羧甲基卡拉胶胶原蛋白肽、制备方法及其用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103739734 A (43)申请公布日 2014.04.23 CN 103739734 A (21)申请号 201410017141.4 (22)申请日 2014.01.14 C08B 37/00(2006.01) C07K 1/107(2006.01) C12N 5/073(2010.01) A61L 15/32(2006.01) A61L 15/42(2006.01) (71)申请人武汉理工大学地址 430070 湖北省武汉市洪山区珞狮路 122 号 (72)发明人樊李红谈畅彭敏周潇宇王坦 (74)专利代理机构湖北武汉永嘉专利代理有限公司 4。

2、2102 代理人乔宇 (54) 发明名称羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽、制备方法及其用途 (57) 摘要本发明属于医用生物高分子材料科学领域，具体涉及本发明涉及羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽、制备方法及其用途。它是将羧甲基卡拉胶的羧基钠基团进行活化后再与胶原蛋白肽 25-35 进行接枝反应得到的。所述羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的酰胺取代度为 0.043-0.442。该羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽具有良好的清除羟自由基 (OH) 和 DPPH自由基能力，可促进成纤维细胞的增长，加快伤口创面的愈合。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 5 页附图 2 页。

3、 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页 (10)申请公布号 CN 103739734 A CN 103739734 A 1/1 页 2 1. 羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽，其特征在于：它是将羧甲基卡拉胶的羧基钠基团进行活化后再与胶原蛋白肽 25-35进行接枝反应得到的。 2. 根据权利要求 1 所述的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽，其特征在于：所述羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的酰胺取代度为 0.043-0.442。 3. 权利要求 1 所述的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：它是将羧甲基卡拉胶与。

4、羧基活化剂活化后再与胶原蛋白肽 25-35进行接枝反应、后处理。 4. 根据权利要求 3 所述的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的活化反应是将羧甲基卡拉胶溶于MES缓冲液中，调节体系的pH为6.0-7.0，然后在体系中加入羧基活化剂在 25-35下反应 10-30 小时，所述的羧基活化剂为 1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐和 N- 羟基琥珀酰亚胺的混合物。 5. 根据权利要求 3 所述的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的羧基活化剂中 1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐和 N。

5、- 羟基琥珀酰亚胺的质量比为1.5:1-5.6:1 ；所述N-羟基琥珀酰亚胺与羧甲基卡拉胶的质量比为0.1:1-0.5:1。 6. 根据权利要求 3 所述的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述羧甲基卡拉胶与胶原蛋白肽的质量比为 1:1-1:3。 7. 根据权利要求 3 所述的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述加入胶原蛋白肽后进行接枝反应的反应时间为 10min-30min。 8. 根据权利要求 3 所述的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的后处理为将反应结束后的溶液用蒸馏水透析，冷却干燥。 9.权利要。

6、求1-8中任一项所述的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在促进细胞生长方面的应用。 10. 根据权利要求 1-8 任一项所述的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽在医用伤口敷料中的应用。权利要求书 CN 103739734 A 2 1/5 页 3 羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽、制备方法及其用途技术领域 0001 本发明涉及羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽、制备方法及其用途，属于医用生物高分子材料科学领域。背景技术 0002 卡拉胶是一种结构独特的天然海藻硫酸多糖，具有很强的电负性，这是其能呈现出多种生物活性的关键，并且这些生物活性能随着电负性的增加而增强。其羧甲基化后能够同时含有。

7、 SO42-和 COOH，结构与肝素类似，与其他合成的肝素替代物相比，羧甲基化后的卡拉胶不仅能避免合成多糖硫酸酯的缺点，还具有工艺简单、成本较低、不污染环境的优势。 0003 胶原蛋白肽具有良好的生物活性和物理性质，使其可作为生物医用材料，参与到细胞的分化和迁移中，使皮肤、骨骼和骨腱具有一定的机械强度，在动物细胞中扮演结蒂组织。胶原蛋白肽中还存在氨基酸序列 (Gly-X-Y)，富含 -NH2， -OH 等亲水基团而具有良好的保湿性，能供给皮肤所需要的水分。发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽、制备方法及其应。

8、用。该羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽具有良好的清除羟自由基 (OH) 和 DPPH自由基能力，可促进成纤维细胞的增长，加快伤口创面的愈合。 0005 本发明为解决其技术问题采用的技术方案如下： 0006 羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽，它是将羧甲基卡拉胶的羧基钠基团进行活化后再与胶原蛋白肽 25-35进行接枝反应得到的。 0007 按上述方案，所述羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的酰胺取代度 ( 平均每个羧甲基卡拉胶上的羧基钠基团被胶原蛋白肽上的氨基基团取代的数目 ) 为 0.043-0.442。 0008 上述羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：它是将羧甲基卡拉。

9、胶与羧基活化剂活化后再与胶原蛋白肽 25-35进行接枝反应、后处理。 0009 按上述方案，所述的活化反应是将羧甲基卡拉胶溶于 MES（2-(N- 吗啡啉 ) 乙磺酸溶液）缓冲液中，调节体系的 pH 为 6.0-7.0，然后在体系中加入羧基活化剂在 25-35下反应 10-30 小时，所述的羧基活化剂为 1-(3- 二甲基氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和 N- 羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合物。 0010 按上述方案，所述的羧基活化剂中1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和 N- 羟基琥珀酰亚胺（NHS）的质量比为。

10、 1.5:1-5.6:1 ；所述 N- 羟基琥珀酰亚胺（NHS）与羧甲基卡拉胶的质量比为 0.1:1-0.5:1。 0011 按上述方案，所述羧甲基卡拉胶与胶原蛋白肽的质量比为 1:1-1:3。 0012 按上述方案，所述加入胶原蛋白肽后进行接枝反应的反应时间为 10min-30min。 0013 按上述方案，所述的后处理为将反应结束后的溶液用蒸馏水透析，冷却干燥。说明书 CN 103739734 A 3 2/5 页 4 0014 上述羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽在促进细胞生长方面的应用。 0015 上述羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽在医用伤口敷料中的应用。 0016 本发明。

11、的有益效果： 0017 本发明的羧甲基卡拉胶胶原蛋白肽具有良好的清除羟自由基 (OH) 和 DPPH自由基能力，可促进成纤维细胞的增长；作为医用伤口敷料能加速创面止血，加快伤口愈合，效果明显；生物相容性好，长期使用不会引起伤口部位的皮肤敏感或过敏反应等不良症状。附图说明 0018 图 1 为本发明实施例 1 所得到的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的红外图谱； 0019 图 2 为本发明实施例 1 所得到的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽在 1d,2d,3d 及加入 MTT 试剂后对成纤维细胞生长的影响； 0020 图3为本发明实施例1所得到的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在烫伤时。

12、、烫伤后3d、 7d 和 14d 的伤口愈合图片； 0021 图4为本发明实施例1所得到的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在烫伤时，烫伤后3d、 7d 和 14d 的病理切片照片。具体实施方式 0022 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。 0023 实施例 1 0024 取0.6g羧甲基卡拉胶（CKC）溶于0.2mol/L2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，通过加入 0.3mol/L NaCl 溶液 50ml 来调节 MES 缓冲液的 pH 为 6.5，搅拌均匀。然后加入 0.32gEDC 和 0.09。

13、g NHS 固体粉末，保持 23不变，连续搅拌 20h。再向溶液中加入 0.6g 胶原蛋白肽，搅拌 24min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析 3d，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽（CKC-CP）。所获得的CKC-CP取代度为0.25。羧甲基卡拉胶和羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽经红外表征的红外图谱见图 1。由图可知：胶原蛋白肽上的氨基已与羧甲基卡拉胶的羧基钠基团进行酰胺反应，将胶原蛋白肽成功引入了羧甲基卡拉胶糖单元结构中。 0025 实施例 2 0026 取 0.6g 羧甲基卡拉胶（CKC）溶于 2-(N- 吗啉代 ) 乙磺酸。

14、（MES）缓冲液中，加入 NaCl 溶液调节体系的 pH 为 6.0，搅拌均匀。然后向体系中加入 0.36g EDC 和 0.17g NHS，温度保持 27不变，连续搅拌 15h。再向溶液中加入 0.8g 胶原蛋白肽固体，搅拌 18min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽（CKC-CP），所获得的 CKC-CP 取代度为 0.12。 0027 实施例 3 0028 取 0.4g 羧甲基卡拉胶（CKC）溶于 0.2mol/L2-(N- 吗啉代 ) 乙磺酸（MES）缓冲液中，调节体系的pH为。

15、7.0，搅拌均匀。然后向体系中加入0.25g EDC和0.19g NHS，保持温度 23不变连续搅拌 25h。再向溶液中加入 1.0g 胶原蛋白肽固体，搅拌 28min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析 3d，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶 - 胶说明书 CN 103739734 A 4 3/5 页 5 原蛋白肽（CKC-CP），所获得的 CKC-CP 取代度为 0.40。 0029 实施例 4 0030 取0.5g羧甲基卡拉胶（CKC）溶于0.2mol/L2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，通过加入 0.3mol/L NaCl 溶。

16、液 50ml 来调节体系的 pH 为 6.5，搅拌均匀。然后向体系中加入 0.40gEDC 和 0.14g NHS 固体粉末，保持 20不变，连续搅拌 23h。再向溶液中加入 1.2g 胶原蛋白肽固体，搅拌 26min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析 3d，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽（CKC-CP），所获得的CKC-CP取代度为 0.32。 0031 实施例 5 0032 取 0.8g 羧甲基卡拉胶（CKC）溶于 0.2mol/L2-(N- 吗啉代 ) 乙磺酸（MES）缓冲液中，通过加入 0.3mol/L NaCl 溶液。

17、50ml 来调节体系的 pH 为 6.0，搅拌均匀。然后向其中加入0.24gEDC和0.18g NHS，保持温度30不变，连续搅拌21h。再向溶液中加入1.4g胶原蛋白肽固体，搅拌 18min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析 3d，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽（CKC-CP），所获得的 CKC-CP 取代度为 0.44。 0033 实施例 6 0034 取0.6g羧甲基卡拉胶（CKC）溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，通过加入 0.3mol/L NaCl 溶液 50ml 来调节体系中的 pH 为 7.0，。

18、搅拌均匀。然后在体系中加入 0.33g EDC 和 0.08g NHS 固体粉末，保持温度 20不变，连续搅拌 15h。再向溶液中加入 0.8g 胶原蛋白肽固体，搅拌 22min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析 3d，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽（CKC-CP），所获得的 CKC-CP 取代度为 0.18。 0035 将上述实施例制备的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽进行如下性能表征： 0036 （1）将实施例 1-6 制备的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽进行水溶性试验，结果表明：羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽水溶性良好，所有测。

19、试样品均能在水中充分溶解。 0037 （2）自由基清除能力试验 0038 自由基清除能力也称为抗氧化能力，清除体内多余的自由基，可减轻它们对机体的损伤。自由基是在生物体内呈游离状态，带有不配对电子的分子、原子或离子，包括羟自由基 (OH) 和 DPPH自由基等。 0039 羟自由基是进攻性最强的化学物质之一，几乎能和所有的生物大分子发生不同类型的反应，并有非常高的速率常数。我们在此采用邻二氮菲法：在试管中加入 0.5ml0.75mol/l 邻二氮菲无水乙醇溶液，然后依次加入 0.2mmol/l(pH7.4) 的 PBS 缓冲液 1ml 和羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽。

20、样品溶液 0.5ml，充分混匀后，加入 0.5ml0.75mmol/l 硫酸亚铁溶液和 0.5ml0.01wt%H2O2。该溶液在 37下水浴 1h, 在 536nm 处测量吸光度。其中 As 为测试样品溶液的吸光度， Ab 为不加双氧水的测试样品溶液的吸光度， Ap 为不加测试样品的样品溶液的吸光度。 0040 羟自由基清除率 (%)=(As-Ap)/(Ab-Ap)100% 0041 DPPH 自由基的清除被广泛用于评价抗氧化物质的抗氧化能力。具体操作方法如下：将 2.8ml1.0104mol/l 的 DPPH- 无水乙醇溶液和 1.0ml 羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽样品溶。

21、液混匀，在室温避光保存 20min, 并在 4000r/min 下离心 10min, 取上清液在 515nm 下说明书 CN 103739734 A 5 4/5 页 6 测定吸光度。其中 Ai 为测试样品的吸光度， Aj 为无水乙醇替代测试样品的吸光度， A0 为蒸馏水替代样品的吸光度。 0042 DPPH 自由基清除率 (%)=1-（Ai-Aj） /A0100% 0043 结果如表 1 所示。 0044 表 1 0045 抗氧化性能实施例 1实施例 2实施例 3 羟自由基清除率 (OH)/%322931 DPPH 自由基清除率 /%131617 0046 （2）促进鸡胚成纤维细胞。

22、增值试验： 0047 用胰蛋白酶消化处于对数生长期的鸡胚成纤维细胞，将细胞收集到含血清的 DMEM 培养基中，并将实施例 1 中的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽分别配制成一定浓度的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽溶液，加入到96孔培养板中，然后向培养板加入前述DMEM培养基。之后，将培养板放于 5%CO2培养箱中 37条件下培养 24h 后，取出培养板，在培养板中加入 MTT 试剂，于酶联免疫检测仪上读取 570nm 波长处各孔的 OD 值（吸光度值）。每组实验重复 6 次，结果以 XS 表示， X 为 6 次的均值， S 为上下浮动度。并以羧甲基卡拉胶根据上述实验条件作。

23、对照试验。结果见下表 1。 0048 表 1 羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽在不同浓度 (ppm) 下对鸡胚成纤维细胞生长的影响 0049 0050 10ppm50ppm100ppm500ppm1000ppm CKC0.8040.0040.8120.0080.8280.0120.8020.0070.7620.005 实施例 10.8190.0030.8240.0040.8420.0030.8210.0040.7830.008 实施例 20.8110.0080.8170.0110.8390.0050.8140.0080.7770.003 实施例 30.8210.0160.8430.0020.85。

24、70.0070.8350.0080.7900.002 0051 由此表1可看出：在相同的浓度条件下，本发明的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的吸光度（OD 值）明显大于羧甲基卡拉胶。且本发明的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽在不同浓度下 (10-1000ppm) 的吸光度 (OD) 值表明其对鸡胚成纤维细胞的生长均有促进作用。当浓度为 100ppm 时，所得的活细胞数量最多，此时羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽促进鸡胚成纤维细胞增殖作用最强。当浓度大于 100ppm 时，羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽的促鸡胚成纤维细胞生长能力均会逐渐变小，鸡胚成纤维细胞也有脱壁现象发生。另外结合实施。

25、例 1-3 所获得的 CKC-CP 样品取代度可以看出，随着取代度的增大，吸光度（OD）值有所增强，表明高取代说明书 CN 103739734 A 6 5/5 页 7 度的 CKC-CP 在促进鸡胚成纤维细胞增殖方面更为明显。 0052 另通过设定不同的培养时间（1d,2d,3d），将培养 1d,2d,3d 后的培养板放在显微镜下观察并分别扫描，然后在培养第 3d 后加入 MTT 试剂进行显示反应并显微观察，如图 2 所示。由图 2 看出：第一天鸡胚成纤维细胞刚加入到培养基中，显微镜下细胞较少；第二天鸡胚成纤维细胞较第一天有增长；第三天增长更多；。

26、加入 MTT 试剂后，成纤维细胞有显色反应，细胞在显微镜下观察更明显。说明羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽随着培养时间的增长可促进鸡胚成纤维细胞数量的增长。 0053 （3）将实施例 1 的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽用于烧伤创面的愈合： 0054 实验组：用乙醚将大鼠麻醉，剔除大鼠的毛，用烫伤仪 90烫 10s，将大鼠的背部烫出一个圆形的深 II 度烧伤伤口，将实施例 1 的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽配置成质量浓度为 5wt% 的溶液，涂在老鼠伤口上，然后在第 3 天，第 7 天和第 14 天进行观察，根据愈合伤口面积计算伤口愈合率 , 0055 伤口愈。

27、合率 =（原始伤口面积 - 观察时愈合伤口面积） / 原始伤口面积 100% ； 0056 对照组：采用质量浓度为 5wt% 的羧甲基卡拉胶水溶液。 0057 表 2 伤口愈合率 0058 天数实验组对照组 39.972.587.873.64 738.472.5120.762.16 1489.42.4351.943.61 0059 并在烫伤当天，第 3 天，第 7 天和第 14 天分别进行观察，创面愈合照片结果见图 3，烫伤当天，第 3 天，第 7 天和第 14 天的病理切片图见图 4。由图 3 和图 4 并结合表 2 可知：本发明的羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽对深 II。

28、度烧伤伤口愈合有促进作用，用羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽组处理的伤口在 14d 左右能基本愈合，愈合率达 89%，愈合时间明显短于羧甲基卡拉胶对照组；可以作为敷料用于烧伤伤口的愈合。动物实验结果与细胞实验结果相符。这主要是因为羧甲基卡拉胶 - 胶原蛋白肽水溶性强，能进入细胞和组织间隙 , 促进细胞、细胞间质和组织间相互作用，并具有良好的清除羟自由基 (OH) 和 DPPH自由基能力，可促进成纤维细胞的增长从而加速创伤愈合过程。说明书 CN 103739734 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说明书附图 CN 103739734 A 8 2/2 页 9 图 3 图 4 说明书附图 CN 103739734 A 9 。

摘要
申请专利号：	CN201410017141.4	申请日：	2014.01.14
公开号：	CN103739734A	公开日：	2014.04.23
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C08B 37/00申请公布日:20140423\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C08B 37/00申请日:20140114\|\|\|公开
IPC分类号：	C08B37/00; C07K1/107; C12N5/073(2010.01)I; A61L15/32; A61L15/42	主分类号：	C08B37/00
申请人：	武汉理工大学
发明人：	樊李红; 谈畅; 彭敏; 周潇宇; 王坦
地址：	430070 湖北省武汉市洪山区珞狮路122号
优先权：
专利代理机构：	湖北武汉永嘉专利代理有限公司 42102	代理人：	乔宇
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内容摘要

本发明属于医用生物高分子材料科学领域，具体涉及本发明涉及羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽、制备方法及其用途。它是将羧甲基卡拉胶的羧基钠基团进行活化后再与胶原蛋白肽25-35℃进行接枝反应得到的。所述羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的酰胺取代度为0.043-0.442。该羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽具有良好的清除羟自由基(·OH)和DPPH·自由基能力，可促进成纤维细胞的增长，加快伤口创面的愈合。

权利要求书

权利要求书
1.  羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽，其特征在于：它是将羧甲基卡拉胶的羧基钠基团进行活化后再与胶原蛋白肽25-35℃进行接枝反应得到的。

2.  根据权利要求1所述的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽，其特征在于：所述羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的酰胺取代度为0.043-0.442。

3.  权利要求1所述的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：它是将羧甲基卡拉胶与羧基活化剂活化后再与胶原蛋白肽25-35℃进行接枝反应、后处理。

4.  根据权利要求3所述的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的活化反应是将羧甲基卡拉胶溶于MES缓冲液中，调节体系的pH为6.0-7.0，然后在体系中加入羧基活化剂在25-35℃下反应10-30小时，所述的羧基活化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。

5.  根据权利要求3所述的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的羧基活化剂中1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1.5:1-5.6:1；所述N-羟基琥珀酰亚胺与羧甲基卡拉胶的质量比为0.1:1-0.5:1。

6.  根据权利要求3所述的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述羧甲基卡拉胶与胶原蛋白肽的质量比为1:1-1:3。

7.  根据权利要求3所述的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述加入胶原蛋白肽后进行接枝反应的反应时间为10min-30min。

8.  根据权利要求3所述的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的后处理为将反应结束后的溶液用蒸馏水透析，冷却干燥。

9.  权利要求1-8中任一项所述的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在促进细胞生长方面的应用。

10.  根据权利要求1-8任一项所述的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在医用伤口敷料中的应用。

说明书

说明书羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽、制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽、制备方法及其用途，属于医用生物高分子材料科学领域。
背景技术
卡拉胶是一种结构独特的天然海藻硫酸多糖，具有很强的电负性，这是其能呈现出多种生物活性的关键，并且这些生物活性能随着电负性的增加而增强。其羧甲基化后能够同时含有–SO42-和–COOH，结构与肝素类似，与其他合成的肝素替代物相比，羧甲基化后的卡拉胶不仅能避免合成多糖硫酸酯的缺点，还具有工艺简单、成本较低、不污染环境的优势。
胶原蛋白肽具有良好的生物活性和物理性质，使其可作为生物医用材料，参与到细胞的分化和迁移中，使皮肤、骨骼和骨腱具有一定的机械强度，在动物细胞中扮演结蒂组织。胶原蛋白肽中还存在氨基酸序列(Gly-X-Y)，富含-NH2，-OH等亲水基团而具有良好的保湿性，能供给皮肤所需要的水分。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽、制备方法及其应用。该羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽具有良好的清除羟自由基(·OH)和DPPH·自由基能力，可促进成纤维细胞的增长，加快伤口创面的愈合。
本发明为解决其技术问题采用的技术方案如下：
羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽，它是将羧甲基卡拉胶的羧基钠基团进行活化后再与胶原蛋白肽25-35℃进行接枝反应得到的。
按上述方案，所述羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的酰胺取代度(平均每个羧甲基卡拉胶上的羧基钠基团被胶原蛋白肽上的氨基基团取代的数目)为0.043-0.442。
上述羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：它是将羧甲基卡拉胶与羧基活化剂活化后再与胶原蛋白肽25-35℃进行接枝反应、后处理。
按上述方案，所述的活化反应是将羧甲基卡拉胶溶于MES（2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液）缓冲液中，调节体系的pH为6.0-7.0，然后在体系中加入羧基活化剂在25-35℃下反应10-30小时，所述的羧基活化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合物。
按上述方案，所述的羧基活化剂中1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的质量比为1.5:1-5.6:1；所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与羧甲基卡拉胶的质量比为0.1:1-0.5:1。
按上述方案，所述羧甲基卡拉胶与胶原蛋白肽的质量比为1:1-1:3。
按上述方案，所述加入胶原蛋白肽后进行接枝反应的反应时间为10min-30min。
按上述方案，所述的后处理为将反应结束后的溶液用蒸馏水透析，冷却干燥。
上述羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在促进细胞生长方面的应用。
上述羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在医用伤口敷料中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的羧甲基卡拉胶胶原蛋白肽具有良好的清除羟自由基(·OH)和DPPH·自由基能力，可促进成纤维细胞的增长；作为医用伤口敷料能加速创面止血，加快伤口愈合，效果明显；生物相容性好，长期使用不会引起伤口部位的皮肤敏感或过敏反应等不良症状。
附图说明
图1为本发明实施例1所得到的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的红外图谱；
图2为本发明实施例1所得到的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在1d,2d,3d及加入MTT试剂后对成纤维细胞生长的影响；
图3为本发明实施例1所得到的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在烫伤时、烫伤后3d、7d和14d的伤口愈合图片；
图4为本发明实施例1所得到的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在烫伤时，烫伤后3d、7d和14d的病理切片照片。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
取0.6g羧甲基卡拉胶（CKC）溶于0.2mol/L2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，通过加入0.3mol/L NaCl溶液50ml来调节MES缓冲液的pH为6.5，搅拌均匀。然后加入0.32gEDC和0.09g NHS固体粉末，保持23℃不变，连续搅拌20h。再向溶液中加入0.6g胶原蛋白肽，搅拌24min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析3d，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽（CKC-CP）。所获得的CKC-CP取代度为0.25。羧甲基卡拉胶和羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽经红外表征的红外图谱见图1。由图可知：胶原蛋白肽上的氨基已与羧甲基卡拉胶的羧基钠基团进行酰胺反应，将胶原蛋白肽成功引入了羧甲基卡拉胶糖单元结构中。
实施例2
取0.6g羧甲基卡拉胶（CKC）溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，加入NaCl 溶液调节体系的pH为6.0，搅拌均匀。然后向体系中加入0.36g EDC和0.17g NHS，温度保持27℃不变，连续搅拌15h。再向溶液中加入0.8g胶原蛋白肽固体，搅拌18min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽（CKC-CP），所获得的CKC-CP取代度为0.12。
实施例3
取0.4g羧甲基卡拉胶（CKC）溶于0.2mol/L2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，调节体系的pH为7.0，搅拌均匀。然后向体系中加入0.25g EDC和0.19g NHS，保持温度23℃不变连续搅拌25h。再向溶液中加入1.0g胶原蛋白肽固体，搅拌28min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析3d，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽（CKC-CP），所获得的CKC-CP取代度为0.40。
实施例4
取0.5g羧甲基卡拉胶（CKC）溶于0.2mol/L2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，通过加入0.3mol/L NaCl溶液50ml来调节体系的pH为6.5，搅拌均匀。然后向体系中加入0.40gEDC和0.14g NHS固体粉末，保持20℃不变，连续搅拌23h。再向溶液中加入1.2g胶原蛋白肽固体，搅拌26min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析3d，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽（CKC-CP），所获得的CKC-CP取代度为0.32。
实施例5
取0.8g羧甲基卡拉胶（CKC）溶于0.2mol/L2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，通过加入0.3mol/L NaCl溶液50ml来调节体系的pH为6.0，搅拌均匀。然后向其中加入0.24gEDC和0.18g NHS，保持温度30℃不变，连续搅拌21h。再向溶液中加入1.4g胶原蛋白肽固体，搅拌18min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析3d，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽（CKC-CP），所获得的CKC-CP取代度为0.44。
实施例6
取0.6g羧甲基卡拉胶（CKC）溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中，通过加入0.3mol/L NaCl溶液50ml来调节体系中的pH为7.0，搅拌均匀。然后在体系中加入0.33g EDC和0.08g NHS固体粉末，保持温度20℃不变，连续搅拌15h。再向溶液中加入0.8g胶原蛋白肽固体，搅拌22min。反应结束后，将混合溶液用蒸馏水透析3d，所得终产品用冷冻干燥机冻干得到纯化的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽（CKC-CP），所获得的CKC-CP取代度为0.18。
将上述实施例制备的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽进行如下性能表征：
（1）将实施例1-6制备的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽进行水溶性试验，结果表明：羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽水溶性良好，所有测试样品均能在水中充分溶解。
（2）自由基清除能力试验
自由基清除能力也称为抗氧化能力，清除体内多余的自由基，可减轻它们对机体的损伤。自由基是在生物体内呈游离状态，带有不配对电子的分子、原子或离子，包括羟自由基(·OH)和DPPH·自由基等。
羟自由基是进攻性最强的化学物质之一，几乎能和所有的生物大分子发生不同类型的反应，并有非常高的速率常数。我们在此采用邻二氮菲法：在试管中加入0.5ml0.75mol/l邻二氮菲无水乙醇溶液，然后依次加入0.2mmol/l(pH7.4)的PBS缓冲液1ml和羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽样品溶液0.5ml，充分混匀后，加入0.5ml0.75mmol/l硫酸亚铁溶液和0.5ml0.01wt%H2O2。该溶液在37℃下水浴1h,在536nm处测量吸光度。其中As为测试样品溶液的吸光度，Ab为不加双氧水的测试样品溶液的吸光度，Ap为不加测试样品的样品溶液的吸光度。
羟自由基清除率(%)=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100%
DPPH自由基的清除被广泛用于评价抗氧化物质的抗氧化能力。具体操作方法如下：将2.8ml1.0×104mol/l的DPPH-无水乙醇溶液和1.0ml羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽样品溶液混匀，在室温避光保存20min,并在4000r/min下离心10min,取上清液在515nm下测定吸光度。其中Ai为测试样品的吸光度，Aj为无水乙醇替代测试样品的吸光度，A0为蒸馏水替代样品的吸光度。
DPPH自由基清除率(%)=[1-（Ai-Aj）]/A0×100%
结果如表1所示。
表1
抗氧化性能实施例1实施例2实施例3羟自由基清除率(·OH)/%322931DPPH自由基清除率/%131617
（2）促进鸡胚成纤维细胞增值试验：
用胰蛋白酶消化处于对数生长期的鸡胚成纤维细胞，将细胞收集到含血清的DMEM培养基中，并将实施例1中的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽分别配制成一定浓度的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽溶液，加入到96孔培养板中，然后向培养板加入前述DMEM培养基。之后，将培养板放于5%CO2培养箱中37℃条件下培养24h后，取出培养板，在培养板中加入MTT试剂，于酶联免疫检测仪上读取570nm波长处各孔的OD值（吸光度值）。每组实验重复6次，结果以X±S表示，X为6次的均值，S为上下浮动度。并以羧甲基卡拉胶根据上述实验条件作对照试验。结果见下表1。
表1羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在不同浓度(ppm)下对鸡胚成纤维细胞生长的影响
(X&OverBar;&PlusMinus;s,n=6)]]>
10ppm50ppm100ppm500ppm1000ppmCKC0.804±0.0040.812±0.0080.828±0.0120.802±0.0070.762±0.005实施例10.819±0.0030.824±0.0040.842±0.0030.821±0.0040.783±0.008实施例20.811±0.0080.817±0.0110.839±0.0050.814±0.0080.777±0.003实施例30.821±0.0160.843±0.0020.857±0.0070.835±0.0080.790±0.002
由此表1可看出：在相同的浓度条件下，本发明的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的吸光度（OD值）明显大于羧甲基卡拉胶。且本发明的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽在不同浓度下(10-1000ppm)的吸光度(OD)值表明其对鸡胚成纤维细胞的生长均有促进作用。当浓度为100ppm时，所得的活细胞数量最多，此时羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽促进鸡胚成纤维细胞增殖作用最强。当浓度大于100ppm时，羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽的促鸡胚成纤维细胞生长能力均会逐渐变小，鸡胚成纤维细胞也有脱壁现象发生。另外结合实施例1-3所获得的CKC-CP样品取代度可以看出，随着取代度的增大，吸光度（OD）值有所增强，表明高取代度的CKC-CP在促进鸡胚成纤维细胞增殖方面更为明显。
另通过设定不同的培养时间（1d,2d,3d），将培养1d,2d,3d后的培养板放在显微镜下观察并分别扫描，然后在培养第3d后加入MTT试剂进行显示反应并显微观察，如图2所示。由图2看出：第一天鸡胚成纤维细胞刚加入到培养基中，显微镜下细胞较少；第二天鸡胚成纤维细胞较第一天有增长；第三天增长更多；加入MTT试剂后，成纤维细胞有显色反应，细胞在显微镜下观察更明显。说明羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽随着培养时间的增长可促进鸡胚成纤维细胞数量的增长。
（3）将实施例1的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽用于烧伤创面的愈合：
实验组：用乙醚将大鼠麻醉，剔除大鼠的毛，用烫伤仪90℃烫10s，将大鼠的背部烫出一个圆形的深II度烧伤伤口，将实施例1的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽配置成质量浓度为5wt%的溶液，涂在老鼠伤口上，然后在第3天，第7天和第14天进行观察，根据愈合伤口面积计算伤口愈合率,
伤口愈合率=（原始伤口面积-观察时愈合伤口面积）/原始伤口面积×100%；
对照组：采用质量浓度为5wt%的羧甲基卡拉胶水溶液。
表2伤口愈合率
天数实验组对照组39.97±2.587.87±3.64738.47±2.5120.76±2.161489.4±2.4351.94±3.61
并在烫伤当天，第3天，第7天和第14天分别进行观察，创面愈合照片结果见图3，烫伤当天，第3天，第7天和第14天的病理切片图见图4。由图3和图4并结合表2可知：本发明的羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽对深II度烧伤伤口愈合有促进作用，用羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽组处理的伤口在14d左右能基本愈合，愈合率达89%，愈合时间明显短于羧甲基卡拉胶对照组；可以作为敷料用于烧伤伤口的愈合。动物实验结果与细胞实验结果相符。这主要是因为羧甲基卡拉胶-胶原蛋白肽水溶性强，能进入细胞和组织间隙,促进细胞、细胞间质和组织间相互作用，并具有良好的清除羟自由基(·OH)和DPPH·自由基能力，可促进成纤维细胞的增长从而加速创伤愈合过程。