离体授粉鉴定梨自花结实性品种的方法 一、技术领域
本发明提供了一套离体授粉花柱培养法来鉴定梨自花结实性品种或株系的方法，属于植物育种领域。
二、背景技术
梨是我国乃至世界主要水果之一，我国现有栽培面积125.84万公顷，是我国的第三大水果。梨是典型的配子体型自交不亲和性果树，也就是说梨绝大多数品种自花授粉不结实性，在生产中必须合理配置授粉树或进行人工辅助授粉，才有可能获得应有的产量，也常常因授粉树配置不当、花期不良气象条件影响昆虫传粉或人工授粉不及时等原因造成减产，尤其是近年来地球气候变化激烈，春季倒春寒以及花期低温阴雨天气影响昆虫的传粉活动，使得许多梨树授粉受精不良，坐果率低下，严重影响产量。如果所栽培的梨品种自花授粉能结实的话，就能避免或减少因传粉媒介昆虫的不活动而造成授粉受精不良、坐果率低下、产量受损的问题，尤其是对于保护地栽培的果树来说更为重要。因此，创新梨自花结实性种质，选育出梨自花结实性(自交亲和性)品种是个亟待解决的问题，也是今后梨、苹果等自花授粉不结实性果树新品种选育的目标之一。鉴于此，各国的梨育种学家已经把培育自花结实性品种作为育种目标，但是进展比较缓慢。现有的自花结实性品种少，比如，日本从‘二十世纪’中选出了芽变品种‘奥嗄二十世纪’，并在梨自花结实性育种中广为应用，日本将‘奥嗄二十世纪’(S基因型为S2S4sm)，作为母本培育出自花结实性新品种‘秋荣’(S4smS5)。本课题组近几年通过杂交授粉也得到了一定群体的“奥嗄二十世纪”后代，并从中筛选出了近百株的自花结实性株系。但从育种的角度来说，仅靠单一的品种做亲本在培育综合经济性状优良的株系上存在着很大的局限性，获得大量自花结实性品种群体是深入研究自花结实性机理和培育出综合经济性状优良的新品种的前提条件。因此，从众多的梨品种中快速筛选鉴定出自花结实性品种是当下科研工作者亟待解决的瓶颈问题。传统的鉴别果树自花结实性的方法是通过调查田间自花授粉坐果率的高低来确定的。这一方法周期长，耗时耗力，常因花期不良气象条件而影响坐果，并且一年只能进行一次试验，无法短期内对坐果率进行重复验证。通常需要连续2～3年的数据统计才能确定品种是否自花结实，这为育种工作带来了很大的不便。正是由于自花结实性品种在栽培育种和理论研究上的重要意义，培育出的品种具有良好的应用前景，所以寻找一种高效鉴定自花结实性株系(品种等)的方法显得尤为重要。
在本发明中，通过观测50多个梨品种离体授粉后花柱内花粉管生长的特性，发现从离体花柱的基部切口处长出花粉管的花柱比率与田间人工授粉的坐果率有一一对应的关系，并通过田间验证，证实了应用该方法鉴定的梨品种自花结实性程度与应用田间授粉鉴定的结果完全一样，非常可靠。该方法改变了长期以来一直仅靠田间人工自花授粉坐果率高低来确定果树品种自花结实性程度的费时、费工、效率低下的局面。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是：创建了一套花柱离体授粉鉴定梨品种自花结实性的方法。通过统计在培养基上离体授粉花柱基部切口处长出花粉管的花柱比率高低来确定各供试品种自花结实性的程度，并对梨品种的自花结实性程度进行了分类。该方法方便快捷，改变了传统的仅靠田间人工授粉坐果率高低来确定品种的自花(不)结实性强度的局面，为在较短时期内大批量地筛选鉴定梨品种自花结实性程度提供了可能，巨大地提高了工作效率。该方法还可应用于其它果树自花结实性的研究。
技术方案
1、离体授粉鉴定梨自花结实性品种的方法，其特征在于：
1)人工自花授粉：从大花蕾中取出花药，收集在自然干燥条件下散出的花粉，同时对拟授粉的花蕾去雄后，立即进行人工自花授粉；
2)授粉花柱的培养：在培养基上放置一张用酒精洗涤过的滤纸7.0cm×0.2cm，将授粉后的花柱平子房上端切下，迅速的放置到培养皿中排好，柱头枕于滤纸上，并使花柱切口端水平接触于培养基，每个授粉组合处理花柱30-40根，重复3次，在25℃、黑暗保湿条件下培养48h后，在花柱切口附近滴上质量比0.1％的苯胺蓝染色液，而后在显微镜下观察统计从花柱基部长出花粉管的花柱比率＝长出花粉管的花柱数/供试花柱数×100％，其比率在30％以上者为自花结实性品种，10％以下者为自花不结实品种，处于二者之间的品种为自花半结实性品种。
大批量鉴定品种自花授粉结实性程度时，在春季开花前2个月左右，剪取花芽饱满的健壮结果枝，插入含质量比10％蔗糖、水溶液深度5～6厘米的桶中，每隔5天更换溶液1次，放到温室或人工气候室内催花，获得比田间提早30～40天开花的大花蕾。
有益效果
本发明所提供的花柱离体授粉鉴定梨自花结实性品种的方法，具有以下优点：
(1)本发明的鉴定方法简便。传统用于鉴别果树自花结实性程度的方法是通过调查田间人工自花授粉坐果率的高低来确定的。这一方法周期长，需要花费很多人力物力。本发明可在短时间内进行大量样品的检测，操作简便，只涉及简单的授粉试验和花粉管统计试验，大大节约了生产成本，缩短了育种时间，并可为探讨其他果树品种自花结实性提供借鉴。
(2)本发明准确性高。坐果率的调查常常因外界气候条件影响而不能真实反映出品种自花结实性的强弱，本发明所提供的离体授粉后的花柱培养法可完全避免了外界因素的干扰，大大提高了鉴定的准确性。
(3)本发明将梨品种的自花结实性程度进行了强、中、弱三种类型的分类，这为今后梨品种自花结实性强弱的鉴定提供了理论参考依据，并为自花结实性机理的研究丰富了试材。
四、附图说明：
图1：人工自花授粉
A：摘取完整花序；B：去除小花蕾和已经开放的花；C：去雄后人工自花授粉；D：平子房切取花柱；
图2：授粉花柱离体培养示意图；
图3：显微镜下观察自花授粉后的花柱基部花粉管生长情况；
图4：供试52个梨品种长出花粉管花柱的比率统计
供试品种分别为：1，‘54S-135’；2，‘54S-168’；3，‘54S-213’；4，‘奥嗄二十世纪’；5，‘新雪’；6，‘日本山梨’；7，‘巴梨’；8，‘54S-102’；9，‘晚三吉’；10，‘八里’；11，‘菊水’；12，‘二十世纪’；13，‘喜水’；14，‘彗星’；15，‘六月’；16，‘清澄’；17，‘祗园’；18，‘早生幸藏’；19，‘松风’；20，‘青龙’；21，‘水秀’；22，‘新幸’；23，‘市原早生’；24，‘三重豆梨’；25，‘新星’；26，‘鸭梨’；27，‘赤穗’；28，‘明月’；29，‘独逸’；30，‘金二十世纪’；31，‘八云’；32，‘真瑜’；33，‘慈梨’；34，‘今村秋’；35，‘明水’；36，‘铃木’；37，‘朝鲜豆梨’；38，‘八幸’；39，‘筑水’；40，‘爱甘水’；41，‘长寿’；42，‘珠玉’；43，‘清玉’；44，‘幸藏’；45，‘幸水’；46，‘丰水’；47，‘君冢早生’48，‘爱宕’；49，‘长十郎’；50，‘新水’；51，‘伊田’；52，‘新高’；
五、具体实施方式：
(一)实验方法
1、水培促花：供试的52个品种均来自于南京农业大学江浦园艺试验站梨种质资源圃(中国农业科学院果树研究所，国家梨种质资源圃内保存有这些品种，详细信息见专利遗传资源来源披露登记表)，在春季开花前的2月上旬左右，剪取已经通过低温解除休眠的花芽饱满的健壮枝条，将枝条的基部剪成斜面，直立插入含10％蔗糖、水溶液深度5～6厘米的桶中，每隔5天更换溶液1次，放到温室或人工气候室内催花；
2、自花授粉：采取一完整花序，去除已开的盛花和顶花，留大蕾期的花苞，去雄后，立即蘸取自花花粉(图1-A，B，C)；
3、授粉花柱离体培养：在培养基上放置一张用酒精洗涤过的滤纸(7.0cm×0.2cm)，将授粉后的花柱平子房上端切下(图1-D)，迅速的在培养皿中排好，柱头枕于滤纸上，并使花柱切口端接触培养基(图2)。每个授粉组合处理花柱30根左右，重复3次，在25℃、黑暗保湿的条件下培养；
4、长出花粉管的花柱比率的统计：授粉花柱离体培养48h后，在花柱切口附近滴上数滴0.1％苯胺蓝染色液，在显微镜下观察从花柱基部长出的花粉管数，并统计从花柱基部长出花粉管的花柱比率(长出花粉管的花柱数/供试花柱数×100％)。
(二)结果与分析：
经显微镜观察，不同品种从花柱基部长出花粉管的多少存在差异。有些品种花柱基部能明显的观察到很多花粉管长出(图3-1)，有些长一两根(3-2，3-3)，有些则没有一根花柱能长出花粉管(3-4)。统计各供试品种长出花粉管的花柱比率可以看出，最高的为‘奥嗄二十世纪’的自交后代‘54S-135’，花柱比率可达43±6.4％。最低的为‘新水’和‘新高’，因从它们的花柱基部没有观察到花粉管长出，故统计比率为0％。纵观供试各品种花柱基部长出花粉管的花柱比率，比率值越高则说明该自花发粉管通过花柱的几率大，易完成受精，自花结实性好，反之则不易通过花柱，坐果率低。对比发现，供试品种的离体授粉花柱基部切口处长出花粉管的花柱比例与田间人工授粉坐果率的高低有一一对应的关系，故可根据这一比率的高低来确定各供试品种自花结实性的强弱。
为便于分类统计，本发明对供试的52个梨品种自花结实性强度划分为三个类型：将花柱比率在30％以上的定义为自花结实，在30％～10％之间的定义为半自花结实，将10％以下的定义为自花不结实(图4)。最终确认了‘新雪’，‘日本山梨’，‘巴梨’，‘奥嗄二十世纪’及其4株自交后代‘54S-135’、‘54S-168’、‘54S-213’、‘54S-102’为自花结实性品种(株系)。
通过自花授粉后花柱离体培养的方法来筛选自花结实性株系，改变了传统的仅靠田间人工授粉坐果率高低来确定品种自花结实性的局面。该方法简便快捷，可在短时间内进行大量样品的鉴定，缩短了育种时间，节约了生产成本，并对其它植物自花结实的研究也有着重要的参考价值。