5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基- β-D-葡萄糖醛酸在制药中的应用 技术领域：本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及一种5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸在制备抗艾滋病药物中的应用以及5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸在制备逆转录酶抑制剂药物中的应用。
背景技术：艾滋病(Acquired Immuno-deficiency Syndrome，AIDS，获得性免疫缺损综合症，简称艾滋病)是当今世界主要威胁人类健康的不可根治的致死疾病之一。导致艾滋病的病原体即人类免疫缺损病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，1983年获得分离确证，有两种亚型HIV-1和HIV-2，若干变异株。HIV繁殖过程大致可分九个步骤：吸附、穿入、脱壳、早期蛋白合成、病毒基因组核酸的复制、晚期蛋白合成、核壳体装配、病毒体成熟、释放等。从理论上说，上述过程中的每一个步骤都能作为筛选抗HIV药物的靶点。并且每一步骤都发现了许多相应的抑制剂，不同类型的化合物被相继研究和用于抗艾滋病病毒。然而其中病毒基因组核酸的复制和蛋白质的合成是HIV繁殖最关键的步骤，且需要有某些特异性酶的参与，故抗HIV药物的研制的热点主要集中于寻找这些特异性酶的抑制剂方面，包括逆转录酶(RT)抑制剂(它抑制HIV从mRNA转录DNA)，蛋白质合成酶抑制剂，逆转录启动因子(TAT)抑制剂等。全世界已对约20000个化合物进行了抗HIV的研究，目前已成功地研制出了系列抗逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂抗HIV药物。如逆转录酶抑制剂(AZT，DDC，DDI，D4T，3TC，Nevirapine，Delavirdine，Efavinavir)和蛋白酶抑制剂药物(Sequanavir，Ritonavir，Indinavir，Nelfinavir，Amprenavir)虽然被批准用于临床，客观上延长了艾滋病患者的生命，但同时又带了严重的毒副作用如骨髓抑制和健忘等以及导致抗病毒株的出现。因而临床上急需研制出具有不同化学结构和作用机理地新类型抗HIV病毒的新药物。从中草药中发现天然抗HIV活性化合物或先导物---是目前国内外研究的重要方面和非常活跃的领域。至今发现100多种天然化合物具有HIV活性，分属于倍半萜、二萜、三萜、甾体、黄酮、香豆素、肽类、生物碱，多糖，天花粉蛋白等，其中活性较强的如：甘草甜素，金丝桃素，姜黄素，大豆皂甙，喜树碱，栗精胺，香菇多糖，天花粉蛋白等。
迄今，现有技术中没有含有式(I)化合物灯盏乙素(野黄芩苷，Scutellarin)作为有效成分在治疗艾滋病方面的报道，也没有该化合物在制备逆转录酶抑制剂药物中的应用和在制备抗艾滋病药物中的应用的报道。
发明内容：本发明的目的在于提供化合物5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸在制备抗艾滋病药物中和在制备逆转录酶抑制剂药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸在制备抗艾滋病药物中的应用以及5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸在制备逆转录酶抑制剂药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用本发明的式(I)化合物5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸及其与药用载体或赋形剂组成的药物组合物的药理作用结果来说明本发明的实质，但本发明的内容并不局限于此。
1.5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸对重组HIV-1 RT(逆转录酶)的抑制实验
(1)实验方法
HIV逆转录酶(Reverse Transcriptase，RT)测定，非放射性(non-radioactive)试剂盒购自Roche公司。取出试剂盒中反应条，每孔滴加20μl HIV-1RT溶液，14μl裂解缓冲液，6μl溶于DMSO的化合物，20μl含模板和核苷酸的反应缓冲液。使化合物的终浓度为200μg/ml。设置Foscamet阳性对照孔和不含化合物的阴性对照孔。置37℃1小时。洗涤5次后，每孔加入200μl抗DIG-POD抗体工作液。37℃温育1小时，洗涤5次。每孔滴加200μl ABTS底物反应液。室温反应15-30分钟，Bio-Tek Elx800酶标仪测定OD值(405/490nm)。计算化合物对RT的抑制率。
(2)结果
5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸浓度为200μg/ml时，计算得5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸对RT的抑制率为48％。
2.5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制实验
(1)实验方法
将6×105/ml C8166细胞50ul与100μl不同浓度的化合物溶液混合，加入50μl HIV-1稀释上清，M.O.I.为0.0089，同时设置不含化合物的对照孔和阳性药物AZT对照孔，37℃，5％CO2培养三天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体(五个视野)。计算化合物的EC50(50％Effective Concentration)，即化合物抑制50％合胞体形成的浓度。
(2)结果(见说明书附图1)
μg/ml 0.32 1.60 8 40 200 EC50
抑制率％ -2.83 2.69 15.80 100 100 15.38μg/ml
3.5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸的细胞毒性实验
(1)实验方法
3×105/ml C8166细胞悬液100ul与100ul不同浓度的化合物溶液混合，同时设置不含化合物的对照孔和阳性药物AZT对照孔，37℃，5％CO2培养三天，MTT法检测细胞存活率。595nm/630nm ELx800ELISA Reader测定OD值。计算化合物对细胞的CC50(50％Cytotoxic Concentration)，即引起50％细胞死亡的化合物浓度。
(2)结果(见说明书附图1)
μg/ml 0.32 1.60 8 40 200 CC50
死亡率％ 7.85 6.35 12.59 22.00 91.67 75.38μg/ml
4、5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸对HIV的治疗指数(Selective Index，SI)
SI＝CC50÷EC50＝76.38μg/ml÷15.38μg/ml＝5
从上述实验结果可以证实：本发明的5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸对重组HIV-1RT具有抑制作用，对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体具有抑制作用，它用于与逆转录酶有关的疾病如艾滋病等。
附图说明：图1是5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制活性数据图；
图2是5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸的细胞毒性测定图；
图3是5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸的结构示意图。
具体实施方式：下面结合实施例进一步对本发明实质内容进行说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：
5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸提取分离
采集滇黄芩全株，其学名经鉴定为Scutellaria amoena C.H.Wripht.室温阴干，粉碎。取500克干粉，用80％乙醇回流提取2次，每次3小时，合并醇提液，减压回收得乙醇得浸膏。该浸膏用乙醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干，研粉，经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇-水(8∶2∶0.2-6.5∶3.5∶0.5)洗脱，TLC F254硅胶薄板指导分离并检测各流份，相同流份合并，第18-28流份合并，乙醇重结晶2次，得黄色小针晶化合物5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸0.6克(得率0.52％)。经TLC硅胶F254薄板检测与对照品灯盏花乙素，Rf值相同。灯盏乙素(野黄芩苷，Scutellarin)结构数据
熔点用四川大学科仪厂的显微熔点测定仪XRC-1型测定；紫外光谱(UV)用UV-210A仪测定，红外光谱(IR)用Bio-Rad FTS-135型分光光度计测定，KBr压片。质谱(MS)用Auto SPEC 3000型质谱仪测定，采用FAB(副)技术。核磁共振谱(1H NMR和13C NMR)用Bruker WH-400超导核磁共振仪测定，TMS作内标，C5D5N作溶剂。青海洋化工厂出品的200-300目硅胶作为柱层析材料；薄层层析用青海化工厂出品的硅胶板指导分离。展开剂：A：氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.3v/v)；B：正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5，上层)；显色剂：A、5％AlCl3-EtOH。
结构：如图3所示
分子式：C21H18NO12
分子量：462
性状：黄色小针晶(乙醇)
[α]D25：-116°(c 0.586，吡啶)
UVmaxEtOH nm：283，335.
IRνmax KBr cm-1：3391(OH)，1733，1717，1652，1608，1575，1506，1500，1361，1248，1183。
FAB-MS(-)m/z：463(M+1)，462(M)，461(M-1)-，285(M-177)-。
1H NMR(C5D5N)：4.72(1H，t，J＝9.1Hz)，4.59(1H，t，J＝9.1Hz)，4.51(1H，t，J＝7.8Hz)，5.06(1H，d，J＝9.0Hz，H-5″)，6.20(1H，d，J＝6.8Hz，H-1″)，6.90(1H，s，H-8)，7.20(2H，br.d，J＝8.1Hz，H-3′，5′)，7.56(1H，s)，7.82(2H，br.d，J＝8.1Hz，2′，6′)。
13C NMR(C5D5N)6：163.1(C-2)，103.8(C-3)，173.0(C-4)，149.1(C-5)，133.5(C-6)，165.4(C-7)，95.9(C-8)，153.0(C-9)，107.7(C-10)，122.8(C-1′)，129.4(C-2′，6′)，117.3(C-3′，5′)，163.1(C-4′)，102.8(C-1″)，75.1(C-2″)，78.2(C-3″)，73.7(C-4″)，78.4(C-5″)，183.8(C-6″)。
实施例2：
按实施例1的方法先制得5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例3：
按实施例1的方法先制得5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例4：
将所分离得到的5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例5：
按实施例1的方法先制得5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例6：
按实施例1的方法先制得5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸，按常规口服液制法制成口服液。
实施例7：
按实施例1的方法先制得5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
实施例8：
按实施例1的方法先制得5，6-二羟基-2-(4-羟苯基)-4-酮-4H-1-苯并吡喃基-7-羟基-β-D-葡萄糖醛酸，按其与赋形剂重量比为3∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊。