抗血管生成的多肽 本发明涉及来自纤维蛋白原的具抗血管生成作用的多肽。
血管生成为从已有血管床出发的新血管发育，是一个复杂的多阶段过程，涉及到细胞外基质组分的降解，以及随后内皮细胞的迁移、增殖和分化以形成细管，并最终形成新血管。血管生成对以下正常生理进程是重要的，其中所述生理进程包括但不限于胚胎植入、胚胎发生和发育，以及伤口愈合。过度的血管生成也与如肿瘤细胞生长和非癌疾病等病理疾病相关，其中非癌疾病如新生血管性青光眼、类风湿性关节炎、银屑病和糖尿病性视网膜病。
血管内皮在一般情况下为静止的。但是在激活后，内皮细胞可增殖并迁移，形成微管，后者最终形成毛细血管床，用来将血液提供给发育中的组织，自然也提供给正在生长的肿瘤。目前已鉴定了一系列促进/激活内皮细胞进行血管生成的生长因子。这些生长因子包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGFb)、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)，以及血小板来源的生长因子(PDGF)(1，2)。
VEGF为具有非常特异的作用位点的内皮细胞特异的生长因子，即促进内皮细胞增殖、迁移和分化。VEGF为含有2条相同23kD多肽的二聚体复合物。VEGF的单体可以以四种不同分子量的多肽形式存在，其中每一种都来自于不同剪接的mRNA。在这四种单体形式中，两种以膜结合VEGF形式存在，两种为可溶的。多种细胞/组织类型都表达VEGF，包括胚胎组织、增生的角质细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞。研究(2)已显示：VEGF在许多种肿瘤细胞系中高表达，包括胶质瘤和AIDS相关的卡波西肉瘤。VEGF的活性通过内皮细胞和肿瘤细胞表达的VEGF特异性受体介导。事实上，在浸润肿瘤地内皮细胞上，VEGF受体上调，从而促进肿瘤细胞生长。
bFGF是一种刺激成纤维细胞和内皮细胞增殖的生长因子。bFGF为具16.5Kd分子量的单一多肽链。已发现了氨基末端区长度不同的几种bFGF分子形式。但这些不同分子形式的生物功能似乎是相同的。bFGF由垂体产生，并由位于人第4号染色体上的单一基因编码。
已发现了许多血管生成的内源性抑制剂，例如制管张素和内皮抑素(endostatin)，它们分别是通过对纤溶酶原和胶原XVIII进行蛋白酶剪切而形成的。这两种因子均已显示出可以抑制促血管生成(pro-angiogenic)的生长因子如血管VEGF和bFGF的活性。在体外，这两种因子均可抑制内皮细胞对VEGF和bFGF的应答，并能在动物模型中降低实验性肿瘤的血管形成和生长。
纤维蛋白原为纤维蛋白的可溶性循环前体，其为含有成对不同链(即α-、β-和γ-链)的二聚体分子。它们排列为三个分立的结构域，为两个外部的D-结构域和中央的E-结构域(4)。纤维蛋白原可被纤溶酶或凝血酶消化。
纤溶酶切割纤维蛋白原的第一步为对α-链C-末端结构域的切割。然后纤溶酶从一个E结构域(由通过二硫键结合在一起的α-、β-和γ-链的NH2末端组成)上切割下两个D结构域和多个较小的片段，包括小肽，β1-42(β-链的氨基末端)(5)。另一方面，凝血酶产生纤维蛋白单体和两个拷贝的血纤肽A和B(4)。已显示纤维蛋白原在实体瘤的渗漏血管周围聚积(5)，也已显示纤维蛋白原在宿主-瘤分界面聚合，以形成纤维蛋白网络，后者通过支持内皮细胞的粘附、迁移、增殖和分化而促进肿瘤血管生成(7)。
纤维蛋白E-片段(FnE-片段)由蛋白酶剪切纤维蛋白产生，在尿囊绒膜测试中刺激血管生成(8)。而且，存在于侵袭性乳腺癌中的该蛋白质的量与肿瘤血管供应的程度正相关(5)。
在我们的共同待决申请PCT/GB01/02079中，公开了一种有效的新型血管生成抑制剂，纤维蛋白原E，其为纤维蛋白原的50kDa蛋白酶解片段，所述申请在此引用作为参考。目前我们已在纤维蛋白原E片段中鉴定出一个结构域，所述结构域与较之大得多的纤维蛋白原E片段具有相同抗血管生成活性。该结构域位于α链的氨基端，并被称为α1-24。来自该结构域的多肽具有抗血管生成活性。我们也已鉴定了保留未修饰α1-24肽的抗血管生成活性的修饰α1-24肽。
根据本发明的第一个方面，提供了包含选自以下的氨基酸序列的多肽：
i)序列为ADSXEXXFLAEGGGVXXPXVVEXH的肽，其中X为任意的氨基酸残基；
ii)(i)中所表示的肽，其中氨基酸残基X选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸；和
iii)具有抗血管生成活性的在(i)或(ii)中表示的肽。
提及的抗血管生成活性可通过本文公开的试验测定。例如，本发明的多肽可以通过体外试验进行检测，所述试验包括对内皮细胞介导的细管形成的抑制、对内皮细胞迁移的抑制、对VEGF和bFGF诱导的内皮细胞增殖的抑制和内皮细胞毒性试验。多肽也可应用如本文公开的鼠肿瘤模型中进行体内试验。
在本发明一个优选的实施方案中，所述多肽包含选自以下的一段氨基酸序列：
A D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V E R H
A D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V E X H
A D S G E G D F L A E G G G V R G P X V V E R H
A D S G E G D F L A E G G G V R X P R V V E R H
A D S G E G D F L A E G G G V X G P R V V E R H
A D S G E G X F L A E G G G V R G P R V V E R H
A D S G E X D F L A E G G G V R G P R V V E R H
A D S X E G D F L A E G G G V R G P R V V E R H
A D S X E X D F L A E G G G V R X P R V V E R H
A D S G E G X F L A E G G G V R G P X V V E R H
在本发明进一步优选的实施方案中，所述肽包含的氨基酸序列中X为丙氨酸。
而在本发明再进一步优选的实施方案中，所述多肽包含氨基酸序列：
A D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V E R H
所提及的α1-24肽为具有以下序列的肽：
A D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V E R H，
或来自该序列的活性肽，此时所述序列已由加入、缺失或替换至少一个氨基酸残基进行了修饰。
在本发明优选的实施方案中，所述多肽的长度为至少24个氨基酸残基。该多肽优选地由氨基酸序列ADSGEGDFLAEGGGVRGPRVVERH，或其片段组成。
提及片段时是指来自α1-24肽并保留了抗血管生成活性的肽。此类片段的长度可为3个氨基酸；该片段的长度优选地为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基。
本领域的技术人员明了，对含α1-24的多肽的氨基酸序列进行修饰可增加多肽对其靶序列的结合和/或稳定性。此外，多肽的修饰也可增加多肽在体内的稳定性，由此减少抑制血管生成所需的有效多肽量。这将有利于减少可在体内产生的不期望的副作用。修饰包括，例如但不限于，乙酰化和酰胺化。
在本发明优选的实施方案中，包含α1-24序列的所述多肽进行了乙酰化。该乙酰化优选位于该多肽的氨基端。更优选地为α1-24肽氨基端的丙氨酸进行了乙酰化。
在本发明另一优选的实施方案中，包含α1-24序列的所述多肽进行了酰胺化。该酰胺化优选地位于该多肽的羧基端。更为优选地，酰胺化位于羧基端的组氨酸上。
在本发明另一优选的实施方案中，α1-24肽或其片段进行了乙酰化和酰胺化修饰。优选地，该乙酰化位于α1-24肽氨基端的丙氨酸上，而该酰胺化位于α1-24肽羧基端的组氨酸上。
对本领域的技术人员而言，显而易见的是，此处公开的α1-24肽的片段容易接受如乙酰化和/或酰胺化等修饰。
作为备选方案或优选地，所述修饰包括在含α1-24肽的多肽的重组或合成生产中应用修饰氨基酸。
本领域技术人员明了，修饰氨基酸包括但不限于4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、N6-乙酰基赖氨酸、N6-甲基赖氨酸、N6，N6-二甲基赖氨酸、N6，N6，N6-三甲基赖氨酸、环己基丙氨酸、D-氨基酸、鸟氨酸。其他修饰包括具有C2、C3或C4烷基R基团的氨基酸，所述基团任选地被1、2或3个取代基取代，所述取代基选自卤素(如F、Br、I)、羟基或C1-C4烷氧基。
在本发明另一优选的实施方案中，提供了根据本发明的多肽，所述多肽包含至少一个修饰氨基酸，其中X代表该修饰氨基酸的位置。
修饰氨基酸的掺入可使含α1-24的多肽具有有利的性质。例如，修饰氨基酸的掺入可增强多肽与其结合位点的亲和性，或修饰氨基酸可增加多肽的体内稳定性，由此使得可以降低施与患者的治疗多肽的有效量。
对本领域的技术人员而言显而易见的是，保留抗血管生成活性的α1-24片段可通过应用如蛋白水解酶对完整的多肽进行裂解而获得。作为备选方案，片段可从头进行合成，并经如环化进行修饰。环化在本领域是公知的(见Scott等，Chem Biol(2001)，8：801-815；Gellerman等J.PeptideRes(2001)，57：277-291；Dutta等J.Peptide Res(2000)，8：398-412；Ngoka和Gross，J Amer Soc Mass Spec(1999)，10：360-363)。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的多肽进行了环化修饰。
根据本发明的再一个方面，提供了包含选自以下的DNA序列的核酸分子：
i)如图5a中所示的DNA序列；
ii)如图5a中所示的DNA序列，但此时该序列已通过在至少一个密码子中加入、缺失或替换至少一个核苷酸减基进行修饰以编码根据本发明的修饰肽；
iii)与图6中所示编码具有抗血管生成活性的肽的序列杂交的DNA序列；和
iv)由于遗传密码而与(i)、(ii)或(iii)中所定义的DNA序列简并的DNA序列。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供可以与以上(i)、(ii)、(iii)和(iv)中所描述的序列在严格的杂交条件下发生退火的分离的核酸分子。
严格的杂交/洗涤条件在本领域内是熟知的。例如核酸杂交体在0.1xSSC、0.1％SDS中60℃洗涤后为稳定的。本领域熟知，如果核酸序列已知的话，可计算最佳杂交条件。杂交条件一般应用4-6xSSPE(20xSSPE为每升含溶解的175.3g NaCl、88.2g NaH2PO4 H2O和7.4g EDTA，且pH值调整到7.4)、5-10x Denhardts溶液(50x Denhardts溶液含5g Ficoll(Type 400，Pharmacia)、5g聚乙烯吡咯烷酮及5g牛血清白蛋白)、100μg-1.0mg/ml超声降解的鲑鱼/鲱鱼DNA、0.1-1.0％十二烷基硫酸钠；任选的40-60％去离子甲酰胺。杂交温度根据核酸目标序列的GC含量有所变化，但一般在42℃-65℃之间。
根据本发明的再一个方面，提供了含α1-24肽或其部分的药物组合物。
施用时，本发明的药物组合物可以以可药用制剂的形式施用。此制剂可例行包括可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、兼容载体、辅助的免疫增强剂(如佐剂和细胞因子)和任选地其他治疗剂，如化疗剂。
本发明的药物组合物的施用可通过任何常规途径进行，包括注射或延时逐渐输注。施用途径可为如口服、静脉内、腹膜内、肌内、腔内、皮下或经皮。
本发明的组合物以有效量施用。“有效量”为单独或与其他药剂联合应用时产生所需反应的组合物量。在治疗特定疾病如癌症时，所需的反应为抑制疾病的发展。这可能涉及临时减慢疾病的进程，但更优选涉及永久地终止疾病的进程。这可通过常规方法进行监控。
当然，此量将取决于进行治疗的特定疾病、疾病的严重程度、病人的个体参数(包括年龄、体质、身高和体重)、治疗的持续时间、同时进行的治疗的性质(如果有)、给药的具体途径，以及属于健康从业者知识和技能范围内的类似因素。这些因素为本领域的普通技术人员所公知，并可使用常规实验确定。
用于前述治疗方法的药物组合物优选为无菌的，且在适于给患者施用的单位重量或体积内含有能引起所需反应的有效量的α1-24肽或编码α1-24肽的核酸。
给个体施用的α1-24肽或编码α1-24肽的核酸的剂量可根据不同的参数进行选择，特别是可以根据施用的方式和个体的状态进行选择。其他因素包括所期望的治疗期。在起始施用剂量不能在个体内产生足够的反应时，可在病人耐受程度容许的范围内应用更高的剂量(或通过不同的、更为局部的施用途径获得的有效更高剂量)。
给药时，本发明的治疗制剂以治疗上可接受的量和可药用组合物的形式施用。术语“可药用”指不干扰活性成分的生物活性效力的无毒材料。该制剂一般可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、兼容载体和任选的其他治疗剂。当用于医用时，盐应为可药用盐，但由于非可药用盐可方便地用于制备其可药用盐，故不应排除在本发明的范围之外。
如果需要，α1-24肽组合物可与可药用载体结合。此处应用的术语“可药用载体”指适于施用给人类的一种或多种兼容的固体或液体填充剂、稀释剂或形成胶囊的物质。术语“载体”指有机的或无机的、天然或合成的成分，活性成分与之结合将有利于应用。
药物组合物可含有适宜的缓冲剂，包括：乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。
优选地，药物组合物也可包括适宜的防腐剂，如：苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟苯甲酸酯和硫柳汞。
药物组合物可方便地以单位剂量形式呈现，且可通过制药领域公知的任何方法进行制备。所有的方法都包括将活性剂与载体结合的步骤，所述载体构成一个或多个辅助成分。一般而言，组合物制备时使活性成分与液体载体、细碎的固体载体或二者均一地且密切地结合，然后需要时，将产物成形。
适于口服给药的组合物可以以离散单位的形式呈现，如胶囊、片剂、锭剂，各单位含有预定量的活性成分。其他组合物包括在水性溶液或非水性溶液中的悬浮物如糖浆、酏剂或乳剂。
适于肠胃外给药的组合物方便地包括α1-24肽或核酸的无菌水性或非水性制剂，该制剂优选与接受者的血液等渗。该制剂可通过已知的方法应用合适的分散剂或润湿剂或悬浮剂进行配制。无菌注射制剂也可以为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，如1，3-丁二醇中的溶液。可应用的可接受的赋形剂和溶剂有水、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油可方便地用作溶剂或悬浮介质。为此，可应用任何温和的不挥发油，包括合成的单或双甘油酯。此外，脂肪酸(如油酸)可用于注射剂的制备。
适于口服、皮下、静脉内、肌内等施用途径的载体制剂可在Remington药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack出版公司，Easton，PA)中查询。
在本发明优选的实施方案中，所述药物组合物调节血管生成。该调节优选地为抑制血管生成。该抑制优选涉及内皮细胞激发的血管生成。
作为备选方案，或优选地，所述抑制为对巨噬细胞和/或肿瘤细胞所激发的血管生成的抑制。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述抑制作用通过对促血管生成因子的抑制来介导。理想的情况是这些因子是细胞内或细胞表面的受体。
更优选地，所述抑制作用通过抑制促血管生成的生长因子的活性来介导。该生长因子理想地选自：VEGF、bFGF、aFGF、TGFβ、PDGF。
而根据本发明再一方面，提供了含α1-24肽或其部分的多肽在癌症治疗药剂的生产中的应用。
含α1-24肽的多肽可应用标准的肽合成技术通过体外肽合成进行生产。作为备选方案，或优选地，多肽可通过本领域公知的重组技术生产。
根据本发明再一方面，提供了载体，其中该载体含有编码含α1-24肽的多肽的核酸分子。
作为备选方案，可以使含有编码如下多肽的核酸的载体适应重组表达，其中所述多肽包含α1-24肽。
在本发明优选的实施方案中，所述载体为适应于原核或真核细胞表达的表达载体。优选使该真核载体适应于基因治疗。
所述适应一般包括，例如但不限于，提供介导细胞/组织特异性表达的转录调控序列(启动子序列)。这些启动子序列可为细胞/组织特异的，诱导型的或组成型的。
启动子为本领域认可的术语，为清楚起见，其包括下列仅以举例方式而非限制性方式举出的特性。增强子元件为顺式作用核酸序列，通常位于基因转录起始位点的5’端(增强子也可位于基因序列的3’端或甚至位于内含子序列中，因此是不依赖位置的)。增强子的作用是提高与增强子连接的基因的转录速率。增强子的活性将对如下反式作用转录因子(多肽)起反应，其中所述反式作用转录因子显示出能特异性地与增强子元件结合。而转录因子的结合/活性(请参见真核转录因子(Eukaryotic TranscriptionFactors)，David S Latchman，Academic Press Ltd，San Diego)对许多环境信号起反应，其中所述环境信号包括但不限于中间代谢物、环境效应物。
启动子元件也包括所谓的TATA盒和RNA聚合酶起始选择(RIS)序列，其作用在于选择转录起始位点。这些序列也与多肽结合，而此多肽尤其起促进RNA聚合酶进行转录起始选择的作用。
适应也包括提供选择标记和自主复制序列，它们均利于所述载体在真核细胞或原核宿主中的维持。自主维持的载体称为游离型载体。
有利于载体编码基因实现表达的适应包括提供转录终止/聚腺苷酸化序列。这还包括提供内部核糖体进入位点(IRES)，其作用在于使以双顺反子或多顺反子表达盒排列的载体编码基因的表达得以最大化。
这些适应为本领域熟知的。有大量的关于一般性的表达载体构建和重组DNA技术的公开文献。请参见Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约及其中的参考文献；Marston，F(1987)DNA克隆技术：实用方法卷III(DNA Cloning Techniques：A Practical Approach Vol III)IRLPress，英国牛津；DNA克隆(DNA Cloning)：F M Ausubel等，分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
而在本发明另一优选的实施方案中，提供了包含根据本发明的核酸的基因治疗载体。
对本领域的技术人员而言显而易见的是，将基因治疗载体向内皮细胞或肿瘤细胞递送可以使含α1-24肽的多肽定向在肿瘤附近产生，由此提高含α1-24的多肽的抗血管生成效应。
而根据本发明再一方面，提供了用根据本发明的核酸转化/转染的细胞。理想的情况是，该核酸为根据本发明的载体。
根据本发明的再一方面，提供了用于生产含α1-24的多肽的方法，包括：
i)提供根据本发明的细胞；
ii)提供利于包含α1-24的多肽生产的条件；和
iii)从细胞或细胞培养环境中纯化出该多肽。
而根据本发明的再一方面，提供了非人转基因动物，其特征为该动物的基因组中掺入了编码包含α1-24的多肽的核酸分子。
对本领域的技术人员而言显而易见的是，通过提供编码包含α1-24的多肽的转基因遗传修饰的非人转基因动物可以用作活性多肽的备选来源。转基因动物可用于生产各种治疗性多肽，这在本领域是公知的。
在本发明优选的实施方案中，所述转基因为人源的。
在本发明的再一方面，提供了治疗可受益于抑制血管生成的动物的方法，该方法包括：
i)对待治疗的动物施用有效量的含有α1-24的药剂；
ii)监测该药剂的血管生成抑制效果。
在本发明优选的方法中，所述治疗为抑制肿瘤的发展。
在一个备选治疗方法中，含α1-24的多肽进一步与可增强多肽的抗血管生成效应的药剂缀合、结合或交联。
一般地，此药剂可为细胞毒性剂、另一种抗血管生成剂、前药活化酶、化疗剂、促凝血剂(pro-coagulant)或免疫调节因子。
这些药剂的实例在本领域内是熟知的，例如但不限于细胞毒素诸如蓖麻毒素A-链或白喉毒素；肿瘤中重要的促血管生成因子(如VEGF、bFGF、TNFα、PDGF)的拮抗剂，包括这些因子的中和抗体或受体、或它们的受体的酪氨酸激酶抑制剂(如针对VEGF受体的SU5416，Flk-1/KDR)；前药活化酶如人单纯疱疹病毒-胸苷激酶HSV-TK，当前药丙氧鸟苷全身施用后，HSV-TK将活化前药丙氧鸟苷；化疗剂如新制癌素、顺铂、碳铂、环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、巯基嘌呤、道诺霉素、阿霉素、表阿霉素、长春碱、长春新碱、放线菌素D、丝裂霉素C、紫杉酚、L-天冬酰胺酶、G-CSF、enediyne如chalicheamicin或埃斯波霉素、苯丁酸氮芥、ARA-C、长春碱酰胺、博来霉素和表鬼臼毒吡喃葡萄糖苷。
此外，或备选地，还可以使人类组织因子的细胞表面结构域(即，组织因子的截短形式(tTF)与α1-24结合。当截短的TF游离于循环中时，具有有限的抗内皮活性，但当它靶向肿瘤内皮细胞表面时，则成为有效的和选择性的凝血酶原(即它在血管内引起广泛的血栓形成和凝血)。
免疫调节因子的一个示例为人类IgG1的Fc效应结构域。其结合自然杀伤(NK)细胞，且还结合启动补体级联效应的C1q蛋白。然后NK细胞和补体可激活强大的靶向内皮细胞的溶细胞反应。
显然，α1-24和治疗剂的上述组合也将有益于治疗依赖于血管生成的其它病症/疾病。例如，新生血管性青光眼、类风湿性关节炎、银屑病和糖尿病性视网膜病。
而在另一备选治疗方法中，所述基因治疗载体包括编码增强α1-24抗血管生成效应的药剂的核酸，因此同时提供了编码该药剂的核酸和所述编码含α1-24的多肽的核酸。
而根据本发明的再一方面，提供了包含α1-24的显象剂。
本领域熟练技术人员明了，可以利用包含α1-24的多肽将显象剂靶向如肿瘤以确定发展中的肿瘤或监测抑制肿瘤生长的治疗效果。而且，显而易见的是，包含α1-24且还包含其它抗血管生成剂的联合治疗组合物也可与显象剂结合以监测联合治疗组合物的分布和/或监测所述的联合组合物的功效。
用于检测显象剂的方法在本领域内是熟知的，包括但不限于FI8和C11化合物的正电子发射断层摄影术检测。
现在将仅通过实施例并参考下图描述本发明的实施方案：
图1显示纤维蛋白原E的α-β-γ-多肽的核酸和氨基酸序列；
图2比较了纤维蛋白原E片段(A图)和纤维蛋白E片段(B图)对体外HuDMEC引起的细管形成的影响。其中显示了缺乏(空白条)或存在(有色条)VEGF或bFGF时细管形成所覆盖的平均(±SEM)面积。每个试验条件在三个重复孔内进行，每个孔在三个随机挑选的视野内测量总面积(n＝9)。*与相应的对照组相比p＜0.005；
图3表示的示意图显示了抗血管生成纤维蛋白原E片段(A)和促血管生成纤维蛋白E片段(B)之间的结构差异。唯一的差异为存在(纤维蛋白原E-片段)或不存在(纤维蛋白E-片段)16个氨基酸的纤维蛋白肽A；
图4显示了在缺乏或存在VEGF或bFGF时，α1-24(β-转角)在体外对SVEC4-10细胞引起的细管形成的影响。上图(A)：缺乏外源性因子(对照)(I)，或存在100nMα1-24(II)、10ng/ml VEGF(III)或10ng/mlVEGF+100nMα1-24时，在减少GF的Matrigel试验中的细管形成(×40物镜)。下图(B)：在缺乏(空白条)或存在(阴影条)VEGF或bFGF时，细管形成的平均(±SEM)面积。n＝9，*与相应的对照组相比p＜0.03；
图5A为编码α1-24肽的核酸序列；图5B为α1-24肽的线性氨基酸序列和各种修饰的α1-24肽的氨基酸序列；
图6说明未修饰的α1-24肽对小鼠的肿瘤生长的体内效应。每日注射(腹膜内)25μg/kg溶于PBS的α1-24肽或仅注射PBS(对照)对CT26肿瘤在Balb/c小鼠中的生长的影响，(数据来自两次单独的实验)；
图7比较了23位精氨酸的丙氨酸替换物(R23A)、α1-24对照肽和截短的α1-24(第17-24位氨基酸)的抗血管生成活性；
图8表示丙氨酸替换的α1-24肽(G4A、G6A、G17A)的抗血管生成活性；
图9表示丙氨酸替换的α1-24肽(D7A和R19)和(R16A)的抗血管生成活性；
图10表示末端修饰(乙酰化和酰胺化)的α1-24肽的抗血管生成活性。末端修饰(TMa)对α1-24肽在HuDMEC引起的体外细管形成中的抑制效应(存在或不存在10ng/ml VEGF)的影响；和
图11表示更大浓度范围的α1-24肽对HuDMEC引起的体外细管形成的影响(存在或不存在10ng/ml VEGF)。
材料和方法
成人皮肤微血管内皮细胞(HuDMEC)来自市售(TCS Biologicals，Buckinghamshire，英国)并培养于含肝素(10ng/ml)、氢化可的松、人表皮生长因子(10ng/ml)、人成纤维细胞生长因子(10ng/ml)(此类内皮生长因子对于HuDMEC在培养中的常规传代是必需的)和双丁酰环AMP的微血管内皮细胞生长培养基(EGM)中。对其补充5％热灭活的FCS，50μg/ml庆大霉素和50ng/ml两性霉素B(TCS Biologicals，英国)。鼠内皮细胞(SVEC4-10)从ATCC获得，且培养在DMEM+10％FCS中。细胞在具5％CO2气相的100％潮湿的培养箱中37℃生长，并常规甄别支原体。在用于下列测试前，HuDMECs生长至80％汇合，在DMEM+1％FCS中培养2h，然后用0.05％胰蛋白酶溶液收获，洗涤两次并以各试验所需的细胞密度重悬(见以下)。
蛋白质和肽
人纤维蛋白原(Fgn)E-片段购自Diagnostica Stago，Asnieres，法国。该产品通过纤溶酶切割纤维蛋白原产生，并通过电泳、免疫电泳、离子交换和凝胶过滤进行纯化。为产生人纤维蛋白(Fn)E-片段，如已前所述(10)用人凝血酶(Sigma-Aldrich Co，Dorset，英国)消化纤维蛋白原E-片段。为了控制FnE片段制品中痕量凝血酶对我们的测试实验的可能影响，向使用FnE-片段的实验中所用的对照培养基中加入相同量的凝血酶(0.5U/ml)。HPLC-纯化的FpA购自Bachem Ltd，Saffron Walden，UK。在研究中包括该肽是因为该肽在FnE生产中从Fgn E-片段上切下，并将以痕量存在于试验中。β-转角(α1-24)应用FMOC氨基酸和合成机器通过标准的肽合成方法产生。肽的纯度由质谱法确认。
细管(tubule)形成试验
用30μl/孔减少生长因子的(减少GF的)Matrigel(Becton DickinsonLabware，Bedford，MA)包被24孔板。铺于该基质上的内皮细胞如先前(14)描述的那样在铺板的6h内迁移并分化为细管。HuDMECs或SVEC4-10细胞以4×104个细胞/ml的密度接种，在存在或缺乏纤维蛋白原E-片段、纤维蛋白E-片段、FpA或α1-24时，于500μl仅DMEM+1％FCS(对照)，或该培养基±10ng/ml VEGF或bFGF中孵育6h。细管形成的评估涉及到将细胞制备物在70％乙醇中，于4℃固定15分钟，在PBS中漂洗，并用苏木精和伊红染色。对每个试验条件，在低倍镜下(×40放大)观察3个重复孔中的三个随机视野，并用与奔腾III计算机相连的富士数码相机(包含帧接收板)捕捉彩色影像。用Scion Image提供的图像分析软件通过计数每一视野中的细管分支数和细管覆盖的总面积来评定细管形成。
迁移试验
对博伊登室(Boyden chamber)技术(13)进行适当修改并用于评估HuDMEC沿VEGF(10ng/ml)或bFGF(10ng/ml)浓度梯度跨多孔膜的迁移。使用Neuro Probe 48孔微趋化室(Neuro Probe Inc，Cabin John，MD)和包被有100μg/ml IV型胶原的8μm孔径的聚碳酸酯膜(Neuro Probe Inc，Cabin John，MD)。将10ng/ml VEGF或bFGE单独或与不同浓度的纤维蛋白原E-片段、纤维蛋白E-片段、FpA或α1-24溶于DMEM+1％FCS，并置于较下的孔中。然后将胶原包被的膜置于其上，并在较上的室中加入50μl 25×104个HuDMECs/ml(在含1％FCS的DMEM中)。然后将这些室37℃孵育4.5h。然后拆卸这些室，取出膜，将未迁移细胞从上表面刮下。下表面上的迁移细胞用甲醇固定，用Hema‘Gurr’快染试剂盒(Merck，Leics，英国)染色，并用光学显微镜(×160放大)对每孔3个随机视野中的细胞计数。每一试验条件进行3-6个重复孔，且每一实验重复三次。
增殖试验.
如以前所述(12)用MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓)测试法评估在缺乏或存在纤维蛋白原E-片段、纤维蛋白E-片段、FpA或α1-24时VEGF或bFGF诱导的HuDMEC增殖。HuDMEC以3×103个细胞/100μl接种在96孔微滴定板的DMEM+1％FCS±10ng/mlVEGF或bFGF试验溶液中，放置4.5和6h。在这些时间点上，向每孔加入四分之一体积的MTT溶液(2mg MTT/ml PBS)，并将每块板37℃孵育4h，产生不溶的紫色甲产物。将培养基吸出并将沉淀物在pH10.5下溶于100μl DMSO缓冲液。然后在Dynex ELISA板读取仪上于540nm处读取光吸收值。
细胞毒性试验
在缺乏或存在纤维蛋白原E-片段、纤维蛋白E-片段、FpA或α1-24时，将HuDMEC以每孔1-2×105个细胞的密度接种于24孔板中。6h后，收获活的(通过胰蛋白酶消化脱落后)和死的(漂浮的)细胞，对每次处理的三重样品中的每一个样品，所存在的全部细胞的细胞成活力使用碘化丙锭对5000个细胞染色，用配备有15mW蓝色激光激发器的FACScan(BectonDickinson)在488nm处评估。收集数据并用Cell Quest软件(BectonDickinson)分析。
α1-24肽的体内功效
实验用体重为15g的六周龄Balb/C小鼠进行，小鼠购自Sheffield FieldLaboratories。所有实验均得到Home Office Project Licence NumberPPL50/1414批准。
肿瘤细胞培养
CT26细胞系在含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的Dulbecco′s极限Eagles培养基中体外传代维持，并于37℃维持在含5％CO2的潮湿空气中。常规检查细胞系以确保其无支原体(支原体快速检测系统，Gena-ProbeIncorporated，美国)。
皮下肿瘤植入
动物通过腹腔内注射1∶1比例的安定(0.5mg/ml，Dumex Ltd.)和hypnorm(柠檬酸芬太尼0.0315mg/ml和氟丁酰酮1mg/ml，JanssenPharmaceutical Ltd.)麻醉，注射体积为0.1ml/200g体重，需要时进行补充以维持足够的麻醉。首次用于实验的Balb/c小鼠去毛后，右侧面皮下免疫。肿瘤细胞的注射浓度为每个动物注射悬浮在100μl无血清培养基中的3×105个活CT26细胞。然后使动物恢复。每天监测肿瘤生长和动物体重。
肽α1-24的施用
每日测定肿瘤生长，当该群动物中的大多数动物的肿瘤体积＞100mm3且＜350mm3时，将动物分成实验组和对照组。这在植入肿瘤细胞悬液后的14至18天之间发生。然后给动物腹腔内(i.p.)注射活性药物(α1-24肽100mM；100μl)或赋形剂(磷酸缓冲盐水，100μl)。继续每日注射，直至对照动物的肿瘤生长达到Home Office法规允许的最大荷载量。
肿瘤生长的评估
通过卡尺测定垂直直径并用下列等式估计体积来评价肿瘤体积：
体积＝(a2×b)/2
其中a为较小的直径，b为较大的直径。
每日称量动物体重，并监测总体健康状况。
统计分析
所有实验至少进行三次，并使用Mann-Whitney U检验分析数据，其中所述Mann-Whitney U检验是不设定所分析的数据为高斯分布的非参数检验。认为P≤0.05为具显著性。
可观察到在缺乏外源刺激时GF减少的Matrigel中内皮细胞延伸并开始形成细管，但应当指出在此基质中存在残余水平的生长因子。该试验因此用作分化(血管生成路径中的主要步骤之一)模型。随后的细管形成通过细管所覆盖的面积来测量，但分支的数目产生类似的图形(数据未显示)。在此试验系统内向培养基中加入VEGF(10ng/ml)或bFGF(10ng/ml)时，此分化活动显著增强(p＜0.001)。向此系统中加入α1-24(β-转角)显著(p＜0.03)降低了存在或不存在生长因子时的细管形成，如在图4中所示。
从图4中显示的结果可得出结论，肽α1-24含有纤维蛋白原E-片段的活性部位。与具有更复杂的多肽结构的纤维蛋白原E-片段相比，24氨基酸的肽可能具有更大的治疗用途，因为前者的制备需剪切源于血液的纤维蛋白原。相比而言，α1-24为较小的肽，可通过合成或重组技术制备。将其用作基因治疗方案的一部分以治疗癌症或其他依赖血管生成的疾病也是可能的。我们因此测定了α1-24肽的体内功效。
α1-24肽的体内功效
实施例1
实验动物(n＝6)每日腹腔内施用α1-24且对照动物(n＝7)腹腔内施用赋形剂。肿瘤的初始体积在两组动物中相似(实验组/对照组，235±30mm3/198±28mm3)。对照组的肿瘤在14天中继续以稳定的速率生长，并达到终肿瘤体积2245±371mm3。相反，实验组动物的肿瘤在第4天前以相似的速率生长，此后生长减慢。继而在第7天继续以和对照组相似的速率生长，但具有较小的体积。到第10天时肿瘤生长再次稳定直到第14天，肿瘤的终体积为1341±145mm3(p＜0.001)。
实施例2
实验组动物(n＝7)每日腹腔内施用α1-24，且对照组动物(n＝7)腹腔内施用赋形剂。肿瘤的初始体积在两组动物中相似(实验组/对照组，338±39mm3/300±65mm3)。对照组的肿瘤在12天中持续以稳定的速率生长，并达到终肿瘤体积3072±225mm3。相反，实验组动物的肿瘤以和对照组相似的速率生长至第7天，然后肿瘤稳定生长直到第12天处死动物时，肿瘤的终体积为2029±504mm3(p＜0.001)。
该数据(见图6)由此显示了肽α1-24作为体内抗血管生成剂的潜力。此外，α1-24的肽变体显示了与未修饰的α1-24相似的抑制活性，见图7-9。而且，α1-24的乙酰化和酰胺化修饰不影响抗血管生成作用。
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