本发明属于一种临床检测技术，主要用于腹泻病人产毒性大肠杆菌的检测。 产毒性大肠杆菌是引起人类感染性腹泻的主要病原菌，其可产生多种肠毒素，其中最主要一种为I型不耐热肠毒素（LT1），采用核酸杂交技术可检测到LT1编码基因。最初人们采用同位素标记LT1DNA探针用于核酸杂交（Moseley SL，et al J Infect Dis 1982，145∶863）来检测产毒性大肠杆菌，虽然特异性和敏感性较高，但同位素半衰期短，操作时防护及同位素处理等缺点限制其常规应用。近年来，人们研究非同位素标记探针来检测产毒性大肠杆菌，主要应用生物素（Bi-alkowska Hobrzanska H.J clin Microbiol 1987，25∶338），尽管生物素标记LT1探针避免了同位素探针的缺点，但其敏感性低于前者，而且在应用于临床标本的检测时还未解决好特异性的问题。
本发明的目的在于提供一种具有高度特异性和敏感性、操作方便、检测时间短的地高辛素标记LT1DNA探针的制备及检测方法。
本发明的任务是这样完成的，以800个碱基对LT1DNA片段为模板，在KLENOW酶的作用下，地高辛素标记核苷酸（地高辛素-dUTP）掺入新合成的DNA链，从而形成地高辛素标记LT1DNA探针;将腹泻病人的粪便标本点于硝酸纤维素滤膜上，经RNA酶A和蛋白酶K消化处理后，在适当条件下用该探针进行杂交检测产LT1的产毒性大肠杆菌。
下面结合实施例对本发明作详细说明。
一.地高辛素标记LT1DNA探针的制备
1.取若干ulLT1DNA（0.1～1ug），95～100℃水浴5～10分钟，迅速冷缺;
2.在水浴中加入1～2ul六核苷酸混合物、1～2ul带地高辛素标记的核苷酸混合物（含地高辛素-dUTP 0.35mM/L，PH6.5），加无菌去离子水至反应体积19ul，再加1ul KLENOW酶。
3.混匀后在25～37℃水浴1～18小时;
4.加2ul 0.2M乙二胺四乙酸二钠（EDTA，PH8.0），终止反应;
5.加2ul 4M氯化锂、60ul无水乙醇沉淀标记的DNA，在-20℃放置2～14小时;
6.高速离心，用70%乙醇洗涤沉淀物;
7.用50ul 10∶1TE[10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、1mM EDTA、PH8.0]溶解沉淀物。
经过上述步骤，即制成地高辛素标记LT1DNA探针。
二.核酸杂交
下述实验溶液用量以100cm2硝酸纤维膜为准。
1.滤膜准备
（1）将无菌硝酸纤维素滤膜平放LB培养基（每100ml含胰蛋白胨1g、酵母粉0.5g、氯化钠1g和琼脂1.5g）上;
（2）取样本（粪便或细菌）点膜，37℃培养过夜;
（3）将滤膜转移到为下述液体饱和的双层滤纸上：
0.5N氢氧化钠2×10分钟
1M Tris-HCl（PH7.6）2×2分钟
1M Tris-HCl（PH7.6）～1.5M氯化钠10分钟
（4）凉干滤膜后80℃2小时烘烤;
（5）滤膜浸泡于10∶1 TE 37℃ 5分钟后用40～200ug/ml RNA酶A（用10∶1TE稀释）25～37℃消化1～2小时;用10∶1TE、TES[10mM Tris-HCl、PH7.8-5mM EDTA-0.5%十二烷基磺酸钠（SDS）]各洗涤一次;
（6）用50～1000ug/ml蛋白酶K25～50℃消化1～2小时，TES 25～50℃洗涤2×5分钟，凉干备用。
2.杂交
置硝酸纤维素滤膜于杂交袋，加10ml预杂交液（5×SSC、0.5～5%封闭液、0.02～0.09% SDS，其中1×SSC＝0.15M氯化钠-0.015M柠檬酸钠）68℃水浴2～5小时;倒出预杂交液加2.5ml杂交液（5×SSC、0.5～5%封闭剂、0.02～0.09% SDS、2～200ng/ml新鲜变性地高辛素LT1探针）68℃水浴2～12小时。
3.洗膜
50ml 2×SSC-0.1% SDS洗膜3×5分钟，50ml 0.1SSC-0.1% SDS65℃洗膜3×15分钟。
4.检测
（1）20ml 1号液（0.1M Tris-HCl、PH7.5-0.15M氯化钠）浸泡滤膜1分钟;
（2）30ml 2号液（含0.5～5%封闭剂的1号液）封膜20～40分钟;
（3）1号液洗1次;
（4）按1∶5000比例用1号液稀释抗地高辛素抗体-碱性磷酸酶复合物至150mu/ml，用10ml抗体-酶复合物稀释液孵育滤膜20～40分钟;
（5）100ml 1号液洗膜3×15分钟;
（6）20ml 3号液（0.1M Tris-HCl、PH9.5-0.1M 氯化钠-0.05M氯化镁）浸泡2分钟;
（7）10ml显色液[含45ul四唑氮蓝（NBT）、35ul 5-溴-4-氯-3-碘-磷酸盐（BCIP）的10ml 3号液]在暗处孵育滤膜2～24小时;
（8）20ml 4号液（10∶1 TE、PH8.0）洗膜5分钟终止反应观察结果。
凉干滤膜保存。
本发明地优点为：（1）具有高度特异性和敏感性，在DNA斑点试验中可检测0.1pg质粒DNA，在菌落原位杂交试验中可检测12个细菌/ml，在粪便斑点杂交试验中可检测24个细菌/ml，且检测结果无假阳性和假阴性;（2）检测时间短，仅需20～30小时;（3）性质稳定，在低温条件下可长期保存（1～2年）;（4）操作安全，无需防护。