戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶 本发明涉及头孢菌素酰化酶，尤其是关于一种含有从假单胞菌(Pseudomonas sp.130)中克隆的并经基因工程方法改造的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因和该基因的重组表达质粒以及该基因在大肠杆菌中的表达。
7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid,7-ACA)是医药工业合成大多数头孢菌素衍生物的起始原料。7-ACA可以通过发酵产物头孢菌素C(cephalosporin C,CPC)的化学去氨酰化得到。由于化学方法诸如亚胺醚和亚硝酰氯法包括多个造价昂贵的步骤，所以人们一直试图探索用酶法来解决这个问题[Vandamme E J,Voets JP.Adv Appl Microbiol,1974；17:311]。目前已经发现两类头孢菌素酰化酶(cephalosporin acylase,CA)，分别为戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(glutaryl 7-ACA acylase,GL-7ACA酰化酶)和头孢菌素C酰化酶(cephalosporin C acylase,CPC酰化酶)，它们分别催化GL-7ACA和CPC的水解反应，又因为CPC可以在D-氨基酸氧化酶催化下(D-AAO)很容易地生成GL-7ACA[Isogai T et al.J Biochem,1990；108:1063]。所以GL-7ACA酰化酶和CPC酰化酶一样，在酶法合成7-ACA上具有重要的应用价值(见图1)。
根据已有的报道，现已有10个头孢菌素酰化酶的基因被克隆[见Matsuda A,Komatsu K I.JBacteriol,1985；163:1222；Yang Y et al.Chin JBiotech,1991；7:99；Ishii Y et al.JFerment Bioeng,1994；77:591；MatsudaA et al.J Bacteriol,1987；169:5815；Matsuda A et al.J Bacteriol,1987；169:5821；Ishiye M,Niwa M.Biochim Biophys Acta,1992；1132:233；AramoriIet al.J Ferment Bioeng,1991；72:232；Aramori I et al.JBacteriol,1991；173:7848]。杨蕴刘等从假单胞菌中克隆到GL 7-ACA酰化酶的基因[Yang Y et al.Chin J Biotech,1991；7:99]，并测定了其全序列。该酰化酶与GK16酰化酶[Matsuda A,Komatsu KI.JBacteriol,1985:163:1222]和C427酰化酶[Ishii Y etal.J Ferment Bioeng,1994；77:591)很相似，这三个酶基因具有95％左右的同源性。酶分子量均为70千道尔顿，由两个亚基组成，亚基分子量分别为54和16千道尔顿；它们最引人注目的特点是在很宽的pH值范围内(pH6.5-9.0)对GL-7ACA都有很高的水解活力；这一点在工业生产上是十分有利的，因为GL-7ACA水解过程中生成戊二酸，反应液的pH值变化较大。
GK16酰化酶基因最先被一家日本公司克隆，并且已经申请了专利[Tsuzuki K et al.Nippon Nougeikagaku Kaishi 1989；63:1847]。但是该基因只有公开报道的α-亚基的全部序列和β-亚基的部分序列。随后日本另一家公司克隆了C427酰化酶基因，并公开发表了全基因序列。由于酶基因在假单胞菌中表达量极低，这两家日本公司都对酶基因在大肠杆菌中进行了不同程度的高表达工作，得到的高表达菌株产酶量比原宿主菌(假单胞菌)高出许多倍。杨蕴刘等从假单胞菌克隆的酰化酶基因片段约为3.5kb(kb表示DNA地长度为1000个碱基对)，该基因在假单胞菌中表达极低，即使在大肠杆菌中表达量也很低，粗抽液比活仅为每毫克蛋白0.42单位(0.42u/mg)[周宏伟等。微生物学报，1997；37:196]，需要经过复杂的五步才能纯化。因此本发明也将用基因工程改造此酶基因，使其能够在大肠杆菌中高表达，以便在酶法生产7-ACA过程中发挥重要作用。
为此，本发明目的是提供一种从假单胞菌中克隆的并经基因工程方法改造的GL-7ACA酰化酶基因，和含有该基因的高表达重组表达质粒，以及将该重组表达质粒转化到大肠杆菌中成为能高表达该酰化酶的基因工程菌株。
本发明是一种从假单胞菌中克隆的并经基因工程方法改造的长为2.3kb的GL-7ACA酰化酶基因，其全序列见图2。用该GL-7ACA酰化酶基因与Eco RI和Hind Ⅲ酶切后的大肠杆菌表达载体pKK235连接成为重组表达质粒pKKCA1，再将该质粒pKKCA1转化到大肠杆菌JM109中得到高表达的基因工程菌株JM109/pKKCA1。从工程菌株JM109/pKKCA1中提纯出GL-7ACA酰化酶，并测得改造后的酶活力与改造前的酶活力基本相同。1酰化酶基因的改造和重组表达质粒pKKCA1的构建
从假单胞菌中克隆的GL-7ACA酰化酶基因全序列如上所述已由杨蕴刘等人测出，成熟酶由两个亚基(α、β)组成，它们的N-端氨基酸序列分别为：α,LAEPTSTPQA；β,SNSWAVAPGK。由基因序列推断GL-7ACA酰化酶前体的5’-端有一段长为27个氨基酸的信号肽序列，该序列为假单胞菌的信号肽，可能不能有效地被大肠杆菌识别；而假单胞菌的基因表达元件(启动子、核糖体结合位点和RNA聚合酶结合位点等)有可能也会影响基因在大肠杆菌中的表达。故在基因的改造过程中，将带有假单胞菌信号肽的DNA序列和表达元件删除。按Promega公司Altered SitesⅡ in vitro Mutagenesis Systems操作手册进行点突变反应，把基因序列由82CTG GCC GAG CCG ACC TCG ACG CCG突变为CTG GCC GAATT CCG ACC TCG ACG CCG(突变引物，引入一个EcoRⅠ位点，基因编号以翻译起始点为1)，把终止子后的基因序列由235AGA GCG GCG AAG TTC GCC TCT ATC GCA变为AGA GCG GCG AAG CTTCGCC TCT ATC GCA(突变引物，引入一个HindⅢ位点基因编号以翻译起始点为1)；这样，突变后的DNA片段5’-端有一个Eco RⅠ位点：…GAATTCCGA…,3’-端有一个Hind Ⅲ位点：…GCGGCGAAGCTT…。用Eco RⅠ和Hind Ⅲ酶切后就可以得到一个长为2.3kb的基因片段，它的核苷酸序列和相应的氨基酸序列见图2(开始的四个核苷酸ATGG是后加上的，见图3)。将该片段与EcoRⅠ和HindⅢ酶切后的大肠
杆菌表达载体pKK235连接成为重组表达质粒pKKCA1(图3)。
2基因工程菌株JM109/pKKCA1的获得
将pKKCA1转化到大肠杆菌JM109{遗传特征为ndA1,recA1,gyrA96,thi,hsdR17(rK-,mK+),relA1,supE44,Δ(1ac-proAB),[F’,traD36,proAB,lacIqZΔM15]}中，得到的转化子JM109/pKKCA1即为本发明所指的基因工程菌株(菌种保藏号：CGMCC No.0307，日期：1997年5月12日，保藏地：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。培养至对数后期的工程菌用超声波破碎，测定破碎后的粗抽液的酰化酶活力，活力为每毫克蛋白3.5单位(3.5u/mg)。3从工程菌株JM109/pKKCA1中提纯GL-7ACA酰化酶
将6克工程菌用超声波破碎，离心后得到约300毫克粗抽液，将粗抽液超离心后上DEAE-Sepharose CL-6B层析柱(见图4中的(A))，得到的有活力的组分再上HA-Ultragel层析柱(见图4中的(B))，得到的酶液储存于-20℃。由于获得了高表达工程菌株JM109/pKKCA1，使得GL-7ACA酰化酶的纯化易于进行。经两步柱层析即可将酶纯化到比活力为每毫克蛋白12单位，回收率近50％。整个纯化步骤见表1。图5为表达产物GL-7ACA酰化酶纯化过程中的Tricine-SDS-PAGE[Schagger H,Jagow G V.Anal Biochem,1987；166:368]分析图。
表1.GL-7ACA酰化酶的纯化*提纯步骤总蛋白(mg)总活力 (u)比活(u/mg) 收率 (％)纯化倍数粗抽液DEAE-Sepharose HA-Ultragel 294 69.7 41.4 1020 578 490 3.5 8.3 12 100 57 48 1 2.4 3.4*从6克湿菌体(约有0.5克干菌体)中抽提，每克干菌体大约有2040单位的酶。4 GL-7ACA酰化酶的活力测定
测得改造后的酰化酶与改造前的酶在α亚基的氨基酸序列上有所不同，改造后的酶为(M)GIPTSTQA…(第一个氨基酸Met在体内被加工去掉)；改造前的酶为LAEPTSTPQA…。因此很有必要准确地测定改造后酶的活力，包括米氏常数Km和最大反应速度Vmax。GL-7ACA酰化酶的活力测定参照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem,1981；45:773]进行。酶活力单位(unit)定义为37℃、pH7.0时每分钟水解GL-7ACA产生1μmol的7-ACA所需要的酶量。酶的比活力定义为每毫克蛋白所具有的酶活力单位。测得本发明中提纯的GL-7ACA酰化酶的米氏常数Km值为0.48mmol/L，最大反应速度Vmax值为10.2μmol/min/mg(图6)，与改造前的酶(米氏常数Km值为0.46mmol/L，最大反应速度Vmax值为10.6μmol/min/mg)基本相同[周宏伟等.微生物学报，1997；37:196]。本发明的优点：
本发明从假单胞菌中克隆的并经基因工程方法改造的GL 7-ACA酰化酶基因连接到大肠杆菌表达载体pKK235上，得到重组表达质粒pKKCA1，再将重组表达质粒pKKCA1转化到大肠杆菌JM109中得到基因工程菌株JM109/pKKCA1。改造后的基因和改造前的基因与GK16酰化酶基因，以及C427酰化酶基因具有很高的同源性(95％左右)。但是，本发明的菌株和表达产物酰化酶与其他两种相比具有很大的优越性：
首先，GK16酰化酶菌株产酶量太低，每克干菌体仅有200单位酶[MatsudaA.Komatsu KI.J Bacteriol,1985:163:1222]；而本发明的菌株产酶量每克干菌体有2040单位酶，远远大于GK16酰化酶菌株。
其次，C427酰化酶比活力较低，只有4.7u/mg，即使经过改造也只能达到5.6u/mg。而本发明的酰化酶比活力达到12u/mg，是C427酰化酶比活力的两倍多。C427酰化酶菌株的培养条件较为苛刻：20C培养温度，培养基为含2％酪蛋白酸水解物、1％甘油的M9培养基；需加入每毫升20微克的β-吲哚乙酸诱导；1升培养物约需72小时的培养时间[Ishii Y et al J FermentBioeng,1994；77:591]。而本发明的菌株用37℃的培养温度和普通的LB培养基培养；无需加入诱导物；1升培养物只需24小时的培养时间。
本发明改造后的重组表达质粒pKKCA1及基因工程菌株JM109/pKKCA1和改造前的重组表达质粒pMR24及基因工程菌株CU334[周宏伟等.微生物学报，1997；37:196)相比，有着以下的优点：第一，改造后的基因片段只有2.3kb，改造前则有3.5kb，太长的DNA片段会使工程菌株中的质粒的拷贝数降低，从而影响产物的表达；第二，改造后的基因将假单胞菌的信号肽和表达元件去除，使酰化酶直接在大肠杆菌的启动子和核糖体结合位点下表达，而改造前的基因带有的假单胞菌的信号肽和表达元件在大肠杆菌中表达有一定的困难；第三，改造后的工程菌JM109/pKKCA1粗抽液的酰化酶活力为3.5u/mg，而改造前只有0.42u/mg。通过以下附图和实施例对本发明作进一步阐述。
【附图说明】
图1是GL-7ACA酰化酶和CPC酰化酶所催化的反应示意图。CPC：头孢菌素C；D-AAO:D-氨基酸氧化酶；7-ACA:7-氨基头孢烷酸；GL-7ACA：戊二酰-7-氨基头孢烷酸。
图2是本发明2.3kb的GL-7ACA酰化酶基因片段的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。
图3是重组表达质粒pKKCA1的构建示意图。
图4是用层析方法从基因工程菌JM109/pKKCA1中提纯GL-7ACA酰化酶过程的示意图。X轴表示洗脱体积(毫升)；Y轴表示洗脱液在280纳米的相对光吸收值。箭头所指处为酶活力所在峰。(A)DEAE-Sepharose CL-6B(2×15厘米)柱层析；(B)HA-Ultragel(1×10厘米)柱层析。
图5是表达产物GL-7ACA酰化酶纯化过程中的Tricine-SDS-PAGE分析图。1．蛋白质分子量标准(Sigma)分别为66,45,36,24,20.1,14.3千道尔顿(kD)；2．粗抽液(超声波破碎，离心之后)，上样量为20微克；3.DEAE-Sepharose柱层析之后的样品，上样量为20微克；4.HA-Ultragel柱层析之后的样品，上样量为45微克。
图6是从基因工程菌株JM109/pKKCA1中提纯的GL-7ACA酰化酶的双倒数作图。X轴表示底物(GL-7ACA)的浓度的倒数；Y轴表示反应初速度的倒数。按照米氏方程可以求出酶促反应的Km值和Vmax值。
实施例1 GL-7ACA酰化酶基因的基因工程改造
从假单胞菌中克隆的长为3.5kb的GL-7ACA酰化酶基因片段全序列已有报道，成熟酶由两个亚基(α、β)组成，它们的N-端氨基酸序列分别为：α亚基，LAEPTSTPQA；β亚基，SNSWAVAPGK。首先从pMR24[周宏伟等。微生物学报，1997；37:196]把含有酰化酶基因的3.5kb的DNA片段用Bam HⅠ(Boehringer Mannheim GmbH，德国；下面的Eco RⅠ,HindⅢ，以及T4 DNA连接酶均来自该公司)切下来，用T4 DNA连接酶连接到突变载体pAlter-1(Promega，美国)上，按Promega公司Altered Sites Ⅱ in vitro MutagenesisSystems操作手册进行两个点突变反应：第一个，突变引物为CTG GCCGAATT CCG ACC TCG ACG CCG，它把基因序列由82CTG GCC GAG CCGACC TCG ACG CCG(基因编号以翻译起始点为1)突变为CTG GCC GAATTCCG ACC TCG ACG CCG，引入一个EcoRⅠ位点；第二个，突变引物为AGAGCG GCG AAG CTTC GCC TCT ATC GCA，它把终止子后的基因序列由2359AGA GCG GCG AAG TTC GCC TCT ATC GCA(基因编号以翻译起始点为1)突变为AGA GCG GCG AAG CTTC GCC TCT ATC GCA，引入一个HindⅢ位点。用DNA测序试剂盒(T7 Sequenase 2.0 DNA Sequencing kit,USB,Amersham，英国)测定突变位点的DNA序列，确保突变反应的正确。用EcoRⅠ和HindⅢ酶切后就可以得到一个长为2.3kb的基因片段，测得它的核苷酸序列和相应的氨基酸序列见图2(开始的四个核苷酸ATGG是后加上的，见图3)。这段基因片段没有起始密码子、启动子和核糖体结合位点，保留了转录终止子和终止密码子。
实施例2重组表达质粒pKKCA1的构建
由中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室构建的质粒pKK235是一个长为4.6kb左右的大肠杆菌表达载体：它包含一个很强的trc启动子、NcoⅠ到HindⅢ的多克隆位点、lacZ核糖体结合位点AGGA和起始密码子ATG；为了避免不稳定的复制，在多克隆位点的下游紧接着一个强转录终止子rmBT1T2；该质粒带有β-内酰胺酶基因，因此具有氨苄青霉素抗性；该质粒的复制子是pBR322的ColE1复制子(图3)。用T4 DNA连接酶将2.3kb的酰化酶基因片段与EcoRⅠ和HindⅢ酶切后的质粒pKK235连接，得到的重组表达质粒命名为pKKCA1(图3)。在这个质粒中，酰化酶基因依靠大肠杆菌表达载体pKK235的trc启动子、起始密码子和核糖体结合位点以及自身的转录终止子和终止密码子而表达的。
实施例3获得基因工程菌JM109/pKKCA1
将大肠杆菌JM109{遗传特征为ndA1,recA1,gyrA96,thi,hsdR17(rK-,mK+)，relA1,supE44,Δ(1ac-proAB),[F’,traD36,proAB,lacIqZΔM15]}用氯化钙法(Sambrook,J et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York)制备成感受态细胞(转化率为106pfu)。把pKKCA1转化到该细胞中，得到的转化子命名为JM109/pKKCA1，即为本发明所指的基因工程菌株。培养至对数后期的工程菌用超声波(vibra-cell,Sonic & Materials,美国)破碎；工作、间歇各1分钟，功率80W，频率20KHz。测定破碎后的粗抽液的酰化酶活力，活力为每毫克蛋白3.5单位，远远高于改造前的含有重组表达质粒pMR24的基因工程菌株CU334的活力；而测得每克干菌体中则有2040单位的酶，远远高于GK16酰化酶菌株的产酶量(每克干菌体仅有200单位酶)。
实施例4从工程菌株JM109/pKKCA1中提纯GL-7ACA酰化酶
将JM109/pKKCA1按百分之一的量加入0.5升LB培养基(2升瓶)，在37℃以300转/分振荡12-16小时。将培养菌液4,000g离心10分钟，用裂解缓冲液(pH8.0,100mM磷酸钾，10mmol/L 7二胺四乙酸，5％甘油)洗涤菌体一次，菌体可以储存于-20℃(短期储存)或-70℃(长期储存)。
取6克湿菌体溶于30-40ml裂解缓冲液中，超声波脉冲破菌(vibra-cell,Sonic & Materials,美国)；工作、间歇各1分钟，功率80W，频率20KHz)。15,000g离心(Sorvall Instruments,Du Pont，美国)1小时，将上清液150,000g离心1小时后，施于用缓冲液A(pH8.0,50mmol/L磷酸钾，1mmol/L乙二胺四乙酸，0.01％β-巯基乙醇)平衡过的DEAE-Sepharose CL-6B(商品名，6％琼脂糖交联的DEAE树脂，Pharmarcia，瑞典)层析柱(2×15cm)，流速：每分钟1.0毫升。层析柱预先用缓冲液A平衡；上样后，首先用500毫升缓冲液A洗脱；然后用500毫升100-400mmol/L的氯化钠梯度洗脱；最后用200毫升1mol/L的醋酸钠(pH3.0)洗去柱上残留物。用含有100-400mmol/L氯化钠的缓冲液A梯度洗脱(见图4中的(A))。收集活力峰，PEG20000浓缩后用缓冲液B(pH8.0,5mmol/L磷酸钾，1mmol/L乙二胺四乙酸，0.01％β-巯基乙醇)透析。然后将酶液施于用缓冲液B平衡的HA-Ultragel(琼脂糖交联的羟基磷灰石，IBF Biotechnics，美国)层析柱(1×10cm)，该柱预先用缓冲液B平衡；上样后，首先用100毫升缓冲液B洗脱；然后用300毫升5-40mmol/L的磷酸钾梯度洗脱；最后用200毫升0.5mol/L的磷酸钾洗去柱上残留物。用含有0-40mmol/L氯化钠的缓冲液B梯度洗脱(见图4中的(B))。收集活力峰，PEG浓缩后用含有50％甘油的缓冲液B透析，成品酶液储存于-20C。
由于获得了高表达菌株，使得GL-7ACA酰化酶的纯化易于进行。以前由于酶的表达量低，分离纯化极为困难，需经一步硫酸铵分级沉淀和四步柱层析才能达到90％左右的纯度。本发明用高表达菌株，从6克湿菌体开始，在三天内纯化出40多毫克比活达12单位每毫克蛋白的GL-7ACA酰化酶。图5为表达产物GL-7ACA酰化酶纯化过程中的Tricine-SDS-PAGE分析图，由该图可以看出，纯化的改造后的酰化酶(图5中的第4泳道)由两个亚基组成，大小为54kD(β亚基)和16kD(α亚基)，与改造前的酶相同。
实施例5 GL-7ACA酰化酶酶活力的测定
酶活力单位(unit)定义为37℃、pH7.0时每分钟水解GL-7ACA产生1μmol的7-ACA所需要的酶量。酶的比活力定义为每毫克蛋白所具有的酶活力单位(unit/mg)。酶活力的测定参照Ichikawa等人的方法[Ichikawa S et al.Argric Biol Chem,1981；45:773]进行：反应体系为600微升，反应缓冲液为100mmol/L、pH7.0的磷酸钠缓冲液，底物的浓度为16mmol/L；加入适量的酶，于37℃保温20分钟；加入1.8毫升的终止液(20％冰醋酸：50mmol/L氢氧化钠=2∶1，体积比)终止反应；最后加入0.5％对二甲氨基苯甲醛(Merck公司，美国)的乙醇溶液显色；测定最终混合液在415纳米处的光吸收值，即可算出水解产物7-ACA的量。测定酶的动力学常数时，酶的浓度为1.44μmol/L，底物浓度从0.0625mmol/L到8.0mmol/L变化(0.0625,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0)，其他条件不变，由此测得改造后的酶的Km为0.48mmol/L,Vmax为10.2μmol/min/mg(图6)，与改造前的酶(Km为0.46mmol/L,Vmax为10.6μmol/min/mg)基本相同。这说明在酶的α亚基N-端改变几个氨基酸并不影响酶的活性。