治疗变态反应性疾病的联合菌苗及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及含有细菌的医药配置品，具体是一种治疗变态反应性疾病的联合菌苗及其制备方法。
技术背景
变态反应性疾病多见于皮肤科、呼吸内科、和耳鼻喉科。临床表现为异位性皮炎、湿疹、过敏性鼻炎和哮喘等多种疾病，约占各科门诊量的20-50％之多。现代免疫医学认为变态反应性疾病发病的主要机制是：遗传因素为背景的、外来抗原诱发的、Th2细胞介导的I-VI性变态反应。临床上治疗方法很多，基本上以抗组织胺药物治疗为主，至于针对外来抗原的脱敏治疗，由于过敏原寻找困难和特异性抗原制备的限制，使临床使用乏见。
国外文献报道鼻疽菌素的免疫可以诱导混合性的Th1/Th2型的细胞因子的释放，提示细菌毒素的免疫可以起到调节Th1/Th2型细胞免疫平衡的目地。或者说，无关的抗原可以诱导目的抗原之外的免疫应答类型。从这个意义上讲，多价的或联合的菌苗免疫可以使机体的免疫应答趋向平衡。国外Ruah等曾用7种呼吸道常见致病菌的混合成份LW50020防止上呼吸道感染。Ander指出联合的多价菌苗能有效调动机体自身的免疫调节机制，因有可能降低变态反应性疾病的发生。
目前对菌苗的研究仅限于感染性疾病的防治，如中国医药科技出版社1977年出版“现代药物学”、836、839页介绍的伤寒菌苗，吸附霍乱菌苗等单一菌苗，而伤寒、副伤寒甲乙菌苗则为混合菌苗等；目前使用中的“白、百、破”是一种吸附百日咳菌苗和百喉、破伤风类毒素的混合制剂。但很少有对变态反应性疾病使用菌苗进行防治的报道。
中国专利1297741公开了一种“葡萄球菌菌苗注射液及制备方法”，是由金黄色葡萄球菌混合液、表皮葡萄球菌混合液以1∶1比例组成，对治疗痤疮、毛囊炎效果显著。
由美国蛋白表达公司在中国的专利申请1278735公开了“用于泌尿生殖系统感染的阴道栓剂菌苗”，器菌苗来源于培养的8-14种尿路病原菌菌株，如大肠杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、奇异变形杆菌、摩根氏变形杆菌，和粪链球菌等。
【发明内容】
本发明就是为了解决变态反应性疾病的防治方法中，利用菌苗有效调动机体自身的免疫调节机制，降低变态反应性疾病的发生，因而提供一种治疗变态反应性疾病的联合菌苗及其制备方法。
本发明是按以下技术方案实现的。
一种治疗变态反应性疾病的联合菌苗，其特征在于该菌苗是由肺炎双球菌、甲型溶血型链球菌、乙型溶血型链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、卡他萘瑟氏菌、流感嗜血杆菌，铜绿甲单胞菌、变形杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷白杆菌、白色念珠菌的灭活菌液按1∶1的比例制备而成。
所述的联合菌液，总菌数量浓度为1亿个/ml
一种治疗变态反应性疾病的联合菌苗的制备方法：
以下标准菌株各一支分别用0.5ml灭菌生理盐水溶解后，金黄色葡萄球菌、表葡萄球菌、铜绿甲单胞菌、变形杆菌、卡他萘瑟氏菌、肺炎克雷白杆菌接种于普通培养基中，甲型溶血型链球菌、乙型溶血型链球菌、接种于新鲜血培养基中，大肠埃希氏菌接种于SS培养基中，白色念珠菌接种于沙伯弱氏培养基中，流感杆菌接种于巧克力培养基中；肺炎双球菌接种于新鲜血肉汤培养基中，常规分区划线培养；
依形态染色及生化反应，标化确定菌种，获得纯培养；
将各种分化的菌株接种传代，每种接种10-20个相应培养集中，大量增菌；
刮取菌株，用酚盐水稀释溶解成菌液，收集各种菌液共12瓶，55-60℃，30-60分钟灭活，分别用磷酸盐缓冲生理盐水洗后，离心沉降；去脂，超声粉碎，质量检测；
灭活后的菌液各取0.1ml再次接种于相应的培基中，观察灭活效果；
将各种分化的菌株接种传代，大量增菌，若无细菌生长，则用无菌的酚盐水稀释菌液，以麦氏比浊法定量，用时将十二种菌苗按1∶1的比例均匀混和，配成总菌数量1亿个/ml的浓度。
所述的酚盐水为0.5％重蒸酚和0.9％生理盐水组成。
所述的去脂方法是菌苗分别用磷酸盐缓冲生理盐水洗3-5遍之后加入100％甲醇，搅拌1-2小时，离心沉降去脂。
这样制备的治疗变态反应性疾病的联合菌苗，为变态反应性疾病患者提供了一种新的治疗方法。在临床和病例确诊的变态反应性疾病患者358人，经取得满意的疗效；而且，治疗期间没有发现任何毒副反应，收到患者的欢迎。
【具体实施方式】
自国家菌种保藏中心购买肺炎双球菌，甲型溶血型链球菌，乙型溶血型链球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，卡他萘瑟氏菌，流感嗜血杆菌，铜绿甲单胞菌，变形杆菌，大肠埃希氏菌，肺炎克雷白杆菌，白色念珠菌的标准菌株各2支。
取其中各1支用0.5ml灭菌生理盐水溶解，分别接种于相应培养基中，常规分区划线培养，37℃培养24-48小时。其中：金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，铜绿甲单胞菌，变形杆菌，卡他萘瑟氏菌，肺炎克雷白杆菌接种于普通培基中；甲型溶血型链球菌，乙型溶血型链球菌，接种于新鲜血培基中；大肠埃希氏菌接种于SS培养基中；白色念珠菌接种于沙伯弱氏培养基中；流感杆菌接种于巧克力培养基中；肺炎双球菌接种于新鲜血肉汤培基中。
鉴定菌株，依形态染色及生化反应，标化确定菌种，以获得纯培养。
将各种分化的菌株接种传代：每种接种10-20个上述相应培养基中。进行大量增菌。培基条件为37℃，24-48小时。
当菌落生长最旺盛时刮取菌苔，即在每个培基中注入1ml酚盐水，稀释溶解成菌液，再将相同10个培基中的菌液集中在1个无菌瓶内，采用100ml容量、具塞、可高压消毒的无菌瓶，内含无菌玻璃珠若干个以防止细菌蛋白凝聚。全部操作在净化间内进行，严格遵守消毒隔离规程。酚盐水为0.5％重蒸酚和0.9％生理盐水组成。
收集各种菌液共12瓶，置60℃水浴中60分钟灭活，其间不断摇动瓶内玻璃珠，以防凝固。
十二种菌苗分别用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗3-5遍之后，离心沉降；加入100％甲醇，搅拌2小时，离心沉降去脂，超声粉碎，质量检测。
将灭活后的菌液各用1ml注射器取0.1m接种于以上步骤所述相应的培基中，观察灭活效果，置37℃，24小时。
若无细菌生长，则稀释各种菌液，用无菌的酚盐水稀释菌液，以麦氏比浊法定量。各种细菌分别稀释两种浓度10亿/ml、1亿/ml各一瓶，作为储存液置4℃冰箱保藏。用时将十二种菌苗按1∶1的比例均匀混和，配成总菌数量1亿个/ml的浓度。
动物毒性实验：用体重18-20g纯种小白鼠C3H、615或C57BL，试验及对照组各10只，雌雄各半。试验组每只小白鼠腹腔注射菌液0.5ml(1亿/ml)，对照组注射同量生理盐水，观察1周，到期称总体重，不得较试验前减轻或死亡。
动物实验合格后，制备应用液：取1亿/ml菌液12种，各取0.1ml混合用酚盐水稀释100ml，呈10万/ml浓度混合菌液。取10万/ml浓度1ml用用酚盐水稀释100ml，呈1000/ml浓度的混合菌液，即应用菌液。准备1ml安瓿160℃高温干燥灭菌。将应用液在无菌条件下，分装于1ml安瓿中，0.5ml/支，即成注射用品。
将分装好的安瓿全部置37℃培养箱中24小时，取出逐支检验外观：清晰度、杂质、装量。
合格后印制标签：品名、批号、容量。
适应症：主要应用于过敏性疾病的治疗，过敏性鼻炎，过敏性结膜炎，各种支气管炎及哮喘，以及药物引起的耳聋等症。
剂量及用法：
首次使用，每周两次，每次0.2ml，皮下注射(三角肌)，两周后剂量增加为每次0.5ml，每周两次，三个月为一疗程，也可以延长使用。
副作用：注射部位常有肿痛、硬结，持续约两周，有时出现不定期性发热。腔注射或有一过性反应加重及发热，可对症处理。
注意事项：
1.发热38℃以上，重症心血管病人，肝、肾功能异常者禁用。
2.治疗前后，宜作血、尿常规及免疫指标等检查，出现常规及免疫指标持续下降者停用，注射后当日勿过度疲劳。
3.用前须充分摇匀，有摇不散凝块时勿用。
保存：保存于2-8℃阴暗处。
本院变态反应科应用本发明治疗变态反应性疾病情况如下。
病种选择：湿疹、异位性皮炎、哮喘、和过敏性鼻炎。
临床资料：临床和病例确诊的变态反应性疾病患者358人，其中湿疹患者128例，异位性皮炎患者68例，哮喘患者60例，过敏性鼻炎患者102例；各病种随即分为两组，即常规治疗组和常规治疗+菌苗注射组。
药物来源：本院变态反应科按上述方法制备的本发明菌苗。
疗 程：临床观察和判断时间分别为4周、8周和12周。
湿疹、异位性皮炎的疗效判断标准：
瘙痒0-7分；苔藓样变0-3分；皮肤损害范围0-4分；
皮损范围按烧伤面积估计方法，1分≥1％；2分≥2％；3分≥3％；4分≥4％。
评分后依据治疗前后的分数下降70％以上为显效；下
降30-70％为有效；下降30％以下为无效。
变应性鼻炎、和哮喘的疗效判断标准：
临床痊愈：无需任何药物，无症状、无体征1年以上；
显效：偶有发病但症状、体征很快缓解；
有效：经治疗症状和体症有好转，但长须药物治疗；
无效：治疗前后症状无明显改善。
治疗结果：联合菌苗的临床治愈率要明显高于常规组，见表1-
4；目前这种治疗的长期效果正在观察中。
毒副反应：治疗期间没有发现任何毒副反应，包括发热、局部
结节形成和血、尿常规的改变。
表1 湿疹组治疗8周后治疗组与对照组疗效比较
组别 例数 治愈 显效或有效 无效 临床治愈率
常规+菌苗 64 58 4 2 90.6％
常规组 64 46 12 6 71.8％
临床治愈率比较，常规+菌苗vs常规组，P＜0.05
表2 异位性皮炎治疗8周后治疗组与对照组疗效比较
组别 例数 治愈 显效或有效 无效 临床治愈率
常规+菌苗 34 20 12 2 58.8％
常规组 34 12 16 6 35.3％
临床治愈率比较，常规+菌苗vs常规组，P＜0.05
表3 过敏性鼻炎组治疗8周后治疗组与对照组疗效比较
组别 例数 显效 有效 无效 临床治愈率
常规+菌苗 50 48 2 0 96.0％
常规组 52 40 12 0 76.9％
临床显效率比较，常规+菌苗vs常规组，P＜0.05
表4 哮喘组治疗8周后治疗组与对照组疗效比较
组别 例数 显效 有效 无效 临床治愈率
常规+菌苗 36 34 2 0 94.4％
常规组 24 14 8 2 58.3％
临床显效率比较，常规+菌苗vs常规组，P＜0.05