一种从桉属植物提取的化合物及其用途 【技术领域】
本发明涉及一种从桉属植物中提取的三环倍半萜类化合物，含有该化合物的药物组合物，及其在治疗肿瘤方面的应用。
背景技术
桉属植物为桃金娘科植物的一个主要属种，原产澳州，从1890年开始引入国内，目前在我国已有大规模种植，成为我国3大造林树种之一。
蓝桉是桉属植物中的一个主要成员，又名灰杨柳、玉树、小球桉树、蓝油木、杨草果树。
桉属植物原有主要用途如下：其茎、枝可用于做木材、枕木、包装材料和造纸，从其叶中提取出的桉叶油可用于香料生产和医药用途中，用于医药用途中的桉叶油多为蓝桉叶油。
已有报道表明蓝桉叶油具有抗多种细菌的作用，能抑制金黄色葡萄球菌及副伤寒杆菌的氧消耗及其琥珀脱氢酶活性，其浓度在6％以上时还具有抗结核杆菌的作用。临床上通过抑菌实验，发现蓝桉叶油有抑菌能力，其对呼吸道感染，特别是对上呼吸道感染、慢性支气管炎，具有较好疗效，可有效祛痰。通过吸入和气管滴入两法应用时，对治疗肺结核病人有令人满意的效果。在消除常见症状，尤其是空洞闭合上似较其它抗痨药物为佳。蓝桉叶油也可用于某些皮肤病，并作为创伤面、溃疡、瘘管的冲洗剂、除臭剂及神经病患者的镇痛药。此外蓝桉叶油也常用于十滴水、清凉油、风油精、驱蚊油、止咳药等。民间也有用蓝桉果实(俗名：一口钟)煎服治疗感冒、哮喘、跌打损伤及真菌引起的皮肤病等疾病的治疗，效果不错。
早先的研究发现，桉属植物的提取物中含有抗肿瘤活性较好的总三萜类化合物(ETA)，所提取出的ETA的主要成份有四种，其分别为：熊果酸、白桦脂酸、白桦脂酮和2-羟基熊果酸。它们都有较好的抗肿瘤作用。
然而，目前为止对桉属植物中地有用化合物的研究还不充分。因此本领域迫切需要开发桉属植物的有药用价值的新物质。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种具有药用价值的，来自桉属植物的三环倍半萜类化合物。
在本发明的第一方面，提供了一种式I的三环倍半萜类化合物或其药学上可接受的盐
所述的三环倍半萜类是从桉属植物中提取的，其分子式为C28H42N2O9，分子量为550.29。所述化合物具有抑制以下细胞株生长的活性：Huh-7人肝癌细胞株、Du-145人前列腺癌细胞株、K562人白血病细胞株、AGS人胃癌细胞株、或Eca-109人食管癌细胞株、786-0人肾癌细胞株、A549人肺癌细胞株、CS-174-T人结肠癌细胞株。
在另一优选例中，所述的化合物用包括以下步骤的提取方法制备的：
(a)用95±3％乙醇提取桉属植物的果实、叶或枝，得到乙醇浸膏；
(b)取乙醇浸膏，先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯相；
(c)对步骤(b)的乙酸乙酯相，在硅胶柱上，用梯度为10∶1至2∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，收集石油醚∶乙酸乙酯为2∶1的洗脱组分；
(d)对步骤(c)的洗脱组分进行浓缩，得褐红色粘稠状物质；
(e)将步骤(d)的浓缩物上Sephedex LH-20柱子，用甲醇洗脱，收集洗脱组分；
(f)将步骤(e)的洗脱组分，上Sephedex LH-20柱子，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脱，收集洗脱组分
(g)浓缩干燥，得到淡黄色粉末；
(h)用甲醇进行重结晶，得到三环倍半萜类化合物沉淀。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明所述的三环倍半萜类化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
在本发明的第三方面，提供了本发明所述的三环倍半萜类化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。较佳地，所述的肿瘤包括肝癌、前列腺癌、白血病、胃癌、食管癌、肾癌、肺癌及结肠癌。
在本发明的第四方面，提供了一种制备三环倍半萜类化合物的方法，包括以下步骤：
(a)用95±3％乙醇提取桉属植物的果实，得到乙醇浸膏；
(b)取乙醇浸膏，先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯相；
(c)对步骤(b)的乙酸乙酯相，在硅胶柱上，用梯度为10∶1至2∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脱剂进行洗脱，收集石油醚∶乙酸乙酯为2∶1的洗脱组分；
(d)对步骤(c)的洗脱组分进行浓缩，得褐红色粘稠状物质；
(e)将步骤(d)的浓缩物上Sephedex LH-20柱子，用甲醇洗脱，收集洗脱组分；
(f)将步骤(e)的洗脱组分，上Sephedex LH-20柱子，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脱，收集洗脱组分
(g)浓缩干燥，得到淡黄色粉末；
(h)用甲醇进行重结晶，得到三环倍半萜类化合物沉淀。
在另一优选例中，所述的桉属植物是蓝桉。
在本发明的第五方面，提供了一种保健品，它含有0.05-10wt％的式I化合物和食品上可接受的载体。
【附图说明】
图1显示了TMAO及两种阳性药物对Huh-7人肝癌细胞株的抑制作用。
图2显示了TMAO及两种阳性药物对Du-145人前列腺癌细胞株的抑制作用。
图3显示了TMAO及两种阳性药物对K562人白血病细胞株的抑制作用。
图4显示了TMAO及两种阳性药物对AGS人胃癌细胞株的抑制作用。
图5显示了TMAO及两种阳性药物对Eca-109人食管癌细胞株的抑制作用。
图6显示了TMAO及两种阳性药物对786-0人肾癌细胞株的抑制作用。
图7显示了TMAO及两种阳性药物对A549人肺癌细胞株的抑制作用。
图8显示了TMAO及两种阳性药物对CS-174-T人结肠癌细胞株的抑制作用。
【具体实施方式】
本发明人经过深入研究，发现在蓝桉果实提取物的抗肿瘤作用中，总三萜类化合物只作出了部分贡献。另外的贡献来自于一种在蓝桉果实中提取到的新的三环倍半萜类化合物：1，1，4，7-四甲基-7-[3-甲基-1-[4，5，6-三羟基-4，6-二(2-氧代乙酰基)-2-氧代六氢嘧啶-5-基]-丁基]-十氢-环丙并[e]薁-4-醇，简称TMAO。在此基础上完成了本发明。
本发明的化合物可从各种桉属植物中提取出，例如蓝桉、大叶桉、柠檬桉、斑皮桉、窿缘桉、柳叶桉、毛叶桉、尾叶桉、布氏桉、广叶桉、粗皮桉、细叶桉或刚果桉。该化合物在桉属植物中的提取部位为植物的枝、叶或果实部位。尤其是果实部位。
本发明的化合物可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸和马来酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。
本发明还包括药物组合物以及治疗方法，它包括给哺乳动物施用药物有效量的本发明化合物。
本发明的三环倍半萜类化合物可用于治疗肿瘤。代表性的例子包括(但并不限于)：肝癌、前列腺癌、白血病、胃癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌等。
当化合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约2.5-90％，通常约为5％-60％(重量)的活性成分。
所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.5-500mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为1-100mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体混合的约0.5-500mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明的化合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下途径给药。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。化合物的口服给药是优选的。
这些活性化合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物生长。
适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。
在使用本发明化合物治疗肿瘤时，还可与其他肿瘤手段(如放疗)或其他治疗剂(如TNFα等)联用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：
从桉属植物中提取出新化合物
A.从蓝桉果实中提取
按以下步骤提取：
1、取已粉碎药材(蓝桉果实，俗名一口钟)，先用95％乙醇常温提取两周，回收乙醇溶液得乙醇浸膏。
2、取乙醇浸膏，先用石油醚提取，再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯溶剂得乙酸乙酯部位。
3、取乙酸乙酯部位适量，上硅胶柱分离。洗脱梯度为石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1
4、收集石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1所洗脱部位，浓缩得褐红色粘稠状物质。取此物质上Sephedex LH-20柱子，用甲醇洗脱，每20ml收集一次，经薄层鉴别后，合并富集后的几管收集液。
5、取富集后的收集液，再次上Sephedex LH-20柱子，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脱，每20ml收集一次，经薄层鉴别后，合并斑点较深的相同收集液(略含其它杂质斑点)。浓缩此收集液，再次上Sephedex LH-20柱子，用氯仿∶甲醇＝1∶1洗脱，每20ml收集一次，经薄层鉴别后，合并斑点相同收集液，浓缩后得淡黄色粉末。
6、取此淡黄色粉末，用甲醇重结晶。放置一周后，有沉淀析出。过滤得略带淡黄的透亮物质。
7、经结构确认该化合物为三环倍半萜类化合物，结构式为
分子式：C28H42N2O9
分子量：550.29
命名为：1，1，4，7-Tetramethyl-7-[3-methyl-1-[4，5，6-trihydroxy-4，6-di(2-oxo-acetyl)-2-oxo-hexahydro-pyrimidin-5-yl]-butyl]-decahydro-cyclopropa[e]azulen-4-ol
1，1，4，7-四甲基-7-[3-甲基-1-[4，5，6-三羟基-4，6-二(2-氧代乙酰基)-2-氧代六氢嘧啶-5-基]-丁基]-十氢-环丙并[e]薁-4-醇
以下将该新三环倍半萜类化合物简称为TMAO。
B.从蓝桉叶提取
重复A中的步骤，不同点在于用粉碎的蓝桉叶替换蓝桉果实，结果同样获得了TMAO。只是TMAO在叶子中的含量低于果实。
C.从其他桉属植物提取
重复A中的步骤，不同点在于用以下植物的果实替换蓝桉果实：大叶桉、斑皮桉、柳叶桉、毛叶桉、尾叶桉、布氏桉、粗皮桉和刚果桉。结果同样获得了TMAO。这表明TMAO广泛存在于桉属植物中。
实施例2
体外抗肿瘤作用的研究
选用Huh-7人肝癌细胞株、Du-145人前列腺癌细胞株、K562人白血病细胞株、AGS人胃癌细胞株、Eca-109人食管癌细胞株、786-0人肾癌细胞株、A549人肺癌细胞株、CS-174-T人结肠癌细胞株进行药物体外抗肿瘤实验。将细胞在培养瓶中培养至细胞数达1×107个。将细胞消化后，用DMEM培养液(GIBCO公司)将细胞稀释至3×104/ml。取96孔板，每孔加入200ul稀释好的细胞液，于37℃5％CO2孵箱中温孵。24小时后，弃去原有细胞培养液，在相应孔中分别加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度各种受试药物的溶液200ul后，继续将细胞培养板置于37℃5％CO2孵箱中温孵。48小时后，各孔中分别加入10mg/ml MTT(Sigma公司)20ul，在同样条件下再温孵4小时后，每孔加入200ul的二甲基亚砜，混匀，室温下放置半小时后测定吸光值。将96孔板置酶标仪上测定各孔在570nm处的吸光值(OD)。按下式计算肿瘤抑制率：
肿瘤抑制率＝(1-OD用药组/OD对照组)×100％
选用5Fu(5-氟尿嘧啶)及长春新碱为阳性对照药。受试药物浓度分别为1ug/ml、3ug/ml、10ug/ml、30ug/ml、100ug/ml，对照组和各受试药物各浓度组在96孔板上皆重复12孔。
试验结果如图1-8所示。结果表明TMAO对人肝癌细胞株、人前列腺癌细胞株、人白血病细胞株、人胃癌细胞株、人食管癌细胞株、人肾癌细胞株、人肺癌细胞株、人结肠癌细胞株都有很好的抑制效果。
实施例3
体内抗肿瘤作用的研究
将Huh-7人肝癌细胞进行常规培养。取增殖期活性好的细胞，以体积为0.25ml、浓度为1×107细胞/只的剂量接种于裸鼠(购自中科院上海实验动物中心)右大腿外侧皮下。接种后次日将小鼠随机分成2组，每组10只。饲养30天后，给受试药组每只小鼠每天腹腔注射药物(100mg/kg)溶液0.5ml；阴性对照组每只小鼠每天给予等体积的生理盐水；各组小鼠每天皆给药1次，连续给药10天。于停药24小时后，将各组小鼠皆放血处死，进行尸体解剖，取出瘤块称重，按下式计算肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率＝(C-T)×100/C
式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。
结果如表1所示，TMAO在体内有显著的抑制肿瘤的效果。
表1
组别 给药剂量 体重(g) 瘤重 抑制率 P值
(mg/kg) 开始 最后 (x±s)g (％)
生理盐水 0 19.4 22.1 2.15±0.47
受试药 100 19.6 22.8 0.93±0.65 56.7 ＜0.01
实施例4
药物组合物
口服配方：100毫克TMAO，50毫克甘露醇，100毫克可溶性淀粉。
注射配方：50毫克TMAO，50毫摩尔磷酸缓冲液，pH7.0，总体积1毫升。
实施例5
保健食品组合物：饮料、口服液和胶囊的制作
a.取提纯的TMAO 1g加2.5g阿拉伯胶，在干乳钵中研匀，一次加入25ml蒸镏水，匀质机中迅速磨成乳，然后加入甜菊甙水溶液适量，再缓缓加入西黄蓍胶浆(0.7g粉)加水适量制成浆，加入0.1％山梨酸钾，加蒸镏水至1000ml，将其灌瓶、灭菌即成。
b.藻蓝蛋白1g，甜菊甙，柠檬酸适量，消毒灭菌水使成100ml，装瓶消毒杀菌即成。
c.按20毫克TMAO，10毫克甘氨酸，10毫克赖氨酸，20毫克精氨酸，140毫克可溶性淀粉比例，制得大小为200mg的胶囊。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。