防止辐射伤害的方法与组成物.pdf

本发明描述的方法是使用一精氨酸降解剂如精氨酸酶及相关衍生物，其能够降低生理上精氨酸的浓度，作为辐射保护剂去保护正常哺乳类动物细胞免受因电离辐射而起的DNA损害。经过本发明处理后，接受放射治疗的癌病人的正常组织能得到保护，本发明亦保护免受暴露于辐射散发性装置或职业上与环境上的电离辐射所带来的有害效果。

权利要求书
1.  一种保护正常细胞免受DNA损害的方法，所述方法是给予病人一段特定时间的有效剂量的精氨酸降解剂。

2.  如权利要求1所述的方法，所述DNA损害是放射治疗引起。

3.  如权利要求2所述的方法，所述放射治疗是用以治疗人类肿瘤。

4.  如权利要求1所述的方法，所述DNA损害是因肮脏弹或其它环境上的电离辐射引起。

5.  如权利要求1所述的方法，所述精氨酸降解剂是人类精氨酸酶I，人类精氨酸酶II或精氨酸脱亚氨酶。

6.  如权利要求1所述的方法，所述给予所述精氨酸降解剂是在放射治疗之前与/或放射治疗当中。

7.  一种保护正常细胞在放射治疗中免受DNA损害的方法，其包含以下连续的或同时进行的步骤：
a)给予一精氨酸降解剂；及
b)给予所述放射治疗。

8.  一种治疗人类肿瘤的方法，其包含步骤：
a)给予一段特定时间一有效剂量的精氨酸降解剂；及
b)给予放射治疗以治疗肿瘤。

9.  任何一种如权利要求1，7或8的方法，所述精氨酸降解剂是有血清半衰期最少三日的重组人类精氨酸酶I或II。

10.  使用精氨酸酶制造保护正常细胞免受DNA损害的药品。

11.  如权利要求10的使用，所述DNA损害是放射治疗引起。

12.  如权利要求11的使用，所述放射治疗是用以治疗人类肿瘤。

13.  如权利要求10的使用，所述DNA损害是因肮脏弹或其它环境上的电离辐射引起。

14.  使用精氨酸酶制造与放射治疗结合用以治疗肿瘤的药品。

15.  如权利要求10与14的使用，所述精氨酸酶是有血清半衰期最少三日的重组人类精氨酸酶I或II。

说明书防止辐射伤害的方法与组成物
技术领域
本发明涉及使用精氨酸酶与其它精氨酸降解剂予以保护正常细胞免受辐射伤害，特别是减少治疗肿瘤的放射治疗期间或之后的症状。
发明背景
放射治疗是使用高能量射线或粒子杀死癌细胞。放射治疗的功效是因为放射治疗的游离辐射破坏癌细胞的复制能力。病人可以只接受放射治疗，或与其它治疗癌症的方式如化疗与/或手术结合使用。
放射治疗破坏围绕肿瘤的正常组织，进而引致许多不必要的副作用。这些副作用对治疗食道癌，头颈癌，肺癌和直肠癌的放射治疗尤为深刻，因为大量伴随肿瘤附近的组织也一并破坏。在许多情况下，放射治疗的副作用都在开始疗程后大约两星期变得显然易见，如当黏膜炎(口腔或肠道黏膜发炎)，失去味觉，口干与皮肤出现反应这些症状开始出现时。黏膜炎是其中主要一种令病人觉得放射治疗难以忍受的副作用。病人通常因为不能吞咽和接受流体而体重会下降。在一些极端的例子中，病人可能需要插入胃造口喉去维持足够的营养。吞咽肌肉痿缩和永久性吞咽问题也是后期后遗症的危机。
很多时候尽管癌症已经治愈，但因治疗所引致的口干已经成为永久残疾。在放射治疗直肠肿瘤中的副作用如肠道炎和直肠炎会引起可以是急性或慢性的腹泻与出血。以上两种皆极难治疗。
发明概述
基于上述背景，本发明目的是为正常细胞提供在放射治疗中的保护，从而减少放射治疗对周边正常组织的有害作用。
辐射破坏正常组织的机制是将细胞的原子游离化。所述破坏更明确地是针对用来储存遗传物质或DNA的细胞核。放射治疗的游离辐射诱发DNA的损坏。若受辐射损坏的细胞需要进行一种功能，它必需要时间在进行特定功能前去修补本身。如所述修补不能完成，受辐射损坏的细胞可能死亡。细胞在DNA合成期(S Phase)开始合成DNA，期间染色体会被复制。辐射对DNA的破坏通常在S Phase时发生。受辐射损坏的细胞很容易在G1间隙期与G0间隙期(G1与G0 phase)时修补。在细胞周期中，G1与G0 phase有两个检查点。它们捍卫基因稳定性与确保DNA的稳定性和功能上的整体性。如DNA在前一次分裂时受到损坏，这两个检查点更可防止细胞进入有丝分裂或有丝分裂期(M Phase)，提供细胞机会去修补DNA与停止受损坏细胞的扩散。
本发明的一个方面确认了在正常体内，有状况可以防止正常细胞于特定的时间长度内分裂，这将会在这特定时期下保护这些细胞免被辐射损坏。
本发明相应的另一方面是一种保护正常细胞免被辐射损坏的方法，该方法最好是在任何可预见的正常细胞DNA损坏之前，例如放射治疗之前，给予病人一段特定时间内有效剂量的精氨酸降解剂。举例说，所述特定时间可以是最少一日。其它例子可以是一至七日，一至五日与最优选的一至三日。
在一优选的实施方案中，本发明使用精氨酸酶在放射治疗中保护正常细胞，其中在某一个优选的实施方案中，放射治疗是用于治疗人类肿瘤。精氨酸降解剂可以是不同类型的精氨酸酶，如精氨酸酶，精氨酸脱亚氨酶，或任何其它可以给予人体用以耗尽精氨酸的生物或化学组成物。在另一优选的实施方案中，精氨酸降解剂是人类重组精氨酸酶I。在另一优选的实施方案中，人类重组精氨酸酶I是经过修饰以增加其半衰期至最少一日。在另一优选的实施方案中，所述重组精氨酸酶I是经过聚乙二醇化以增加其血清半衰期至最少一日。在另一优选的实施方案中，所述聚乙二醇化精氨酸酶其已增加的血清半衰期最少三日。其中一种制造所述人类重组精氨酸酶I的方法见于WO 04/000349 A1。
本发明的再一方面涉及使用精氨酸酶制备在放射治疗中保护正常细胞的药物。在所述放射治疗一优选实施方案中是治疗人类肿瘤。
本发明的又一方面涉及使用精氨酸酶以防止如肮脏弹的辐射污染的DNA损害作用。

附图简述
图1表示经精氨酸酶-SPA-PEG5,000处理三日的Hep3B细胞的细胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5,000的浓度是0到0.5IU/ml。
图2表示经精氨酸酶-SPA-PEG5,000处理三日的Hep3B细胞的细胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5,000的浓度是1到50IU/ml。
图3表示经精氨酸酶-SPA-PEG5,000处理三日的Hep3B细胞的细胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5,000的浓度是100IU/ml。
图4表示经精氨酸酶-SPA-PEG5,000处理三日的Alexander细胞系(PLC/PRF/5)的细胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5,000的浓度是0到0.5IU/ml。
图1表示经精氨酸酶-SPA-PEG5,000处理三日的PLC/PRF/5细胞的细胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5,000的浓度是1到50IU/ml。
图1表示经精氨酸酶-SPA-PEG5,000处理三日的PLC/PRF/5细胞的细胞周期分布，精氨酸酶-SPA-PEG5,000的浓度是100IU/ml。
图7表示经聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I与/或5-氟尿嘧啶处理的人类包皮成纤维细胞(HFF-1)的细胞周期分布。
发明说明
本文所用术语“包含”是指包括下述的元素但并不排除其它元素。本文所述的肮脏弹是指一辐射分散装置或辐射污染，例如一个能够遗留大量放射性污染的炸弹，原子弹，或上述两者结合而起。本文所用术语“降解”是指消除精氨酸到一可触发正常细胞停止细胞周期的程度，所述程度能够由所属领域的技术人员决定。
每次给予放射治疗之同时，必须考虑平衡破坏癌细胞与不影响正常细胞。在对正常细胞的放射治疗中，通常会因游离辐射损害而引起后期的皮肤损伤，致癌风险，致白血病风险，与基因损害。辐射损害程度与细胞分裂程度相关。例如，活跃地分裂的骨髓细胞，黏膜细胞和毛囊细胞将会承受更大的损害。组织的总体损害亦与因接受游离辐射而在细胞内积聚离子的时间成比例。
放射治疗的常见副作用是倦怠和萎靡不振。副作用亦可以是视乎在那里施行辐射而引致特定地方不同程度的损害，如皮肤，软组织，肌肉，神经，分泌腺和肠胃道。细胞周期对治疗癌症非常重要，因为辐射对活跃地分裂中的细胞尤其有效，而对正处于休息期(G0 phase)的细胞效用最小。
本发明教导如何以耗尽精氨酸来保护辐射暴露中或以后的正常细胞。本发明的发明人曾于WO2004/000349 A1中明确并详细披露如何使用精氨酸酶降解精氨酸。发明人确应到精氨酸酶可以降解精氨酸，由此引起细胞内积聚不带电荷的arg-tRNA，从而例如透过关闭细胞内对渥曼青霉素和/或雷帕霉素敏感的信号序列再阻止蛋白合成。在一例子中，给予接受头颈癌包括鼻咽癌放射治疗的病人有效剂量的精氨酸酶，病人鼻咽和口腔的正常细胞因辐射的损害大幅地减少。
下述的案例显示聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I对正常细胞系与肿瘤细胞系的不同效用。所有引用的参考已在此加入。
案例1：经过一天及三天培养后聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I对正常人类包皮成纤维细胞HFF-1的效能
在加入聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I之前，以低细胞密度的5 x 104cells/well于6-well培养板播种正常人类包皮成纤维细胞系(HFF-1)并培养一天。所述培养板再加入浓度分别是0.1，0.5，1，5，10，and 50U/ml的聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I再培养。混合治疗组加入10U/ml聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I与10μg/ml 5-氟尿嘧啶(5-FU)，而对照组则加入10μg/ml 5-FU。然后在摄氏37度，5％二氧化碳/95％空气的培养机中培养细胞一日与三日。与相关疗法培养后的细胞应在黑暗环境摄氏零下二十度用胰蛋白分解并以70％乙醇固定至少三十分钟。已固定的细胞用PBS清洗两次并在摄氏37度以碘化丙啶(PI)染液(10μl 2mg/ml PI和50μl 10mg/ml RNase A溶于400μl PBS)染色之少三十分钟。用流式细胞光度仪(使用BD FACSDiva流式细胞光度仪与ModFit软件)分析每个细胞的细胞周期。结果显示于表1，表2与图7。
经过浓度是1U/ml的聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I一天培养后的HFF-1细胞，当与没有经上述精氨酸酶处理过的细胞相对照时可以见到许多HFF-1细胞在精氨酸耗尽后停止在G0/G1 phase。当DNA受到损害后，正常体细胞会在G0/G1 phase开始细胞修复机制。因此，这些数据显示出如果正常细胞曾经受过聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I的治疗后，辐射对DNA的损害能够减少。
表1经一天培养后聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I对HFF-1正常细胞的影响
 G0/G1G2/MSControl40.63538.13521.230.145.528.81525.680.549.63528.3821.99171.59518.4459.861069.33525.625.045BCT+5FU50.3836.22513.3955FU48.82534.76516.41
表2经三天培养后聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I对HFF-1正常细胞的影响
 G0/G1G2/MSControl74.978.4916.540.176.8911.04512.0650.576.06514.8759.06170.36510.07519.56557.40520.6621.941049.56521.9128.525BCT+5FU60.7817.1622.075FU66.8625.657.49
案例2：精氨酸酶在肝癌放射治疗中对正常细胞的保护效能
用作体外测试的细胞系是Hep3B。
以浓度分别为0，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，与100IU/ml的精氨酸酶-SPA-PEG-5,000培养Hep3B细胞系三日。图1显示精氨酸酶-SPA-PEG-5,000的结构。图2-4显示经培养后Hep3B的细胞分布。表3显示测试结果(表3以流式细胞光度法的数据显示精氨酸剥夺对肝细胞癌(HCC)细胞系Hep3B的细胞周期分布的影响)。数据显示，癌细胞如Hep3B在适当的精氨酸酶浓度下对精氨酸剥夺有敏感反应。
 精氨酸酶-SPA-PEG-5,000(IU/ml)G0/G1(％)G2/M(％)S(％)057.9632.349.890.0559.9330.879.710.158.1924.7717.580.550.6719.7124.88148.4224.1821.94544.1519.9728.261045.5725.8930.435044.8333.6722.7210041.1634.6624.04
表3流式细胞光度法结果择要。在较高浓度的聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I之下，尽管细胞液内的精氨酸浓度低，有更多Hep3B细胞进入G2phase/M phase。
案例3：精氨酸酶在肝癌放射治疗中对正常细胞的保护效能(使用癌细胞系Alexander细胞系(PLC/PRF/5))
以浓度分别为0，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，与100IU/ml的精氨酸酶-SPA-PEG-5,000培养PLC/PRF/5细胞系三日。物料及方法与案例1雷同。图5-7显示培养后PLC/PRF/5细胞的细胞分布。表4显示测试结果。如此，结果显示在较高浓度的聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I下，更多PLC/PRF/5细胞进入S Phase，但不能进入G2/M Phase。在浓度高于50IU/ml时，部份PLC/PRF/5细胞死于编程性细胞死亡。
 精氨酸酶-SPA-PEG-5,000(IU/ml)Sub-G1(％)G0/G1(％)S(％)G2/M(％)00.1271.7415.5112.750.053.4960.4815.0917.860.14.3360.9222.7416.320.56.3859.7029.2211.0816.0657.9523.2116.2058.4759.6120.3720.071010.3758.4220.9115.785019.5355.4624.1914.1710027.8151.5336.136.15
表4流式细胞光度法结果择要。在较高浓度的聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I下，更多PLC/PRF/5细胞进入S Phase，但不能进入G2/M Phase。在浓度高于50IU/ml时，部份PLC/PRF/5细胞死于编程性细胞死亡。
比较案例1，2和3，与聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I有关的HCC细胞死亡是取决于细胞系。Hep3B细胞于低浓度聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I下在G0/G1 Phase停止细胞周期，而于较高浓度下在G2/M Phase停止细胞周期。然而在PLC/PRF/5细胞中，聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I主要引致细胞在S Phase停止细胞周期，而在高浓度下令细胞进入编程性细胞死亡。G1 phase期间细胞制造蛋白准备细胞分裂。S Phase正常维持18至30小时。G0 phase是休息期，细胞还未开始分裂，惟有当细胞收到复制信息后才进入G1 Phase。曾有显示指出，大部分肿瘤细胞如Hep3B细胞与PLC/PRF/5细胞拥有有缺憾的“R”检查点，并且不理会细胞在低浓度或没有精氨酸的情况下而进入细胞周期。因此肿瘤细胞对辐射损害更受影响。如案例1所示，正常体细胞在G1 Phase停止细胞分裂。由此可见，正常体细胞经聚乙二醇化重组人类精氨酸酶I处理过后不会在没有或低浓度的精氨酸环境下活跃地分裂，从而如因辐射而起的DNA损害能减至最少。
再进一步来说，耗尽癌细胞的精氨酸对癌细胞的影响是剂量取向多于仅此耗尽氨基酸而已。这有可能是癌细胞的精氨酸耗尽后继而引发癌细胞进入一种有缺憾的细胞周期路径。如此向接受放射治疗前和/或接受放射治疗中的病人给予消耗精氨酸的酶或不单只保护病人免受辐射损害，更可能在消灭癌细胞中产生协同效应。
本文到此已完全地描述本发明的优选实施例。尽管此描述所指是部份实施例，本领域的技术人员仍然清楚地知道能以变更当中特定的细节来实现本发明。由此，本发明不应当只解释为在本文前述实施例所限定的范围中。例如，本发明可以保护例如专为损害DNA与细胞而设计的肮脏弹的辐射污染。