一种杂交和胚培养相结合选育多倍体乌桕新品种的方法 技术领域 本发明涉及经济树木育种的方法， 特别是一种杂交和胚培养结合选育多倍体乌桕 新品种的方法， 通过优良品种杂交和多倍体诱导选育优良四倍体乌桕新品种的方法。
背景技术 随着化石能源日益面临枯竭， 人们开始在世界范围内寻找替代能源。开发能源植 物代替化石能源有广阔的前景。中国林业科学研究院研究后列出 60 余种能源植物， 其中木 本油料植物是其重要物种。它既可以作为固体燃料， 又可以提炼生物原油。美国诺贝尔奖 获得者卡尔教授， 1984 年就已经开发出首个人工石油植物， 得到每公顷 120-140 桶生物原 油的收成。根据中国中长期能源规划， 到 2020 年全国可再生能源利用总量将相当于 6 亿吨 标准煤， 其中大力发展能源植物， 尤其油料植物将对中国能源的结构调整， 减少温室气体排 放， 保护生态环境等方面发挥重大作用。
乌桕 (Sapium sebiferum Roxb) 是一种理想的木本油料能源植物， 是我国特有的 与油茶、 油桐和核桃并称为我国四大木本油料植物的树种之一。 它为大戟科落叶乔木， 果扁 球形， 黑褐色， 熟时开裂。种子黑色， 外被白蜡 ； 种子含油率 40％左右， 称为梓油 ； 蜡被含油 率 35％左右， 称为皮油， 用其提炼生物原油效果很好。 但是， 我国乌桕的单产很低， 亩产仅几 十到几百公斤远远低于美国亩产 1000 多公斤的水平。我国的乌桕新品种选育也仅仅局限 于对农家品种的收集选育阶段。 因此， 开展乌桕的不同品种杂交和多倍体育种， 发挥杂种和 多倍体双重优势， 对于选育高产乌桕良种， 提高产量极为重要。
发明内容 本发明的目的在于提出一种利用杂交和多倍体结合选育乌桕新品种的方法。解 决现有乌桕生产主要依靠地方品种， 产油量低的现状， 通过本发明的实施， 将为获得抗逆性 强， 产油量高的多倍体乌桕新品种提供技术和育种材料， 为提高制备生物柴油原材料的产 油量， 缓解能源危机， 提高环境保护能力， 降低碳消耗指数做出贡献。
本发明是这样实现的。其技术方案是 ：
1)、 以葡萄桕为母本鸡爪桕做父本， 于乌桕开花盛期授粉杂交获得杂交种 ；
2)、 对未成熟的乌桕杂种胚的愈伤组织诱导培养， 采取杂交后发育 25-40 天的 杂种果实， 在无菌条件下剥出杂种胚置入愈伤组织诱导培养基中培养 30 天 -35 天， 愈 伤 组 织 诱 导 培 养 基 成 分 为 MS+NAA 0.1mg/l-1.0mg/l+6-BA0.5mg/l-3.0mg/l+sucrose 3.0％ -5.0％ +agar0.75％ -1.2％， pH6.0 ；
3)、 加倍处理， 将旺盛生长的乌桕杂种胚愈伤组织放在加倍诱导培养基中诱导染 色体加倍处理 36-56 小时 ； 加倍诱导培养基成分为不加 agar 的愈伤组织诱导培养基 + 秋水 仙素 350mg/L-1000mg/l ；
4)、 恢复培养， 将加倍处理后的乌桕杂种胚愈伤组织转入愈伤组织诱导培养基中 进行恢复培养 7-10 天 ；
5)、 分化出苗， 将恢复培养后的乌桕杂种胚愈伤组织转入诱导分化培养基中培 养 10 天 -30 天， 分化出芽苗， 诱导分化培养基成分为 MS+6BA1mg/l-3.5mg/l+NAA 0.1mg/ l-0.7mg/l+sucrose 2.0％ -3.5％ +agar0.75％ -1.2％， pH6.0 ；
6)、 分化苗生根培养， 将乌桕杂种胚愈伤组织分化的芽苗分株接入生根培养 基， 在试管中进行分化苗生根培养 15-20 天， 生根培养基成分为 MS+IBA0.7mg/l-1.5mg/ l+NAA0.1mg/l-0.5mg/l+sucrose 2.0％ -3.0％ +agar0.75％ -1.2％， pH6.0 ；
7)、 植株移植， 将已生根， 株高 3.0cm 以上的乌桕试管苗栽植于 1/3 细沙 +1/3 细土 +1/3 蛭石的灭菌培养土中， 遮荫保湿， 待小苗长到 10.0cm 高后再带土移栽到田地中 ；
8)、 形态学鉴定， 根据四倍体乌桕的株高较二倍体乌桕矮 10 ％ -25 ％， 叶片厚 25％ -35％， 茎节密 15％ -25％的特点， 初步区分四倍体和二倍体乌桕植株 ；
9)、 细胞学和染色体数目的鉴定， 根据四倍体乌桕的叶片背面的气孔细胞比 二倍体的少 35 ％ -45 ％， 大 30 ％ -40 ％， 四倍体的气孔细胞叶绿体数目比二倍体的多 65％ -85％， 根尖和茎尖细胞染色体数目四倍体乌桕是二倍体的二倍数， 结合形态学特点而 确定四倍体乌桕。
发明的有益效果 ： 通过本发明的实施， 将充分发挥杂交和多倍体的双重优势为获得抗逆性强， 产油 量高的多倍体乌桕新品种提供技术和育种材料， 为提高制备生物柴油原材料的产油量， 缓 解能源危机， 提高环境保护能力， 降低碳消耗指数做出贡献。
附图说明 ：
图 1、 为两种优良乌桕品种葡萄桕 ( 左 ) 和鸡爪桕 ( 右 ) 及其杂交种植株 ( 中 ) 的 图片， 杂种表现出明显的杂种优势 ；
图 2、 3、 4、 5 为乌桕杂种胚培养成愈伤组织秋水仙素处理愈伤组织分化出苗图片。 具体实施方式
实施例 1
1. 选择优良乌桕地方品种夏店葡萄桕做母本， 大悟鸡爪桕为父本 ；
2. 于乌桕开花盛期 6 月中旬的 10 ∶ 30-14 ∶ 30 授粉杂交 ；
3. 采取杂交后发育 35 天的杂种果实， 在无菌条件下剥出杂种胚置入 MS+NAA 0.5mg/l+6-BA 0.5mg/l+sucrose 3.0％ +agar0.75％， pH6.0 等成分的愈伤组织诱导培养 基中培养 30 天， 诱导愈伤组织形成 ；
4. 待乌桕杂种胚愈伤组织旺盛生长， 呈现淡黄色半颗粒状时转入不加 agar 的愈 伤组织诱导培养基 + 秋水仙素 500mg/l， 处理 48hr 诱导染色体加倍 ；
5. 将加倍处理后的愈伤组织转入愈伤组织滤导培养基中恢复培养 8 天 ；
6. 将加倍愈伤组织转入诱导分化培养基， MS+6BA 1mg/l+NAA 0.5mg/l+sucrose 2.0％ +agar 0.75％， pH6.0 中培养 30 天， 分化出芽苗 ；
7. 将 分 化 的 芽 苗 分 株 接 入 MS+[BA 0.7mg/l+NAA0.1mg/l+sucrose2.0 ％ +agar 0.75％， pH6.0 生根培养基中生根培养 15 天 ；
8. 将已生根， 株高 3.0cm 以上的乌桕试管苗栽植于 1/3 细沙 +1/3 细土 +1/3 蛭石的灭菌培养土中， 遮荫保湿， 待小苗长到 10.0cm 高后再带土移栽到田地中生长 ；
9. 根据四倍体乌桕的株高较二倍体乌桕矮 10％ -25％， 片厚 25％ -35％， 茎节密 15％ -25％的特点， 进行加倍乌桕苗的形态学鉴定， 初步区分四倍体和二倍体乌桕植株 ；
10. 根 据 四 倍 体 乌 桕 的 叶 片 背 面 的 气 孔 细 胞 比 二 倍 体 的 少 35 ％ -45 ％， 大 30％ -40％， 四倍体的气孔细胞叶绿体数目比二倍体的多 65％ -85％， 根尖和茎尖细胞染色 体数目四倍体乌桕是二倍体的二倍数， 进行加倍乌桕苗的细胞学和染色体数目的鉴定， 结 合形态学特点而确定四倍体乌桕。