，被指定为NST750：
在另一种特定的实施方式中，本发明的新化合物具有下式(IX)：
包括其药学上可接受的盐和水合物，其中R3可以是相同或不同的，具有上述相同含义。
优选地，新化合物具有式(IX)结构，其中R3是甲基，被指定为NST751。
在特定的实施方式中，用在本发明中的PMBC具有下式(X)，被指定为DDL：
在另一种特定的实施方式中，用在本发明中的PMBC具有下式(XI)，被指定为
在另一种优选的实施方式中，用在本发明中的PMBC具有下式(XII)：
包括其药学上可接受的盐和水合物，其中R3选自甲基、丁基和己基。
与经历正常组织化扰乱的细胞膜(PNOM)选择性结合而基本上不与维持其正常组织化的膜结合或者结合程度低得多的PMBC可以用在本发明的三种不同方法中。
按照第一种方法，以下称为“检测方法”，选择性结合可以用于检测细胞或细胞派生粒子，它们含有扰乱的膜(PM)。这可以用于诊断其中细胞经历PNOM的疾病，下文将有解释。
按照第二种方法，以下称为“治疗方法”，与PM选择性结合的性质可以用于使用PMBC作为定向部分治疗疾病、定向治疗用药物于其中发生PNOM的体内器官和组织，例如细胞死亡、血栓形成或炎症的区域。
按照被称为“廓清方法”的本发明第三种方法，本发明化合物与PM的选择性结合用于从具有PM的细胞或包含这类膜的更大结构(例如在血液中循环的栓子)中廓清体液。
按照检测方法，本发明涉及组合物，包含如上所定义的PMBC作为有效成分，用于体外、来自体内或体内检测生物细胞样本中的扰乱膜。根据本发明检测方法的PMBC能够与存在于测定样本中的PM选择性结合。然后，可以通过本领域已知的任意手段鉴别所述结合。PMBC可以具有其自身的可检测性质，例如荧光发射，这些可检测性质例如可以通过荧光显微镜或流式细胞测定设备加以检测。
术语“以PM为特征的疾病”涉及这样一种疾病，其表现之一是正常膜组织化的扰乱。这并不意味着这种扰乱必然是疾病的原因或唯一后果，而是它的表现之一。
按照优选的发明实施方式，PMBC可以包含可检测标记或者经由Y部分与之结合，例如荧光发射部分、放射性标记、能够经历酶反应产生可检测颜色的标记、用于X-射线、MRI、放射性同位素成像或PET扫描的标记，以生成PMBC-标记加合物。这类加合物使可检测标记能够通过本发明化合物与PM以选择性方式结合。然后，可以通过本领域已知的任意方式检测可检测标记，根据所用的特定标记，例如荧光、放射性发射、显色、MRI、X-射线等。术语“结合”涉及共价或非共价(例如静电)结合，连接PMBC与可检测标记。作为替代选择，由于其结构的化学属性，PMBC可以具有其自身的可检测性质，使其能够被任意上述技术检测。
优选地，所述可检测标记选自金属离子：用于放射性同位素扫描的Tc-99m和In-111，用于MRI的Gd。有利地，Y包含金属螯合基团，所述金属是可检测标记，其中所述螯合基团选自任意下列结构：
其中该螯合基团经由其氨基之一与化合物连接。
进而有利地，Y连接基团包含L单元，连接螯合基团与PMBC的羧基、胺或磺酰胺部分；所述L单元是如上所定义的。上述加合物能够用于检测和诊断多种以PM的形成为特征的生理学条件(包括正常条件)、病理学条件、疾病或障碍。
以PM为特征的条件的实例如下：
以过度细胞程序死亡的发生为特征的疾病，例如变性障碍、神经变性障碍(例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病)、AIDS、脊髓发育不良综合征、缺血或毒性发作、移植排斥期间移植细胞丢失；肿瘤、尤其是高度恶性/侵袭性肿瘤，除了过度组织增生以外，也经常是以增强的细胞程序死亡为特征的。
表现为过度凝血的疾病，其中PNOM发生在血小板活化期间和/或其他细胞要素(例如内皮细胞)的活化或损伤期间。这些疾病尤其包括动脉或静脉血栓形成、血栓栓塞(例如心肌梗塞、脑中风、深静脉血栓、播散性血管内凝血(DIC)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP))、镰刀细胞疾病、地中海贫血、抗磷脂抗体综合征、系统性红斑狼疮。
炎症和/或与免疫介导的病因学或发病机理有关的疾病，例如自体免疫障碍，例如抗磷脂抗体综合征、系统性红斑狼疮；结缔组织障碍，例如类风湿性关节炎、硬皮病；甲状腺炎；皮肤病学障碍，例如天疱疮或结节性红斑；自体免疫性血液病学障碍；自体免疫性神经病学障碍，例如重症肌无力；多发性硬化；炎性肠障碍，例如溃疡性结肠炎；结节性脉管炎。
动脉粥样硬化斑、尤其是不稳定的、易损的和有破裂倾向的斑，也是以PM结构为特征的，包含细胞程序死亡的巨噬细胞、细胞程序死亡的平滑肌细胞、细胞程序死亡的内皮细胞、活化的血小板和活化的炎性细胞。
经由检测有关的PNOM来检测这些病理学条件、障碍或疾病可以是单独的目标，仅仅用于诊断特定个体中疾病条件的存在。
所述检测还可以对已知患有疾病的个人进行，目的是评价疾病严重性和监测对各种治疗药征的响应。这类监测的实例是评价对抗癌疗法的响应。由于大多数抗肿瘤治疗——化疗法或放疗法通过诱导细胞程序死亡发挥作用，疗法诱导的肿瘤细胞程序死亡的PMBC检测基本上可以缩短抗癌治疗给药时间与适当评价其功效时间之间的迟滞期。
而且，所述检测可以用于监测抗癌治疗的副作用。大部分这类副作用是由于事与愿违的治疗对正常而敏感的细胞诱导细胞程序死亡，例如胃肠上皮或骨髓造血系统的细胞。这类细胞程序死亡的PMBC检测可以允许早期检测这种事与愿违的组织损伤，更好地优化治疗方案。
另外，所述检测可以致力于鉴定肿瘤内部细胞程序死亡的负载，鉴定肿瘤的发展水平，和测定转移。
同样，本发明化合物或组合物可用于监控器官移植后的移植存活，因为可由PMBC潜在检测的细胞程序死亡在移植排异期间的细胞损失中起主要作用。
另外，所述检测可以致力于监测对细胞保护性治疗的响应，从而通过使细胞死亡成为评价量度，有助于筛选和开发能够抑制各种疾病(例如上文引用的那些)中的细胞丢失的药物。
所述检测还可以用于检测动脉粥样硬化斑，因为这类斑的去稳定化赋予它们易损的、有破裂的倾向、血栓形成和栓塞化，是以若干要素的参与为特征的，它们共同具有扰乱的膜：(i)细胞程序死亡的细胞：不稳定的斑是以细胞程序死亡的巨噬细胞、细胞程序死亡的平滑肌细胞和细胞程序死亡的内皮细胞为特征的；(ii)活化的血小板；(iii)活化的炎性细胞。脂质内核、包含脂质的细胞外蓄积，也是动脉粥样硬化斑经历去稳定化的证明之一(Kockx M.M.，等，2000；Stary，H.C.，等，1995)。PMBC和本发明化合物由于它们的疏水性芳族组分，还可以用于鉴别这类易损的动脉粥样硬化斑的脂质内核。
检测还可以在组织培养和动物模型的细胞程序死亡研究中用于基础研究目的，还可以帮助确定细胞程序死亡在各种组织的正常发育和内环境稳定中的角色，例如在胚胎发生期间的中枢神经系统发育中，以及在正常老化等情形期间。
按照这种方法，本发明进一步涉及检测生物细胞中PM的方法，该方法包含：
(i)使细胞样本与PMBC在使所述PMBC能够与生物膜结合的条件下接触；
(ii)检测化合物与所述细胞的结合；显著量所结合的化合物的存在说明在所述细胞中存在PM。
本发明的方法可以用于诊断以PNOM的存在为特征的疾病，例如任意一种上述疾病。
本发明的方法还可以用于监测各种治疗药征对所述疾病或医学条件的效果，或者作为替代选择用于如上所解释的基础科学研究目的。
按照本发明的第二种方法“治疗方法”，本发明涉及药物组合物，包含活性成分，可选地和药学上可接受的载体；所述活性成分包含由(i)药学活性药物和(ii)PMBC构成的PMBC-缀合物。所述药物组合物发挥定向药物于经历PNOM的细胞的作用，因此能够用于治疗如上所定义的以PM的存在为特征的疾病。
术语“PMBC-缀合物”用于表示这样一种缀合物，包含与PMBC的互补单元缔合的药物，其中所述缀合物能够充当PMBC。所述缔合作用可以通过共价结合、非共价结合(例如静电力)或载体粒子(例如脂质体)的形成，其中包含在其表面具有PMBC的药物，定向该配合物于PM。
PMBC-缀合物的目的是使药物仅选择性指向表现PNOM或表现显著量PNOM的细胞、组织或器官。一旦药物到达靶，它应当能够发挥其生理活性，无论仍然作为PMBC的一部分处于配合物中、从互补性PMBC单元分离(例如通过裂解、破坏、天然酶的活性)、在其膜上具有PMBC的含药脂质体的吞噬作用、还是通过任意其他已知的机理。
在选择药物时应当根据组合物适用的特定疾病。
关于表现为异常与过度凝血的引发或传播的疾病(例如动脉或静脉血栓形成、血栓栓塞、镰刀细胞疾病、β-地中海贫血、抗磷脂抗体综合征、播散性血管内凝血(DIC)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)、系统红斑狼疮)的治疗或预防，药物应当是这样一种化合物，已知它抑制血块的形成或者溶解已经产生的血块，例如抗血小板剂、肝素、小分子肝素、糖蛋白IIB/IIIA拮抗剂、组织纤溶酶原激活剂(tPA)、或凝血因子抑制剂，例如凝血酶抑制剂或Xa因子抑制剂。
若疾病表现为不适当的和过度的细胞程序死亡，例如变性障碍、神经变性障碍(例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病)、AIDS、脊髓发育不良综合征、缺血或毒性发作、移植排斥期间的移植细胞丢失，则药物应当能够抑制细胞程序死亡。这类药物尤其可以是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂、Bcl-2系统调节剂或抗氧化剂。
若疾病是炎症和/或与免疫介导的病因学或发病机理有关的疾病，例如自体免疫障碍，例如抗磷脂抗体综合征、系统性红斑狼疮；结缔组织障碍，例如类风湿性关节炎、硬皮病；甲状腺炎；皮肤病学障碍，例如天疱疮或结节性红斑；自体免疫性血液病学障碍；自体免疫性神经病学障碍，例如重症肌无力；多发性硬化；炎性肠障碍，例如溃疡性结肠炎；结节性脉管炎，则药物应当是抗炎药或免疫调节药。
关于不稳定的动脉粥样硬化斑(以血栓形成、炎症或细胞程序死亡为特征)的治疗或预防，药物可以选自上述各组。
本发明的缀合物可以包含抗癌药，目的是增强抗癌方案的功效。抗癌方案的增强作用是这样实现的：(1)定向所述缀合物于以异常过度细胞程序死亡负荷为特征的肿瘤组织(后者经常与肿瘤侵袭水平有关)；或(2)使用两波细胞程序死亡：第一波使用标准的化学治疗剂或放射治疗剂，致力于引发肿瘤内的细胞程序死亡过程；继之以第二波细胞程序死亡，其中给以PMBC-药物缀合物形式的抗癌药，它被定向于由第一波产生的细胞程序死亡的细胞。因而，实现抗癌药在肿瘤块内的局部浓度增加，所以增强局部肿瘤杀死过程。
本发明的药物组合物可以通过任意已知途径给药，尤其是口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、舌下、眼内、鼻内或局部给药。在选择载体时应当根据所需的给药方式，包括任意已知组分，例如溶剂；乳化剂、赋形剂、滑石；矫味剂；着色剂等。如果需要的话，药物组合物还可以包含其他药学活性化合物，它们用于治疗疾病、消除副作用或增加活性组分的活性。
本发明还涉及包含药物的PMBC、即PMBC-缀合物在药剂制备中的用途。
根据本发明的用途优选地用于制备这样一种药剂，它治疗和检测以PM的存在为特征的疾病和/或其中PM扮演病因学或致病角色的疾病。这类疾病的实例参见上文。
按照这个方面，本发明更进一步涉及改善表现为PM的疾病治疗的方法，包含对需要这样一种治疗的个体给以有效量的PMBC-缀合物，所述缀合物包含对所述疾病有治疗活性的药物。缀合物允许选择性定向药物于承受PNOM的组织，从而增加其局部浓度，潜在地增强其对靶部位的治疗效果。这类医学障碍是如上所定义的。
术语“有效量”涉及能够在可测量的程度上减少至少一种疾病不利表现的量，在选择时应当根据所用的药物、给药方式、患者的年龄与体重、疾病严重性等。
第三种方法称为“廓清方法”，利用PMBC与PM特异性结合的性质廓清细胞、粒子、微粒或任意含有PM的结构的体液。优选地，体液是血液或血液产物。
很多需要体外循环的外科或内科干预与血液要素暴露于外源性人工环境有关。这经常引起血液细胞的活化与损伤、全身炎症和血栓栓塞现象，潜在地具有严重的临床后果，例如神经功能障碍。因此需要检测和除去所述被损伤的、被活化的或细胞程序死亡的血液细胞。
因而，本发明涉及固定在固体载体上的PMBC。所述固定化可以是直接附着，通过共价或非共价结合，或者是通过间隔基团附着。被固定的PMBC打算廓清体液中的PM细胞或含有PM的结构。
术语“PM细胞”涉及膜经历PNOM的细胞。通常关于血液或血液产物，这包括活化的、细胞程序死亡的或损伤的红细胞、白细胞、血小板、血小板派生微粒、组织巨噬细胞和内皮细胞。
术语“含有PM的结构”涉及细胞和/或非细胞组分的聚集体，它含有具有PNOM的膜。该术语通常涉及微栓子，它们是促凝血的粒子和促凝血的细胞。所述微栓子包含活化的血小板、血小板派生微粒、血小板-纤维蛋白凝块、损伤的细胞、衰老的细胞、细胞程序死亡的内皮与血液细胞、细胞程序死亡的尸体和细胞碎屑。这些要素是以PM为特征的，所述微栓子可以沉积在远端小血管中，使它们闭塞和/或引发局部血栓形成，从而导致局部缺血。事实上，这些微栓子在各种器官——特别是中枢神经系统——毛细血管中的广泛沉积目前被视为在心脏手术期间心肺旁路后器官损伤与功能障碍发病机理中的主要因素(Pugsley，W.，等，1994)。
术语“固体载体”在本发明的上下文中涉及固体基质、不溶性基质和不溶性载体。根据本发明的固体载体可以形成各种结构，例如微粒、微滤器或微毛细管的堆积体，可以由各种材料组成，例如氧化铝、硅藻土、C盐、碳酸钙、硫酸钙、离子交换树脂、硅胶、木炭、安伯来特、dowex、Eupergit和乙磺酰氧基纤维素。
按照优选的本发明实施方式，固体载体具有大量与PMBC结合的珠粒。优选地，这些珠粒是涂有树脂的珠粒。作为替代选择，这些珠粒可以是磁性珠粒。
若固体载体包括大量纤维或微毛细管，体液流过其中和/或其间，则其内部和/或外部表面被PMBC覆盖。
固定在固体载体上的化合物构成过滤装置的一部分。因而按照廓清方法，本发明进一步涉及过滤装置，包含容器、流体入口和流体出口，容器含有固定在所述固体载体上的PMBC。体液、例如血液或血液产物通过所述入口进入容器，与容器中所含有的固定化PMBC接触和粘附。因而，体液被廓清了，除去具有扰乱膜的循环细胞，例如损伤或死亡的细胞，或者除去更大的结构，例如具有扰乱膜的栓子。所以，从所述出口流出的流体减少了所述含有PM的细胞或含有PM的结构的含量或者基本上没有它们。
过滤装置可以构成体外循环仪器的可替换的、永久的或添加的部分。因而，本发明还涉及包含所述过滤装置的体外循环仪器，其中循环通过该仪器的血液也穿过该装置。
这类仪器的实例是心肺旁路仪；血液透析仪；血浆除去仪和输血仪，例如本领域现有的输血袋。
廓清方面还提供从生物流体、优选体液中除去含有PM的细胞或含有PM的结构的方法。该方法包含：使体液与固定在固体载体上的PMBC接触，接触的条件和时间足以使含有PM的细胞或含有PM的结构与PMBC结合，由此从体液中除去至少一部分所述含有PM的细胞或粒子。
体液(例如血液或血液派生产物)与固定化PMBC的接触可以通过本领域已知的任意方法进行，以从流体中除去粒子，具体方法为使体液流经本发明的过滤装置，由此廓清血液，除去至少一部分其中存在的微栓子。
本发明的方法可以用于通过从血液中除去潜在有害的含有PM的细胞或含有PM的结构(主要是微栓子)，改善牵涉体外循环的操作的临床结果，例如需要心肺旁路的手术，由此减少操作期间的血栓栓塞事件的危险。在实践中，过滤装置可以置于体外循环机与患者之间，从而从血液中滤出PM细胞或聚集物。作为替代选择，可以将血液暂时转移到包含过滤装置的系统中，进行PM要素的过滤，然后将纯化后的血液返回到全身循环中。该方法还可以用于从经历血液透析的患者或经历血浆除去的患者的循环中廓清含有PM的细胞或含有PM的结构。
该方法还可以用于在输血前处理所贮存的血液，以便最小化其中存在的含有PM的细胞或含有PM的结构的量，从而最小化与输血有关的各种并发症。关于所贮存的血液的处理，可以采用所述过滤方法作为血库血液加工的一部分，或者用在向患者输血期间，在这种情况下所述滤器可以置于输血袋与患者之间。
附图的简要说明
为了理解本发明和了解如何在实践中实施，现在将描述优选的实施方式，其中评价了本发明化合物与由于细胞程序死亡或活化作用而经历PNOM的细胞结合的检测。通过荧光显微镜检查或流式细胞测定(FACS)分析，监测化合物内在荧光的强度，测量结合作用。现在将借助非限制性实施例描述所述优选的实施方式，并参照附图，其中：
图1：DDL与活化红细胞(RBC)的选择性结合；流式细胞测定分析；
图2：荧光显微镜检查，显示DDC与细胞程序死亡的细胞的选择性结合；
图3：DDC与活化红细胞(RBC)的选择性结合；流式细胞测定分析；
图4：DDC与活化血小板的选择性结合；流式细胞测定分析；
图5：用DDC体内检测肝细胞程序死亡；
图6：用DDC体内检测肿瘤内细胞程序死亡的细胞，与TUNEL来自体内测定法对比；
图7：用NST750体内检测化疗法诱导的小肠上皮细胞程序死亡。
附图的详细解释
图1：DDL与活化红细胞(RBC)的选择性结合；流式细胞测定分析：
在Ca2+的存在下，将RBC用N-乙基马来酰亚胺(NEM)和钙离子载体A23187处理进行活化(Kuypers A.等，1996，Blood，87，1179-1187)。向活化组或对照组(未处理的RBC)加入DDL(最终浓度1μM)。然后使用Beckton-Dickinson细胞分类器和CellQuest软件，对细胞进行流式细胞测定(FACS)分析。激发波长360nm，发射波长530nm。完整的RBC不表现显著的DDL结合(蓝线，类似于基础的背景荧光(黑线))，而活化的RBC表现显著的DDC结合，反映在峰显著漂移到更高的荧光值(红线)。X轴代表530nm下的荧光，Y轴代表所统计的RBC数。
图2：荧光显微镜检查，显示DDC与细胞程序死亡的细胞的选择性结合：
暴露于500μM多巴胺达18小时，诱导HeLa细胞经历细胞程序死亡，然后用DDC(100μM)培育。未处理的细胞充当对照。利用IX70荧光显微镜(Olympus)进行细胞肉眼检查，测量DDC化合物的固有荧光强度(激发波长360nm，发射波长530nm)。在对照培养物(a)中，完整的细胞保持未被染色。相形之下，在细胞程序死亡的培养物(b)中，大多数细胞特异性结合DDC。对照培养物内小部分细胞结合了DDC，这代表天然存在的细胞死亡过程，是细胞培养生长所常见的(放大率X400)。
图3：DDC与活化红细胞(RBC)的选择性结合；流式细胞测定分析：
向对照与活化的RBC加入DDC(最终浓度500μM)，使用Becton-Dickinson细胞分类器和CellQuest软件，对细胞进行FACS分析。激发波长360nm，发射波长530nm。在加入DDC(蓝线)后，完整的RBC(黑线)不表现显著的向更高荧光值漂移，而活化的RBC是以显著更高的DDC结合为特征的，反映在峰漂移到更高的荧光值(红线)。X轴代表530nm下的荧光，Y轴代表RBC数。
图4：DDC与活化血小板的选择性结合；流式细胞测定分析：
暴露于胶原和凝血酶，使血小板活化。(a)显示DDC与活化血小板选择性结合的FACS斑点分析：Y轴显示530nm下的荧光强度，说明DDC结合，X轴显示前角光散射，这与细胞直径有关。对照血小板如左栏所示，表现低水平的荧光，说明缺少显著的DDC结合。相形之下，用胶原和凝血酶活化的血小板(如右栏所示)表现明显增加的荧光值，说明大部分血小板被DDC标记。每栏顶部矩形中的数字表示显示荧光值增加的总体内血小板的百分率。(b)显示结果的FACS直方图：X轴显示530nm下的荧光强度，Y轴显示事件的次数；黑线代表未用DDC处理的对照血小板的荧光，红线代表DDC染色的活化血小板。一旦活化，对照血小板的峰显示向更高荧光值强烈漂移，反映了DDC与这些细胞的明显的选择性结合。
图5：用DDC体内检测肝细胞程序死亡：
按照Ogasawara等的模型，通过抗Fas抗体的静脉内给药诱导小鼠肝细胞程序死亡(Nature，364：806-809，1993)。然后向抗Fas抗体处理的和对照未处理的动物注射DDC(70mg/kg)。两小时后，处死动物，取出肝脏，冷冻。然后制备低温切片，用于病理组织学分析，这是利用荧光显微镜检查法进行的(放大率X600)。(a)对照肝脏，(b)用抗Fas抗体处理的肝脏。箭头指向经历细胞程序死亡的肝细胞。
图6：用DDC体内检测肿瘤内细胞程序死亡的细胞，与TUNEL来自体内测定法对比：
向c57 black小鼠皮下注射D122(小细胞肺癌)细胞。肿瘤发育至2-3mm后，静脉内给以DDC(70mg/kg)。两小时后，切下肿瘤，冷冻。然后制备低温切片，利用荧光显微镜检查法(放大率X600)进行病理组织学分析。肉眼观察到单一细胞程序死亡的细胞是蓝绿色荧光的细胞——图6A。为了证明DDC与细胞结合与细胞程序死亡过程之间的联系，也制备了低温切片，用于来自体内的细胞程序死亡评价，使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP-生物素缺口端标记(TUNEL)染色，这是一种被普遍接受的用于检测特征性细胞程序死亡DNA裂解的方法。观察到DDC与肿瘤内经历细胞程序死亡的细胞特异性结合，与TUNEL染色对比——图6B。
图7：用NST750体内检测化疗法诱导的小肠上皮细胞程序死亡：
将Balb/c小鼠用紫杉醇(300mg/kg)与环磷酰胺(27mg/kg)的单一剂量组合处理。24小时后，向动物静脉内注射13mg/ml NST750。两小时后处死动物，对小肠组织进行荧光病理组织学分析。通过NST750检测，在化疗法治疗的小鼠小肠腺管中观察到单一细胞程序死亡的上皮细胞(A)，但是在没有化疗法的小鼠组织中则不然(B)。
实施例
实施例1：DDL与活化红细胞(RBC)的选择性结合
DDL与活化/损伤RBC的选择性结合是这样证明的，在Ca2+的存在下，用N-乙基马来酰亚胺(NEM)与钙离子载体A23187联合处理，活化新鲜的RBC(Kuypers A.等，1996，Blood，87：1179-1187)。通过检测膜结合后其固有的荧光强度，测量DDL的结合(激发波长360nm，发射波长530nm)。
将新鲜包装的红细胞用缓冲液A(143mM NaCl，2mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM NaH2PO4，Ph＝7.4)稀释至最初体积的0.1，在上述缓冲液中洗涤4次。然后将细胞再悬浮在缓冲液B(55mM NaCl，90mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM hepes，Ph＝7.4)中。使用如上制备的细胞作为完整红细胞对照。关于活化，将细胞用2mM CaCl2、5μM钙离子载体A23187与5mM NEM的组合处理。在37℃下培育15-60分钟。然后将细胞用含有0.1％BSA的缓冲液B洗涤两次，最后再悬浮在含有2mMCaCl2的缓冲液B中。加入DDL，最终浓度为1μM，通过FACS分析进行所结合的DDL评价。
如图1所示，对照RBC不显著结合DDL。相形之下，活化RBC表现明显的DDL结合，实际上大多数细胞漂移至更高的荧光值(图1)。
DDL因此表现与承受PNOM的RBC的选择性结合，在本例中PNOM是通过细胞活化诱导的。
实施例2：DDC与细胞程序死亡的细胞的选择性结合
使HeLa S3细胞(ATCC CCL-2.2)生长在Dulbecco氏改性Eagle氏培养基(DMEM)中，培养基补充有2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、12.5单位/ml制霉菌素或10％胎牛血清(FCS)。将细胞按5×106细胞/平板的密度接种在10cm3培养平板上，体积10ml，在诱导细胞程序死亡之前培育24小时。
细胞程序死亡是这样诱导的，在低血清含量培养基(2％FCS)的存在下，用多巴胺(500μM)处理18小时，多巴胺是确证无疑的细胞程序死亡引发物(Lou J.等，J.Biol.Chem.1998，273：3756-3764)。未处理的细胞充当对照，供养在没有多巴胺的生长培养基中。处理后，用细胞刮器收获细胞，穿过带有18G针头的注射器分离为单一的细胞，按106细胞/ml的密度再悬浮在pH＝7.4的PBS缓冲液中。
使培养物如上所述生长，用HBS(HEPES缓冲盐水：10mMHEPES，150mM NaCl，pH＝7.4)洗涤两次。通过检测膜结合后化合物的固有荧光强度，测量DDC的结合(激发波长360nm，发射波长530nm)。关于所述结合的测量，将细胞用TBS(Tris缓冲盐水：10mMTris，pH 7.4，150mM NaCl)洗涤两次。将DDC悬浮在pH＝7.4的0.1MNaPPi中，浓度1mM，然后将细胞用最终浓度100μM的DDC培育2-10分钟，总体积为50μL。然后对细胞进行荧光显微镜检查。利用Olympus荧光显微镜(IX70型，激发波长360nm，发射波长530nm)进行观察。
在用细胞程序死亡引发物处理的HeLa细胞培养中检测到单一细胞程序死亡的细胞的强烈荧光(图2B)。在细胞程序死亡培养物内被DDC染色的这部分细胞是很多的。相形之下，未处理的HeLa细胞培养物表现非常低的染色细胞部分，反映了培养物内天然存在的细胞死亡过程(图2A)。DDC通过其与PNOM膜的选择性结合，因此表现与培养物中经历细胞程序死亡的细胞的选择性结合。
实施例3：DDC与活化红细胞(RBC)的选择性结合；流式细胞测定分析
研究或证明了DDC与活化或损伤红细胞(RBC)和对照健康RBC的选择性结合。在Ca2+的存在下，用N-乙基马来酰亚胺(NEM)和钙离子载体联合处理，诱导完整RBC的活化(Kuypers A.等，1996，Blood，87，1179-1187)。
得到新鲜的RBC，用缓冲液A(143mM NaCl，2mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM NaH2PO4，Ph＝7.4)稀释至最初体积的0.1，在上述缓冲液中洗涤4次。然后将细胞再悬浮在缓冲液B(55mM NaCl，90mM KCl，0.1％葡萄糖，10mM Hepes，pH＝7.4)中。然后使用这些细胞作为对照细胞。关于活化，将细胞在37℃下用2mM CaCl2、5μM钙离子载体A23187与5mM NEM的组合处理15-60分钟。然后将细胞用含有0.1％牛血清白蛋白的缓冲液B洗涤两次，最后再悬浮在含有2mMCaCl2的缓冲液B中。关于DDC与细胞结合的检查，将DDC溶于0.1MNaPPi，pH＝7.4，储备浓度为1mM。在50μM的最终浓度下进行结合测定，通过流式细胞测定法评价结合的水平。
如图3所示，完整的红细胞基本上不被DDC染色。不过，作为RBC活化的结果，全体细胞群经历向更高荧光水平的实质性漂移，反映了DDC结合。因此，DDC表现与活化/损伤RBC的选择性结合。
实施例4：DDC与活化血小板的选择性结合
利用流式细胞测定(FACS)分析测定DDC与活化血小板的选择性结合。
从健康志愿者获取富含血小板的血浆。将109新鲜血小板离心(5分钟，380Xg)，洗涤，再悬浮在台罗德氏缓冲液(137mM NaCl，2.8mMKCl，1mM MgCl2，12mM NaHCO3，0.4mM Na2HPO4，5.5mM D-葡萄糖，10mM Hepes pH 7.4，0.35％BSA)中。将纯化后的血小板保存在冰上，充当对照。
关于活化，在2mM CaCl2的存在下，将200μl洗涤后的血小板用0.05单位/ml凝血酶与5μg/ml胶原的混合物在37℃下培育5分钟，最终体积为1ml。培育后，将血小板离心(2分钟，104rpm)，再悬浮在1ml台罗德氏缓冲液中。
将活化的和对照未处理的血小板用10μM DDC在室温下培育5分钟。然后使用Beckton-Dickinson细胞分类器和CellQuest软件，对血小板进行流式细胞测定(FACS)分析。在360nm下激发，在530nm下测量发射。图4A显示活化后结合DDC的血小板部分。仅有小部分对照血小板表现DDC的结合(占总体的3.6％)，而血小板活化导致血小板总体的81％获得明显的DDC结合，反映为清楚地漂移至更高荧光强度。如图4B的FACS直方图所示，活化作用与全体血小板主要向更高荧光强度漂移有关。DDC通过其对PNOM的检测，因此能够充当有效的药物，标志和区分活化的和未活化的血小板。
实施例5：体内DDC与细胞程序死亡的细胞的选择性结合
体内细胞程序死亡的细胞的选择性检测具有大量诊断性和治疗性临床应用。为了证明DDC在完成这项任务中的潜力，采用由抗Fas抗体静脉内给药诱导的体内肝细胞程序死亡的成熟模型(OgasawaraJ.，等，Nature 364：806-809，1993)。用抗Fas单克隆激动性抗体处理小鼠，诱导肝细胞的细胞程序死亡，引起动物在数小时内死亡。研究包括DDC向抗Fas抗体注射的小鼠以及对照未处理动物的静脉内给药。然后进行荧光病理组织学研究，以评价DDC结合的水平。
向五周龄雄性BALB/c小鼠静脉内注射10μg/动物的纯化仓鼠抗Fas单克隆抗体(Jo2，PharMingen，San Diego，CA)。然后向小鼠静脉内注射70mg/kg DDC。注射是在抗体处理后30分钟进行的。向对照动物仅注射DDC，没有抗体给药。在抗体给药后三小时处死全部动物，然后取出器官。将肝脏横向切片，穿过每叶中部，立即浸入液氮中，然后转移至-80℃下达24小时。然后将器官转移至OCT溶液中，制备低温切片(5μm)。对这些切片进行荧光显微镜检查。将平行切片用苏木精/曙红(H&E)染色，同时评价表现DDC结合的细胞的特征性细胞程序死亡形态学。
用DDC注射的对照动物肝切片不表现显著的荧光，也就是说观察到没有显著的DDC结合(图5A)。相形之下，在用抗Fas抗体处理的动物肝脏中观察到明显的、DDC与大量细胞程序死亡的细胞的特异性结合(图5B，箭头标示若干细胞程序死亡的细胞)。与H&E染色比较，确认了表现DDC结合的细胞的确具有特征性细胞程序死亡形态学。
这些实验因此证明DDC在全身给药后体内检测和选择性结合细胞程序死亡的细胞的潜力。
实施例6：用DDC体内检测肿瘤内细胞程序死亡的细胞
原发性肿瘤的特征之一是存在肿瘤细胞的细胞程序死亡，同时存在瘤性细胞的增殖。现已清楚，原发性肿瘤内增殖与细胞程序死亡之间的净平衡是重要的预后因素和转移瘤的预示(Naresh，K.Y.，等，Cancer，91：578-594，2001)。非常普遍的细胞程序死亡的细胞与更加恶性的肿瘤和更差的预后有关。因此，用以体内评价肿瘤内细胞程序死亡负荷的非侵入性诊断与预测工具在临床肿瘤学中具有潜在的重要的应用。
DDC因此用于检测肿瘤内细胞程序死亡的细胞。通过皮下注射0.5×106细胞/动物的D122肿瘤细胞，在12周龄c57 black小鼠中诱发Lewis肺癌(3LL)的原发性肿瘤。如Eisenbach L，等供养肿瘤细胞系(Int.J.Cancer，34.：567-573，1984)。注射后两周，当观察到2-3mm的肿瘤时，向动物静脉内注射70mg/kg DDC。两小时后取出肿瘤，迅速冷冻在液氮中。然后制备低温切片，利用荧光显微镜进行病理组织学分析(放大率X600)。
图6A证明了DDC在全身给药后体内检测肿瘤内细胞程序死亡的细胞的能力。这类检测允许计算肿瘤的细胞程序死亡指数(AI)。为了证明利用DDC实现的这种指数的确反映肿瘤内的细胞程序死亡负荷，使用TUNEL进行平行染色，这是一种被充分接受的用于检测特征性细胞程序死亡核小体间DNA裂解的方法(图6B)。利用这两种检测方法，可以在肿瘤内观察到相似数量的细胞程序死亡的细胞。DDC因此能够体内检测肿瘤内的细胞程序死亡负荷。它在全身静脉内给药后体内测量肿瘤AI的灵敏性类似于TUNEL操作对来自体内的组织切片的直接鉴定。
实施例7：NST750检测化疗法诱导的小肠上皮细胞程序死亡
在对癌症患者施用化疗法期间经常观察到胃肠损伤。具体而言，小肠腺管表现上皮细胞程序死亡，是对化疗法和辐射的早期反应(Keefe，D.M.K.，等，Gut，47：632-637，2000)。因此评价了NST750化合物体内检测用单一剂量化疗法处理的健康小鼠小肠细胞程序死亡过程的能力。
向12周龄Balb/c小鼠或瑞士小鼠静脉内给以紫杉醇(300mg/kg)与环磷酰胺(27mg/kg)的单一剂量组合。不接受化疗法的动物充当对照。24小时后，向全部动物静脉内注射13mg/kg的NST750。两小时后处死动物，将小肠冷冻，制备低温切片，用于荧光显微镜检查。
在化疗法处理的小鼠小肠腺管中检测到强烈结合NST750的大量细胞程序死亡的细胞(图7A)。相形之下，在对照未处理的动物中观察到没有显著的NST750染色(图7B)。NST750因此表现对化疗法诱导的小肠上皮细胞程序死亡的选择性结合和检测。这为这种化疗副作用的早期与灵敏监测提供了工具(单一剂量抗癌治疗后仅24小时)。NST750的这种活性因此可以在抗癌治疗的优化中具有重要的临床应用。
实施例8：NST750的合成
按照下列流程合成NST750：
在二异丙基乙胺(DIPEA)的存在下，使L-天冬酰胺与苄酯基(Z)氯反应，收率63％。将Z-保护的天冬酰胺2(50g)在500mL二甲基甲酰胺(DMF)/100mL水混合物中冷却至0℃，一次性用85g双-三氟乙酰氧基碘苯处理。在0℃下搅拌10分钟后，历时15分钟向反应滴加31mL吡啶。将溶液在RT下搅拌过夜。在45℃真空中浓缩反应，将所得油溶于500mL水与200mL乙醇的混合物。用吡啶调节溶液的pH至5.0，通过真空过滤收集所得大量沉淀。将固体用200mL二氯甲烷洗涤，在40℃真空中干燥，得到3(31g)，收率70％。将Z-保护的衍生物3(31g)转化为中间体4，收率80％。类似地，在二氮杂二环十一碳烯(BDU)的存在下应用碘代甲烷，几乎定量地得到甲基酯5。通过氢化作用除去Z-保护基团后得到2-氨基-4-Boc氨基甲基丁酸酯(6)。
在氮下，向预形成的甲醇与乙酰氯的溶液加入异丝氨酸11。回流2小时后，判断反应完全。将反应混合物浓缩至干，将所得油溶于甲醇/二噁烷混合物，用DIPEA处理，然后加入丁氧羰基(Boc)-酸酐。通常的操作后，粗反应混合物经过快速柱色谱纯化，使用30％EtOAc/庚烷作为洗脱剂，得到13，收率95％。然后使用Dess Martin试剂氧化化合物13，得到2-酮基-4-Boc氨基甲基丁酸酯7a，收率60％。
在1.3-1.5当量胺6、乙酸和硫酸镁的存在下，在40℃下进行酮基酯7a的还原性偶联。随后氢化(披钯碳，50psi，12小时)，得到8，为非对映体的混合物(收率53％)。
化合物8(0.25g)是非对映体的混合物，在RT下使用2N NaOH的二噁烷溶液水解甲基酯达2小时。将反应混合物进一步浓缩至干，得到0.4g白色固体。将对应的固体悬浮在6mL二噁烷中，用5mL 2MHCl/乙醚溶液处理。然后浓缩反应，将残余物溶于水/二噁烷，用DIPEA调节pH至9.2。将所得溶液用丹磺酰氯(2eq.)溶液处理，同时保持反应的pH在9.2左右。完成后，将反应用水(10mL)稀释，用乙醚洗涤。弃去醚层，含水层用乙酸乙酯回收，用2M HCl酸化至pH 4.0。将有机层用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥。浓缩至干后，分离到160mg亮黄色固体。使固体从甲醇/乙醚混合物中结晶，得到100mg黄色固体亚氨基-双2-(3-丹磺酰氨基)-丙酸(NST750)。 1H NMR(300MHz，CD3OD)，δ8.58(bm，2H)，8.4-8.2(b，4H)，7.6(b，4H)，7.25(b，2H)3.5-3.0(b，4H)，2.9(s，12H)，1.4(m，2H).MS(ESI)658.2(M+H).
实施例9：NST740的合成
按照下列流程合成NST740：
使用双-三氟乙酰氧基碘苯，将苄酯基(cbz)-D-天冬酰胺1转化为2-cbz保护的2，3-二氨基丙酸2，收率非常良好。使2(7.2g)在乙酰氯与甲醇的溶液中回流，得到定量收率的甲基酯盐酸盐。将该盐进一步悬浮在无水二氯甲烷中，用2.5当量三乙胺处理。一旦得到澄清溶液，将所得溶液用丹磺酰氯溶液处理。在RT下搅拌过夜后，反应完全。将反应混合物用100mL二氯甲烷(DCM)稀释，连续用含水饱和碳酸氢钠(2×100mL)、水(100mL)和盐水洗涤。将所得有机溶液干燥(MgSO4)，浓缩至干。所得油经过硅胶色谱纯化(10％EtOAc/CHCl3)，得到3，收率72％。将一部分该原料(3.5g)在四氢呋喃(THF)/MeOH混合物中水解，普通的操作后得到3.4g的4，为亮黄色固体。同时，将5.6g的3除去氨基甲酸苄基酯，得到氨基酯5，收率良好。将4(0.5g)用1当量二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)处理5小时，导致完全转化为所需的NHS酯，收率83％。将该酯进一步溶于无水THF，用等摩尔量5处理。6小时后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用饱和NH4Cl洗涤，除去NHS副产物。有机层进一步经硫酸镁干燥，浓缩至干，得到0.8g二肽6，收率77％，HPLC分析纯度＞95％。随后在氢氧化钠的二噁烷溶液中水解甲基酯，以通常的方式(H2/Pd)除去苄酯基保护基团，得到2-(3-丹磺酰氨基-2-氨基丙酰氨基)-3-丹磺酰氨基丙酸(NST740)。1H NMR(300MHz，CD3OD)，δ8.53(dd，2H，J＝8.5，8.6 Hz)，8.34(d，J＝8.67 Hz，1H)，8.24(dd，J＝8.6，7.3 Hz，2H)，8.12(d，7.32 Hz，1H)，7.5(m，4H)，7.26(d，J＝7.56 Hz，1H)，7.19(d，J＝6.98 Hz，1H)，4.18(t，J＝4.34 Hz，1H)，3.65(t，J＝3.45 Hz，1H)，3.2(m，4H)，2.85(s，12H).MS(ESI)657.16(M+H).
实施例10：NST751的合成
按照下列流程合成NST751：
在甲苯中回流4-环己烯-1，2-二羧酸酐1(30g)与催化量的硫酸以及10当量异丙醇。在回流下搅拌6小时后，分离到30g二异丙基-4-环己烯-1，2-琥珀酸酯2。将化合物2(7g)用四氧化锇、再用乙酸铅进行氧化性裂解。普通的操作之后，得到7g二异丙基双-1，2-(2-乙醛)间琥珀酸酯3，直接用于下一步。将化合物3(6.8g)溶于乙醇，用1当量硼氢化钠处理。在0℃下搅拌1小时后，反应完全(Rf 30.4，Rf 40.1∶40％EtOAc/庚烷)，小心地加入1M HCl猝灭反应。在真空中除去有机层，含水层用乙酸乙酯萃取。经硫酸镁干燥和在真空中浓缩后，得到二异丙基双-1，2-(2-乙醇)间琥珀酸酯4(6.8g)，收率90％。1H NMR 1.3 ppm(14H，异丙基酯)，3.6ppm(4H，羟甲基)
将二醇4(6.8g)溶于无水二氯甲烷，用3当量三乙胺处理，然后在0℃下缓慢加入2当量甲磺酰氯达两小时。加入饱和氯化铵溶液猝灭反应混合物，收集有机层，用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤。浓缩滤液至干，然后硅胶色谱纯化，得到二异丙基双-1，2-(2-甲磺酰基乙基)间琥珀酸酯5(4g)，收率55％。
在40℃下，将双甲磺酸酯5用叠氮化钠的二甲基甲酰胺(DMF)溶液处理3小时。通常的操作之后，分离到二异丙基双-1，2-(2-叠氮乙基)间琥珀酸酯6，收率93％。将化合物6(2.1g)溶于乙醇/水(3∶1)混合物，在30℃下用氢氧化钠(2eq)处理过夜。将反应用水稀释，在真空中除去大量乙醇，含水层用乙醚洗涤。将含水层用乙酸乙酯(100mL)回收，用3M HCl酸化至pH 2.5。在真空中浓缩后，得到1.5g二元酸。将所得叠氮基酸溶于乙醇/2M NaOH(10∶1)混合物，在50psi氢下经过披钯碳氢化两小时。完全转化为二胺，反应混合物经C盐过滤，浓缩滤液至干，得到1.5g粘性固体，随后与丹磺酰氯反应，得到双-1，2-(丹磺酰基-3-氨基乙基)间琥珀酸(NST751)。 1H NMR(300 MHz，CD3OD)，δ8.50(d，J＝8.6 Hz，2H)，8.35(d，J＝8.8 Hz，2H)，8.15(t，J＝4.5 Hz，2H)，7.51(m，4H)，7.19(d，J＝8.3 Hz，2H)，2.87(s，12H)，2.75(m，4H)，2.3(m，1H)，2.2(m，1H)，1.5(m，2H)，1.29(m，2H).MS(ESI)671.0(M+H).