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哺乳动物胎儿肺细胞以及其治疗用途
技术领域
本发明，在其一些实施方式中，涉及哺乳动物胚胎肺细胞，以及更具体地但不排他地涉及其用于治疗应用的用途。
背景技术
呼吸系统疾病是死亡和发病的主要原因，并在发生率(incidence)、患病率(prevalence)、发病率(morbidity)、死亡率和费用方面由世界卫生组织列为第二最多的。大多数目前可用的治疗仅稍微改善肺病患者的生活质量，而并不预防气体交换表面的损失，其是各种各样的肺部病变的进展的主要结果。因此，目前，用于晚期肺病的仅有的确定性治疗是受损器官的替换，但是用于移植的器官的严重短缺，许多患者在等候期间即死亡。
先前的研究对不同器官的人和猪胚胎前体的移植限定了"最佳窗口"。通过三个参数来限定用于移植的这些"最佳窗口"：没有畸胎瘤的风险、生长组织的功能特性、以及低免疫原性。例如，不同的猪胚胎前体组织植入SCID小鼠揭示了不同的时间‘窗口’，其间，组织表现出适用于移植的性能，其中肾脏和肝脏在第28天表现出最佳性能，而肺脏‘窗口’则发生在猪胎龄的晚得多时间，在第56天[Eventov-Friedman S.et al.,Proc Nat Acad of Sciences.(2005)102(8):2928]。使用猪胰腺前体组织进行的研究表明其在第42天最佳，在其时，在免疫抑制小鼠以及最近在非人灵长类中，这种组织显示纠正链脲霉素诱导的高血糖的显著的能力。此外，最近的研究表明，在FVIII缺陷小鼠中，在特定妊娠时间点收获的猪胚胎脾组织的移植能够纠正血友病。
在过去十年中，已广泛地研究了基于干细胞的疗法的潜在的治疗作用。最近的发现表明，源自成熟(adult)组织(如骨髓)或者源自脐带血、羊水或胎盘的早期祖细胞，包括间充质干细胞、内皮祖细胞(endothelial progenitor)或循环纤维细胞(circulating fibrocyte)以及各种各样的其他群体，可以结构上植活(engraft)并分化为气道和肺泡上皮细胞或分化为 血管内皮细胞或肺间质细胞并且可以用于修复和再生受伤或患病的肺[Baber SR et al.,American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology.(2007)292(2):H1120；Weiss DJ.Pulm Pharmacol Ther.(2008)21(4):588-94；Weiss DJ et al.,Proceedings of the American thoracic society:Am Thoracic Soc；(2008)p.637；Sueblinvong V and Weiss DJ.Translational Research.(2010)156(3):188-205]。然而，由于缺乏明显的上皮的转分化(transdifferentiation)、肺的由40种以上的不同的细胞类型组成的极其复杂的结构以及在肺中移植后细胞的低植活率(在不同实验模型中)，是重大的挑战。
另外的背景技术包括：
PCT公开号WO 2006/038211涉及向哺乳动物受试者提供胰腺、淋巴/造血或肺的器官和/或组织功能的方法。该方法包括分别将发育中的哺乳动物胰腺、淋巴/造血或肺的器官/组织移植物植入受试者。在WO2006/038211中公开的肺移植物是在发育阶段，其基本上对应于在妊娠阶段的约42至约80天的猪肺器官/组织的发育阶段。
PCT公开号WO 2004/078022涉及用于治疗与病变器官或组织的生理或形态相关的疾病的方法。该方法通过将所选择的基本上不表达或呈现至少一种在受试者中能够刺激或增强免疫反应的分子的哺乳动物器官或组织移植物(例如肾脏、胰腺、肝脏、心脏或淋巴样器官或组织移植物)移植到受试者中来完成。
发明内容
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含来自哺乳动物胎儿肺组织的细胞悬液的分离群体作为活性组分，其中胎儿肺组织处于对应于在选自约20至约22周的妊娠的范围的妊娠阶段的人肺器官/组织的发育阶段的发育阶段。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于在需要其的受试者中使上皮、间充质和/或内皮组织再生的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的本发明的一些实施方式的药物组合物，从而使上皮、间充质和/或内皮组织再生。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了在需要其的受试者中治疗疾病或病症的方法，其中上皮、间充质和/或内皮组织的再生是有益的， 该方法包括给予受试者治疗有效量的本发明的一些实施方式的药物组合物，从而治疗疾病或病症，其中上皮、间充质和/或内皮组织的再生是有益的。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于在需要其的受试者中治疗肺疾病或损伤的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的本发明的一些实施方式的药物组合物，从而治疗肺疾病或损伤。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了本发明的一些实施方式的药物组合物，用于在需要其的受试者中治疗疾病或病症，其中上皮、间充质和/或内皮组织的再生是有益的。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了本发明的一些实施方式的药物组合物，用于在需要其的受试者中治疗肺疾病或损伤。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了细胞库，其包含分离自哺乳动物胎儿肺组织的多个细胞群体，其中胎儿肺组织处于基本上对应于选自在妊娠约20至约22周的范围的妊娠阶段的人肺器官/组织的发育阶段的发育阶段，并且其中多个细胞群体已被HLA分型以形成各自单独地被安置在单独的容器内的同种异体(同种异基因，allogeneic)细胞库。
根据本发明的一些实施方式，妊娠阶段是妊娠的20至21周。
根据本发明的一些实施方式，妊娠阶段是妊娠的21至22周。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物胎儿肺组织是人类组织。
根据本发明的一些实施方式，细胞悬液的分离群体包括细胞的异源(heterogeneous)群体。
根据本发明的一些实施方式，细胞悬液的分离群体包含祖细胞。
根据本发明的一些实施方式，祖细胞选自由上皮祖细胞、间充质祖细胞和内皮祖细胞组成的组。
根据本发明的一些实施方式，细胞包含细胞角蛋白5+(CK5+)标志物(标记物，marker)表达。
根据本发明的一些实施方式，细胞包含细胞角蛋白5+(CK5+)和细胞角蛋白14+(CK14+)标志物表达。
根据本发明的一些实施方式，细胞包含c-Kit+CD45-CD34-CD31-CD326-CD271-标志物表达。
根据本发明的一些实施方式，细胞包含c-Kit+CD34+CD31+标志物表达。
根据本发明的一些实施方式，细胞包含c-Kit+CD34+CD326+标志物表达。
根据本发明的一些实施方式，细胞包含CD34+CD31+CD14+CD45+标志物表达。
根据本发明的一些实施方式，细胞包含CD34+CD31+CD45-CD105+标志物表达。
根据本发明的一些实施方式，细胞包含巢蛋白+和/或降钙素基因相关蛋白+(CGRP+)标志物表达。
根据本发明的一些实施方式，细胞包含α平滑肌肌动蛋白+(α-SMA+)和/或波形蛋白+标志物表达。
根据本发明的一些实施方式，细胞能够使结构性/功能性肺组织再生。
根据本发明的一些实施方式，结构性/功能性肺组织包括嵌合肺的产生。
根据本发明的一些实施方式，嵌合肺包括肺泡、支气管和/或细支气管结构和/或血管结构的形成。
根据本发明的一些实施方式，结构性/功能性肺组织包括(comprise)合成表面活性物质的能力和/或转运离子的能力。
根据本发明的一些实施方式，细胞能够使上皮组织、间充质组织和/或内皮组织再生。
根据本发明的一些实施方式，细胞是表达CFTR的上皮细胞。
根据本发明的一些实施方式，上皮组织选自由肺组织、胃肠道组织、生殖器官组织、泌尿道组织、肾组织、皮肤组织、心脏组织、缺血组织(ischemic tissue)和脑组织组成的组。
根据本发明的一些实施方式，间充质组织选自由淋巴组织、循环系统组织和结缔组织组成的组。
根据本发明的一些实施方式，内皮组织选自由淋巴组织和循环系统组织组成的组。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括在给予之前根据亚致死、致死或超致死调理(conditioning)方案来调理受试者。
根据本发明的一些实施方式，给予通过静脉内途径来完成。
根据本发明的一些实施方式，给予通过选自由以下组成的组的途径来完成：气管内途径、支气管内途径、肺泡内途径、静脉内途径、腹腔内途径、鼻内途径、皮下途径、髓内途径、鞘内途径、心室内途径、心内途径、肌内途径、浆膜内途径、粘膜内途径、经粘膜途径、经鼻途径、直肠途径和肠途径。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括在移植之前、同时或之后用免疫抑制方案来治疗受试者。
根据本发明的一些实施方式，配制组合物用于静脉内给予。
根据本发明的一些实施方式，配制组合物用于经由选自由以下组成的组的途径来给予：气管内途径、支气管内途径、肺泡内途径、静脉内途径、腹腔内途径、鼻内途径、皮下途径、髓内途径、鞘内途径、心室内途径、心内途径、肌内途径、浆膜内途径、粘膜内途径、经粘膜途径、经鼻途径、直肠途径和肠途径。
根据本发明的一些实施方式，药物组合物进一步包括亚致死、致死或超致死调理方案。
根据本发明的一些实施方式，亚致死、致死或超致死调理选自由全身照射(TBI)、身体局部照射、清髓性(骨髓消融，myeloablative)调理、共刺激阻断、化疗剂和/或抗体免疫治疗组成的组。
根据本发明的一些实施方式，调理包括萘处理。
根据本发明的一些实施方式，调理进一步包括全身照射(TBI)。
根据本发明的一些实施方式，调理包括全身照射(TBI)。
根据本发明的一些实施方式，TBI包括1-7.5Gy范围内的单次或分次照射剂量。
根据本发明的一些实施方式，受试者是人类受试者。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物胎儿肺组织是人类组织。
根据本发明的一些实施方式，细胞悬液的分离群体与受试者是非同源(同基因的，同系的，non-syngeneic)的。
根据本发明的一些实施方式，细胞悬液的分离群体与受试者是同种异体的。
根据本发明的一些实施方式，同种异体细胞选自由与受试者为HLA相合(HLA identical)、HLA部分相合(HLA不全相合，partially HLA identical)和HLA不相合(HLA non-identical)组成的组。
根据本发明的一些实施方式，细胞悬液的分离群体与受试者是异种的(异基因的，xenogeneic)。
根据本发明的一些实施方式，肺疾病或损伤选自由以下组成的组：囊性纤维化、气肿、石绵沉着病、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维化、特发性肺纤维化、肺动脉高压、肺癌、结节病、急性肺损伤(成人型呼吸窘迫综合征)、早产儿呼吸窘迫综合征、早产儿慢性肺疾病(支气管肺发育不良)、表面活化蛋白B缺乏症、先天性膈疝、肺泡蛋白沉着症、肺发育不良和肺损伤。
根据本发明的一些实施方式，其中上皮组织、间充质组织和/或内皮组织的再生是有益的疾病或病症选自由以下组成的组：肺功能紊乱(紊乱，disorder)、疾病或损伤；肾功能障碍、疾病或损伤；肝功能障碍、疾病或损伤；心脏功能障碍、疾病或损伤；胃肠道紊乱、疾病或损伤；皮肤功能紊乱、疾病或损伤；以及脑功能紊乱、疾病或损伤。
根据本发明的一些实施方式，其中上皮组织的再生是有益的疾病或病症选自由以下组成的组：慢性溃疡、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、阿尔茨海默氏病、伤口愈合缺陷、癌症、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维化、特发性肺纤维化、肺动脉高压、肺癌、结节病、急性肺损伤(成人型呼吸窘迫综合征)、早产儿呼吸窘迫综合征、早产儿慢性 肺疾病(支气管肺发育不良)、表面活化蛋白B缺乏症、先天性膈疝、肺泡蛋白沉着症、肺发育不良、肺损伤和角膜变性。
根据本发明的一些实施方式，其中间充质组织的再生是有益的疾病或病症选自由以下组成的组：心脏疾病或病症、糖尿病、耳聋、克罗恩氏病、自体免疫病、白血病、癌症、镰状细胞病、肌萎缩侧索硬化和代谢病。
根据本发明的一些实施方式，其中内皮组织的再生是有益的疾病或病症选自由以下组成的组：血管病、缺血、镰状细胞病、心血管病、动脉粥样硬化、糖尿病和自体免疫病。
根据本发明的一些实施方式，细胞库进一步包括目录，其包括关于多个细胞群体的按HLA分型的细胞的信息。
除非另有限定，否则在本文中使用的所有技术和/或科学术语具有如与本发明所属领域中的技术人员通常理解的相同意义。虽然在实施或测试本发明的实施方式中可以使用类似或等同于本文描述的方法和材料，但下文描述示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，本专利说明书，包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
附图说明
仅通过实例的方式，并参照附图，描述了本发明的一些实施方式。现在详细地具体参照附图，需要强调的是，示出的详情是通过示例的方式并用于本发明的实施方式的说明性讨论。在这方面，连同附图一起的描述使本领域技术人员明了可以如何实施本发明的实施方式。
在附图中：
图1A-图1R示出在不同妊娠时间点收获的人类胚胎前体组织的生长和发育。将人类胚胎组织植入在NOD-SCID小鼠的肾小囊下。在8周以后，宏观上或通过免疫组化染色来评价植入物。图1A是来自不同的妊娠时间点植入物的植入物的宏观尺寸的总结：移植后6-8周的平均(±SD)尺寸，基于植入物的长(L)和短(W)轴以及高度(H)(示出的数据是六个独立实验的平均值)；图1B是图示在妊娠20w时收获的植入物的典型的宏观外观的照片；图1C-图1F是源自20w组织的植入物的微观苏木精和伊红染色(H&E)检查的照片，示出肺泡管、肺泡、覆盖有纤毛上皮、肌层和软骨的气管、以及肺泡/上皮单层的正常外观；图1G-图1H是照片，图示表面活 化蛋白C(sp-C)(红色)和细胞角蛋白-18(CK-18)(绿色)的免疫染色，在较低(图1G)和较高放大倍率下(图1H)；图1I是照片，其图示CFTR-囊性纤维化跨膜调节剂(红色)和CK-18(绿色)的免疫染色；图1J-图1R是照片，其分别图示源自15w(图1J-L)、18w(图1P-R)和24w(图1M-O)组织的植入物的典型的H&E染色。箭(arrow)指示包囊(cyst)。在图1M中，示出包囊的宏观图像。
图2A-图2O描述了在人胚肺中早期祖细胞和它们的巢(龛影，niches)的识别。图2A-图2D是照片，其图示在不同妊娠时间点的人胚肺组织的H&E染色，揭示了支气管和细支气管结构而没有任何肺泡结构；图2E-图2F是照片，该照片图示免疫组化染色，其显示CK5+细胞在较大气道中的高表达以及CK5和CK14在较大支气管中的共表达。箭(arrow)和箭头(arrow head)分别指示具有高和低CK5表达的区域。在支气管和发育中的肺泡结构中的CK5+细胞伴随有丰富的神经分布(innervation)，其是通过与巢蛋白+和CGRP+细胞接触(图2G)、以及通过神经丝(NF)的染色(图2H)所说明的；图2I是照片，其图示α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞；图2J是照片，其图示紧密靠近CK5⁺祖细胞的波形蛋白⁺间充质细胞；图2K-图2N是照片，该照片图示在不同时间点时CK5的染色(红色)，时间点包括人妊娠的15(图2K)、17(图2L)、20(图2M)和22(图2N)周，其显示CK5表达水平的差异；图2O是图形，该图形图示由CK5+祖细胞占据的组织面积的定量形态分析，其显示在20-22周时的显著(t检验)更高水平，一个菱形表示非显著的p值，两个菱形表示p<0.002)。
图2P-图2Z示出在不同妊娠时间点收获的人胚肺组织中早期非造血祖细胞的FACS分析。图2P-图2Q图示20w肺细胞的代表性的FACS分析，其示出用抗CD45和抗CD34的双重着色。示出在非造血CD45-细胞内的三个亚群，包括CD45-CD34^高、CD45-CD34^中等和CD45-CD34^阴性细胞；图2R-图2T图示用抗CD117(c-kit)和抗CD271(间充质分化标志物)的双重着色，其揭示了每个亚群的水平；图2U-图2Z图示在不同的人胚肺组织中的CD45-CD34^阴性群体内单阳性CD117+细胞的百分比。
图3A-图3C示出在21周时收获的肺组织的移植之前，CK5、ULEX凝集素和CD117的三重染色。中央气道(图3A)和主支气管(图3B)，其显示在较大气道中CK5的高表达，被较大血管所包围。稀少的CD117⁺细胞存在于血管周边间隙中。在较小气道(图3C)的密切接触较小血管的区域 中，观测到CK5的较低表达，同时许多CD117⁺细胞存在于这些血管内(粉红色；对于ULEX凝集素和CD117为双阳性)。
图4A-图4K示出在21周时收获的肺组织的移植之前E-钙粘蛋白、CD34和CD117的三重染色。图4A图示CD34的单染色；图4B图示CD117的单染色；图4C图示与E-钙粘蛋白染色的合并。示出两个相邻区域的全景图像，其包括较大支气管和发育中的肺泡结构。在发育中的肺泡结构的区域中的大多数CD34⁺细胞共表达CD117(图4D-G)，而在较大气道区域中，在紧密靠近血管处可以看到稀少的单阳性CD117⁺细胞(图4H-K)。
图5A-图5D是照片，示出在20w人肺中三个相邻场的全景视图，其图示具有不同强度的表达的CK5阳性区域的存在(红色，图5A)，在较大支气管中和在发育中的肺泡(蓝色，图5B)中，其被血管(蓝色，图5B)和α-SMA阳性细胞(绿色，图5C)所包围，提示不同的巢(所有3个区室的重叠示于图5D)。条＝50μm。
图6A-图6L示出两个不同成人肺样品的多色FACS分析。平行于人胚肺组织进行成人肺组织的多色FACS分析。在用胶原酶和分散酶对组织进行酶解以后，染色单细胞悬液，然后通过CD34(对造血和内皮祖细胞特异)、CD45(造血细胞)、CD31(用于内皮细胞的标志物)、CD117(c-KIT，用来鉴别早期祖细胞)、CD271(NGFR-间充质干细胞标志物)和CD326(EPCAM-上皮分化标志物)特异性抗体或等效同种型(isotype)对照加以染色。在两个样品中均确定了CD34⁺和CD34^-群体(图6A、图6D、图6G和图6J)。在成人和胚胎肺组织之间观测到显著的差异。在成人肺中确定了低得多的水平的CD34⁺细胞。当测试c-kit⁺群体的存在时，确定了非常小的CD34⁺CD117⁺和CD34^-CD117⁺群体(图6B、图6E、图6H和图6K)；大多数CD34⁺CD117⁺细胞相对于CD31标志物是阳性的并且只有较小的百分比相对于CD31标志物是阴性的(图6C、图6F、图6I和图6L)，并且发现大部分的CD34^-CD117⁺群体相对于CD31和CD326是阴性的(图6F和图6L)。
图7A-图7I示出20w HEL的FACS分析，显示CD45-CD34+和CD45-CD34-亚群(图7A)。在CD34阳性(图7B)和阴性(图7C)细胞亚群中的CD117⁺染色。大多数CD34+CD117+亚群相对于CD31或CD326标志物是阳性的(图7D、图7F-图7G)。大多数CD34^-CD117⁺细胞相对于CD31 和CD326标志物是阴性的(图7E、图7H-图7I)。示出代表性的直方图，其中红线表示CD31和CD326标志物的同种型对照，蓝线表示CD34+CD31+亚群以及绿线表示CD34+CD326+亚群(图7F-图7G)；在图7H-I中，蓝线表示CD34-CD31+亚群并且绿线表示CD34-CD326+亚群。这些发现证实了两种不同CD117⁺群体的存在，如通过免疫组织化学所证明的。
图8A-图8D示出15w(图8A-B)和17w(图8C-D)HEL相对于ulix血管标志物(蓝色)、CK5(绿色)和CD117(红色)的免疫组化染色，其显示双重CD117表达模式。发现若干单CD117⁺细胞紧密靠近较大气道和血管，而它们的大多数共定位在围绕发育中的肺泡结构的血管内。
图9A-图9D示出20w人肺的早期和晚期内皮祖细胞(EPC)的存在的分析。此图确定了两个轻微不同的CD34+CD31+亚群(图9B)的存在。第一亚群是通过相对于CD14和CD45的阳性染色(图9C)加以确定，而第二亚群是CD45-CD105+(图9D)。
图10A-图10E示出在同源(同基因的，同系的，syngeneic)小鼠的肾小囊下植入前后，胚胎组织的特征。图10A-图10C是照片，该照片图示典型的H&E染色，与在E16小鼠胚胎植入物(n＝5)以后获得的明显的生长和分化(图10C-E)相比，其显示在SCID小鼠(n＝7)的肾小囊下移植后12周时的E14(图10A)和E17(图10B)肺组织的不良生长；图10D-图10E是照片，该照片图示H&E染色，其显示在E16小鼠胎肺的植入物中的较大气道(较大箭头)和肺泡结构(较小箭头)以及细胞角蛋白染色。
图10F示出在小鼠和人肺发育中平行阶段的示意图。用于移植的"最佳窗口"是在发育的小管(canalicular)阶段内。
图11A-图11Y示出在移植之前在E16小鼠胚肺中的肺祖细胞的特征。图11A是照片，该照片图示E16胚肺的H&E染色，其显示不成熟的结构和肺泡结构的缺失；图11B是照片，其图示在E16小鼠组织(类似于人胚肺)中的CK-5阳性细胞(蓝色)在较大气道中具有较高表达。许多神经上皮体(由CGRP(红色)阳性染色的)和酪氨酸羟化酶(TH，绿色)被发现存在于整个样品中，并位于巢中；图11C是照片，其图示CCSP-阳性细胞被发现存在于较大气道的区域中，此外富含巢蛋白阳性细胞并被α-SMA阳性细胞所包围(图11D，白色箭头)，这提示干细胞巢；图11E-图11G是在 用胶原酶和分散酶处理以后，在E13、E14、E15和E16肺源性单细胞悬液中，CD45^-CD31^-CD326⁺CD24⁺CD49f⁺CD104⁺细胞的代表性的多色FACS分析(分别为n＝10、10、12和10，数值表示来自两个不同实验的平均值±SD)。表明在E15-16肺中这种细胞群体的显著较高丰度(p<0.007)；图11Y是CD45^-CD31^-CD326⁺CD24⁺CD49f⁺CD104⁺细胞水平的总结，其示出通过学生t测试计算的统计显著性(一个菱形表示p<0.037，两个菱形表示p<0.007，细胞门控策略描述于以下的实施例部分)。
图12A-图12F是照片，该照片描述成熟C57B1肺的免疫组化染色，其显示巢蛋白和CGRP(图12A-B)的存在，类似于它们在胚胎小鼠肺的干细胞巢中的表达(图12A，较低放大率，条＝50μm，图12B，较高放大率，条＝20μm)。在图12A中的框表示图12B所示放大的位置；图12C-图12F是照片，该照片图示成熟C57B1肺的三重染色：α-SMA(绿色，图12C)，CGRP(红色，图12D)和E-钙粘蛋白(蓝色，与α-SMA和CGRP叠加，图12E)，条＝50μm；以及图12F图示在图12E中标记的方块的放大区，条＝20μm。
图13A-图13D示出在低功率放大倍率下嵌合肺的荧光显微图，其显示在不同调理方案以后植活的GFP⁺细胞的不同数目的病灶。图13A-图13C是用以下处理的动物的嵌合肺的代表性图像的照片：6Gy TBI(图13A)，仅NA(图13B)，和NA加上6GY TBI(图13C)；图13D是在不同调理方案以后植活细胞的GFP⁺斑块/mm³的定量形态分析(在每组中，n＝10)。介绍了3个独立实验的结果。
图14A-图14L是照片，示出在注入E16细胞前后，CCSP⁺细胞的染色。图14A示出未经治疗的对照小鼠的较大气道的腔；图14B示出在用萘和6Gy TBI调理一天以后实验动物的肺，其显示CCSP+细胞的剥落；图14C示出在注入E16细胞以后用萘和6Gy TBI调理30天的动物的肺，其显示在支气管腔中具有植活的GFP+细胞(绿色)的上皮层的显著再生，其被血管化，如由V-E钙粘蛋白的染色所指示的；图14D-图14L示出，移植细胞(图14D-图14F)加入上皮层，再生CCSP⁺细胞(红色)，能够产生表面活性物质(图14G-I)，以及表现出离子转运潜力，如由CFTR的染色所指示的(图14J-L)。
图15A-图15C是照片，该照片示出2光子显微图，其揭示在植入肺中的嵌合现象水平。在移植6(图15A-B)和16(图15C)周以后，移植小鼠的代表性的2光子显微肺图像，其中没有(图15A)和与非靶向量子点(红色)的血管的共染色(图15B)。
图16A-图16L是照片，其示出在移植以后16周时嵌合肺的免疫组化表征。图16A-图16D是用抗GFP抗体(绿色)、抗CD31抗体(红色)和抗光谱细胞角蛋白(pancytokeratin)抗体(蓝色)染色的嵌合肺的代表性图像，其显示在移植肺的血管和上皮区室中加入GFP⁺细胞，而没有疤痕或纤维化的体征；图16E-图16H是用抗GFP(绿色)和抗AQP-5抗体(红色)染色的嵌合肺的代表性图像，其显示移植组织加入I型肺泡细胞(alveocyte)的气体交换表面；图16I-图16L是用抗GFP(绿色)、抗CD31(红色)和抗sp-C抗体(蓝色)染色的嵌合肺的图像，其显示在表面活性物质合成中参与移植细胞的II型肺泡细胞。
图17A-图17E是照片，该照片示出通过2光子显微图，条＝90μm(对照肺，图17A)，或用抗GFP(绿色)、抗细胞角蛋白(蓝色)和抗CD31抗体对嵌合肺进行的三重染色加以分析的对照非移植C57B1肺的外观，其显示在肺的和血管区室中的嵌合现象，以及完全加入结构，而没有疤痕或纤维化的体征，在低放大倍率下，条＝200μm(图17B-E)。在绿色荧光通道中，由点线来指示GFP+嵌合病灶(图17B)。在红色和蓝色通道中，还由点线来指示相同的嵌合区，显示在血管(图17C)和上皮(图17D)区室中从受体到供体组织的平稳过渡，以及在图17E中示出所有层的叠加。
图18A-图18I是照片，其示出在移植后的不同时间点人源性肺细胞在小鼠肺中的植活和加入。图18A-图18C示出在移植后6周时在小鼠肺中的嵌合现象，其在低放大倍率下显示染色：小鼠MHC(红色)和相对于MNF-116为阳性的人类组织(绿色)；图18D-图18F示出在移植后6周时在小鼠肺中的嵌合现象，其在高放大倍率下显示染色：小鼠MHC(红色)和相对于MNF-116为阳性的人类组织(绿色)；图18G-图18I示出另外的场，其是如在图18D-图18F中染色的。
图19A-图19F是照片，其示出在移植后7周时在移植小鼠的肺支气管中典型的嵌合现象。图19A和19D示出人类细胞，该人类细胞源自人类胚胎细胞，其用包含抗MNF(上皮标志物)、抗人波形蛋白9(基质细胞特 有的)，和标记有Daylight 488(绿色)的小鼠抗人CD31(内皮细胞标志物)的小鼠抗人抗体的混合物(cocktail)加以选择性地染色；图19B和图19E示出在小鼠肺中的小鼠来源的细胞，其用标记有Alexa-fluor 546(红色)的Banderia凝集素加以染色。已知后者结合于表达在小鼠上皮和内皮细胞上的a-Ga。上图显示在低放大倍率下的嵌合场(图19C)；下图显示在高放大倍率下的相同区域(图19F)。
图20A-图20F是照片，示出在移植后7周的移植小鼠的肺泡中典型的嵌合现象。图20A和图20D示出人类细胞，该人类细胞源自人类胚胎细胞，其用包含抗MNF(上皮标志物)、抗人波形蛋白9(基质细胞特有的)，和标记有Day light 488(绿色)的小鼠抗人CD31(内皮细胞标志物)的小鼠抗人抗体的混合物加以选择性地染色；图20B和图20E示出在小鼠肺中小鼠来源的细胞，其用标记有Alexa-fluor 546(红色)的Banderia凝集素加以染色。已知后者结合于表达在小鼠上皮和内皮细胞上的、但并不结合于表达在它们的人对应物(counterpart)上的a-Gal。上图显示在低放大倍率下的嵌合场(图20C)；下图显示在高放大倍率下的相同区域(图20F)。
图21A-图21C是照片，示出人类细胞加入肺实质。图21A示出人类细胞，其用包含如上所述的抗MNF117、抗V9、抗CD31的抗人抗体，以及兔抗细胞角蛋白抗体(红色)的混合物加以染色(绿色)，其染色小鼠和人类细胞角蛋白(图21B)。两种颜色的合并显示在肺实质内的人类细胞(图21C)。
图22A-图22C是照片，示出人类细胞加入肺气体交换表面。用包含括抗MNF117、抗V9和抗CD31(如上所述)(图22A)的抗人抗体，以及山羊抗AQP-5(红色)的混合物来染色(绿色)人类细胞，其染色小鼠和人AQP-5(图22B)。两种颜色的合并显示在肺气体交换表面内的人类细胞(图22C)。
图23A-图23F是照片，示出在嵌合小鼠的肺泡内的植活的人肺细胞参与表面活性物质的生产。用如上所述的包含抗MNF117、抗V9和抗CD31的抗人抗体(图23A和23D)，以及兔抗SPC抗体(红色)的混合物来染色(绿色)人类细胞，其染色小鼠和人表面活化蛋白C(图23B)。两种颜色的合并显示移植的人类组织参与表面活性物质的生产(图23C)。下图(图23D-F)显示在高放大倍率下在图23C中标示的方形区域的染色。
图24A-图24H是照片，示出在NOD-SCID小鼠的肺中用CMTMR染色的20w人肺源性单细胞悬液的植活，条＝500μm(图24A)；在同源移植模型中，GFP⁺斑块表示源自移植小鼠胚胎肺细胞的肺细胞，条＝1mm(图24B)；图24C-图24E示出用小鼠抗人类细胞角蛋白MNF 116抗体(绿色，图24C)和大鼠抗小鼠MHC(红色，图24D)对人类胚肺组织进行的对照染色，其相对于MNF116是阳性的而相对于小鼠MHC是阴性的(两者的叠加示于图24E)；图24F-图24H示出用抗人MNF116抗小鼠MHC抗体对小鼠肺细胞进行的对照染色，其显示相对于MNF116的阴性染色以及相对于小鼠MHC的阳性染色，条＝50μm。
图25A-图25D是照片，示出植入有E16小鼠胚胎肺组织的小鼠的长期随访，其没有显示出畸胎瘤的证据。图25A示出在移植1年以后移植肺的宏观外观，其显示光滑的边缘和无肿瘤；图25B-图25C示出H&E染色，在较低高放大倍率下(图25B)和在较高放大倍率下(图25C)示出在移植1年以后，移植肺的正常形态；图25D示出典型的移植动物的体内肺CT图像的冠状面(coronal view)，其显示实验肺的正常放射学外观。
具体实施方式
在本发明的一些实施方式中，涉及哺乳动物胚胎肺细胞，并且更具体地但不排他地，涉及上述细胞用于治疗应用的用途。
参照附图和随附描述，可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一种实施方式以前，应当理解的是，本发明的应用不一定限于在以下描述中阐述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够具有其他实施方式或以各种方式加以实施或进行。另外，应当理解的是，本文中采用的措辞和术语是用于说明的目的而不应该被认为是限制性的。
先前的研究已经定义了用于移植不同器官的人和猪胚胎组织的"窗口"，不同器官包括肾、肝、胰腺、肺和心脏。因此，例如，肺‘窗口’显示为42至80天的猪孕龄[PCT公开号WO 2006/038211；Eventov-Friedman S.et al.,Proc Nat Acad of Sciences.(2005)102(8):2928]。另外的研究表明，源自成人组织如骨髓或源自脐带血、羊水或胎盘的早期祖细胞，包括间充质干细胞、内皮祖细胞或循环纤维细胞以及各种各样的其他群体，可以结构上 植活和分化为气道和肺泡上皮细胞或分化为血管内皮细胞或肺间质细胞并且可以用于修复和再生损伤或患病的肺。
当实施本发明时，本发明的发明人已经确定了获自20-22周的人孕龄的‘窗口’的胚胎肺组织的独特的细胞群体，其包含众多的肺祖细胞，它们可以用于修复损伤/患病的肺。令人惊讶地，这样的细胞群体的悬浮液，其并不保持组织结构，可以用来再生上皮、间充质和内皮肺组织。
如在下文和在接着的实施例部分中所示出的，本发明的发明人已经首次说明了，分离的细胞群体悬浮液，即在20-22周的人妊娠时(参见实施例1，在接着的实施例部分中)，在给予以后，可以用来再生肺组织和恢复肺功能。
因此，本发明的发明人已经表明，20-22周的人妊娠的分离的细胞群体和小鼠胚胎肺组织的类似的小管‘窗口’，其定义在妊娠的15-16天(参见实施例1，在接着的实施例部分中)，与在较早或较晚的妊娠时间点收获的组织(参见实施例1，在接着的实施例部分中)相比，呈现出最高水平的假定的肺前体(包括上皮、内皮和间充质祖细胞)。此外，给予(例如静脉内给予)获自这种妊娠窗口的组织的单细胞悬液实现显著的肺修复。具体地，肺前体细胞归巢、分化并整合在小鼠的损伤肺中，使得形成整个呼吸单元，包括形成新的上皮细胞和新的血管(参见实施例2，在接着的实施例部分中)。此外，在使用萘处理以及有或没有亚致死全身照射(TBI)进行受体小鼠的进一步调理以后，这种过程得到显著增强，从而导致在损伤肺的不同的细胞谱系中大量和持久的嵌合现象(参见实施例2，在接着的实施例部分中)。总而言之，这些结果证实了，在20-22周妊娠时收获的人胚肺前体组织的单细胞悬液可用于治疗包括肺疾病和损伤的上皮、间充质和内皮病症。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含来自哺乳动物胎儿肺组织的细胞悬液的分离群体作为活性组分，其中胎儿肺组织处于对应于在选自约20至约22周的妊娠的范围内的妊娠阶段的人肺器官/组织的发育阶段的发育阶段。
如在本文中使用的，短语"细胞悬液的分离群体"是指已分离自它们的自然环境(例如，人体)的细胞被自组织提取而同时保持生存力(viability)， 但并不保持组织结构(即，没有血管化组织结构)并且并不附着于固相载体(solid support)。
取决于应用，可以使用细胞悬液的分离群体，其包含同源或非同源细胞(相对于受试者)，来实施上述方法。
如在本文中使用的，术语“同源”细胞是指这样的细胞，其与受试者在遗传上是基本相同的或基本上都是受试者的淋巴细胞。同源细胞的实例包括源自受试者(在本领域中还被称为“自体的”)、源自受试者的克隆或源自受试者的同卵双胞胎的细胞。
如在本文中使用的，术语“非同源的”细胞是指这样的细胞，其与受试者遗传上不是基本相同的或并非基本上都是受试者的淋巴细胞，如同种异体细胞或异种细胞。
如在本文中使用的，术语“同种异体的”是指源自和受试者为相同物种、但其基本上与受试者是非克隆的供体的肺组织的细胞。通常，相同物种的远交的、非合子的孪生哺乳动物是彼此同种异体的。可以理解的是，相对于受试者，同种异体细胞可以是HLA相合的、HLA部分相合的或HLA不相合的(即，展示一种或多种不同的HLA决定子)。
如在本文中使用的，术语“异种的”是指相对于受试者的相当大比例的淋巴细胞的物种，其基本上表达不同物种的抗原的细胞。通常，不同物种的远交的哺乳动物彼此是异种的。
本发明设想，异种细胞是源自各种各样的物种(如下文进一步详细地描述的)。
异种来源(例如猪来源)的细胞或组织优选获自一种来源，其已知没有人兽互通病，如猪内源性逆转录病毒。类似地，人源性细胞或组织优选获自基本上无病原体的来源。
根据本发明的一种实施方式，受试者是人类并且细胞的分离群体是来自人类来源(例如人胎儿)的。
取决于应用和可用来源，本发明的细胞可以是原初或基因修饰的。这样的确定是很好地在本领域普通技术人员的能力范围内。
因为当给予受试者时非同源细胞有可能诱导免疫反应，所以已开发了若干方法来降低非同源细胞的排斥的可能性。这些方法包括在移植以前抑制受体的免疫系统或将非自体细胞包封在免疫分离的、半渗透膜中。可替代地，可以使用这样的细胞，其并不表达异种表面抗原，如在转基因动物(例如猪)中开发的那些。
如在本文中使用的，短语"肺组织"是指肺组织或器官。本发明的肺组织可以是完整的或部分器官或组织。因此，本发明的肺组织可以包括右肺、左肺或两者。本发明的肺组织可以包括一个、两个、三个、四个或五个肺叶(来自右肺或左肺)。此外，本发明的肺组织可以包括一个或多个肺段或肺小叶。此外，本发明的肺组织可以包括任何数目的支气管和细支气管(例如支气管树)和任何数目的肺泡或肺泡囊。
根据本发明的一种实施方式，肺组织处于对应于在约20至约21天妊娠、约20.5至约21.5天妊娠、约20至约22天妊娠、约20.5至约22.5天妊娠、约21至约22天妊娠、约21.5至约22.5天妊娠的妊娠阶段的人肺器官/组织的发育阶段的发育阶段。
根据一种具体实施方式，肺组织处于对应于在约20至约22天妊娠的妊娠阶段的人肺器官/组织的发育阶段的发育阶段。
根据另一种具体实施方式，肺组织处于对应于在约21至约22天妊娠的妊娠阶段的人肺器官/组织的发育阶段的发育阶段。
根据另一种具体实施方式，肺组织处于对应于在约20至约21天妊娠的妊娠阶段的人肺器官/组织的发育阶段的发育阶段。
如上所述，本发明的肺组织获自哺乳动物生物体。
因此，本发明的肺组织可以源自任何哺乳动物。用于肺组织的适宜的物种来源包括主要的家养或家畜动物和灵长类动物，关于分化阶段与妊娠阶段的相关性，它们已得到广泛表征。这样的动物包括猪类(例如，家猪)、牛科动物(例如，奶牛)、马科动物(例如，马)、羊类(例如，山羊、绵羊)、猫科动物(例如，家猫(Felis domestica))、犬(例如，家犬(Canis domestica))、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠)和灵长类动物(例如，黑猩猩、恒河猴(rhesus monkey)、猕猴(macaque monkey)、狨猴)。
根据一种具体实施方式，肺组织是源自人类。
根据一种具体实施方式，肺组织是源自非人生物体。
各种方法可以用来获得在发育阶段的肺组织，上述发育阶段基本上对应于人源性肺组织的发育阶段(如目前所教导的)。可以通过自在这样的妊娠阶段(即，其对应于人20-22周的妊娠)的发育中的胎儿，例如通过外科手术，收获肺组织来获得这样的肺组织。本领域技术人员将明了，生物体的妊娠阶段是在产生生物体的卵细胞的受精以后的时间段。
可替代地，可以通过细胞、器官/组织的体外培养来获得在所期望的发育阶段的肺组织。常规进行细胞、组织或器官的这样的受控的体外分化，例如，使用培养胚胎干细胞系来产生包含所期望谱系的细胞/组织/器官的培养物。例如，关于肺世系(lineage)的产生，参见例如，Otto WR.,1997.Int J Exp Pathol.78:291-310。
下表提供了人和猪肺组织的妊娠阶段的实例，在这些妊娠阶段下，这些人和猪肺组织可以提供基本上处于相应的发育阶段的肺组织：
表1：猪和人的相应的妊娠阶段

猪肺组织的妊娠阶段(天)人肺组织的妊娠阶段(天*)1844204922542356-572561-6226632868-69317538924210246112491195613662151721758019588214
可以根据以下公式计算属于给定物种(其是在基本上对应于猪肺组织的发育阶段的发育阶段)的肺组织的妊娠阶段(以天为单位)：[猪肺组织的妊娠阶段，以天为单位]/[猪的妊娠期，以天为单位]×[给定物种的肺组织的妊娠阶段，以天为单位]。类似地，可以根据以下公式计算属于给定物种(其是在基本上对应于 人肺组织的发育阶段的发育阶段)的肺组织的妊娠阶段(以天为单位)：[人肺组织的妊娠阶段，以天为单位]/[人的妊娠期，以天为单位]×[给定物种的肺组织的妊娠阶段，以天为单位]。猪的妊娠阶段是约115天而人的妊娠阶段是约280天。
*对于周计算，数字除以7。
在获得胎儿肺组织以后，本发明进一步设想从其产生细胞的分离群体。
如在本文中使用的，"单细胞悬液"是指胎儿肺单细胞悬液，其包含单细胞或在聚集体中不多于5、10、50、100、200、300、400、500、1000、1500、2000个细胞的细胞聚集体。
可以通过任何机械或化学(例如酶促)方式来获得本发明的单细胞悬液。存在若干种方法，用于从主要组织、在培养物中的附着细胞和聚集体来来解离细胞从簇(cell cluster)以形成单细胞悬液，例如，物理力(机械解离如细胞刮棒、通过窄孔吸移管的研制、细针抽吸、漩涡解聚和通过细尼龙或不锈钢丝网的强制过滤)、酶(酶解如胰蛋白酶、胶原酶、蕲蛇酶(Acutase)等)或两者的组合。
因此，例如，可以通过使组织经受酶如IV型胶原酶(Worthington biochemical corporation,Lakewood,NJ,USA)和/或分散酶(Invitrogen Corporation products,Grand Island NY,USA)来将胎儿肺组织酶消化成分离细胞。例如，可以在37℃下，在例如胶原酶、分散酶和CaCl₂的存在下，通过用刀片精细切碎组织约1小时来酶消化肺组织。上述方法可以进一步包括从获得的细胞悬液除去非特异性碎片，例如，用通过过滤器(例如，70和40μm过滤器)的连续过滤，其基本上如在接着的实施例部分的“一般材料和实验方法”中所描述的。
此外，可以使用设计用来将组织破碎成预定尺寸的装置将胎儿肺组织机械解离成分离细胞。这样的装置可以获自CellArtis Goteborg，瑞典。另外或可替代地，可以使用针如27g针(BD Microlance,Drogheda，爱尔兰)来手动进行机械解离，同时在倒置显微镜下观察组织/细胞。
在胎儿肺组织的酶促或机械解离以后，使用200μl吉尔森(Gilson)吸头将解离的胎儿肺细胞进一步破碎成小团块(例如，通过上下吸取细胞)。
根据本发明，人胎儿肺细胞的单细胞悬液包含活细胞。可以使用本领域中已知的任何方法，例如，使用细胞活力测定(例如MultiTox Multiplex Assay，其可获自Promega)、流式细胞计量术、台盼蓝(Trypan Blue)等，来监测细胞活力。
通常，胎儿肺细胞的分离群体立即用于移植。然而，在其中在移植之前细胞被保持在悬浮液中(例如1-12小时)的情况下，可以在能够支持细胞生存力的培养基中培养细胞。这样的培养基可以是基于水的培养基，其包含如盐、营养物、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白质如细胞因子、生长因子和激素的物质的组合，对于维持胎儿肺细胞的分离群体处于可生存状态，它们均是需要的。例如，根据本发明的此方面的培养基可以是合成组织培养基如Ko-DMEM(Gibco-Invitrogen Corporation products,Grand Island,NY,USA)、DMEM/F12(Biological Industries,Beit Haemek，以色列)、Mab ADCB培养基(HyClone,Utah,USA)或DMEM/F12(Biological Industries,Biet Haemek，以色列)，补充有必要的添加剂。优选地，在本发明的培养基中包括的所有组分是基本上纯的，具有组织培养级。
分离自胎儿肺组织的细胞可以包含细胞的异源群体。
根据一种实施方式，细胞悬液的分离群体包含祖细胞。祖细胞可以包括，例如，上皮祖细胞、间充质祖细胞、造血祖细胞和/或内皮祖细胞。
根据一种实施方式，细胞包括细胞角蛋白5+(CK5+)标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括细胞角蛋白5+(CK5+)和细胞角蛋白14+(CK14+)标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括c-Kit+CD45-CD34-标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括c-Kit+CD45-CD34-CD31-CD326-CD271-标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括c-Kit+CD34+标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括c-Kit+CD34+CD31+标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括c-Kit+CD34+CD326+标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括CD34+CD31+CD14+CD45+标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括CD34+CD31+CD45-CD105+标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括巢蛋白+标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括降钙素基因相关蛋白+(CGRP+)标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括α平滑肌肌动蛋白+(α-SMA+)标志物表达。
根据一种实施方式，细胞包括波形蛋白+标志物表达。
根据一种具体实施方式，上文提到的每个细胞群体可以是约50％、60％、70％、80％、90％或100％纯化。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行特定细胞类型的纯化，例如，通过基于亲和力的纯化(例如如通过使用MACS珠、FACS分选仪和/或俘获ELISA标记)，其中使用特异性抗体，其识别任何上述细胞标志物(例如CK5、CK14、c-Kit、CD31、CD34、CD45、CD105、CD271、CD326等)。
根据本发明的一种实施方式，细胞悬液的分离群体包括胎儿肺细胞的分离群体的未纯化的混合物。
根据另一种实施方式，细胞悬液的分离群体包含胎儿肺细胞的细胞类型特异性群体(如上文进一步详细地表明的)。可以通过本领域技术人员已知的任何方法来分离这样的细胞，例如，通过基于亲和力的纯化(例如如通过使用MACS珠、FACS分选仪和/或俘获ELISA标记，如上所述)或通过借助地靶向它们的特异性抗体来根除(例如杀伤)不想要的细胞。
可以理解的是，在细胞悬液的分离群体内的细胞能够使结构性/功能性肺组织再生，包括产生嵌合肺。嵌合肺包括肺泡、支气管和/或细支气管结构和/或血管结构。此外，结构性/功能性肺组织包括合成表面活性物质[例如克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)、水通道蛋白-5(AQP-5)和表面活化蛋白C(sp-C)](通过特异性细胞染色可检测)的能力，和/或转运离子(例如如通过染色CFTR-囊性纤维化跨膜调节剂所指示的)的能力。在细胞悬液的分离群体内的细胞进一步能够使上皮、间充质和/或内皮组织(例如上皮、间 充质和/或内皮组织，如由包含所有这些组成的全部嵌合肺组织的形成所指示的)再生。
因此，在其中需要使上皮、间充质和/或内皮组织(包括肺组织)再生的情况下，分离自胎儿肺组织的细胞的应用是特别有益的。
因此，根据本发明的另一个方面，提供了用于在需要其的受试者中使上皮、间充质和/或内皮组织再生的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的本发明的一些实施方式的药物组合物。
根据本发明的另一个方面，提供了用于在需要其的受试者中治疗其中上皮、间充质和/或内皮组织的再生是有益的疾病或病症的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的本发明的一些实施方式的药物组合物。
根据本发明的另一个方面，提供了在需要其的受试者中治疗肺疾病或损伤的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的本发明的一些实施方式的药物组合物。
如在本文中使用的，术语“上皮组织”是覆盖(衬，line)在整个哺乳动物身体中的结构的任何腔或表面的组织。示例性上皮组织包括但不限于肺组织、胃肠道组织、生殖器官组织、泌尿道组织、肾组织、皮肤组织、缺血组织、心脏组织、内皮组织、循环组织和脑组织。
如在本文中使用的，术语“间充质组织”是指在哺乳动物身体中的结缔组织，其大部分源自中胚层。示例性间充质组织包括但不限于身体的结缔组织、血液和淋巴管。
如在本文中使用的，术语“内皮组织”是指覆盖(衬)血管和淋巴管的内表面的细胞的薄层。示例性内皮组织包括但不限于淋巴组织和循环系统组织(例如血管)。
如在本文中使用的，术语“使组织再生”是指重建上皮、间充质或内皮组织，使得形成功能性组织(即，其在指定区域中行使自然组织的功能的组织)。因此在本发明的一些实施方式中，再生是指上皮、间充质或内皮组织的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的增加。
本领域技术人员已知的任何方法可以用来评估上皮组织(例如肺组织)、间充质组织(例如结缔组织)或内皮组织(例如血管)的再生，例如，使用来自上皮组织(例如通过染色克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)、水通道蛋白-5和表面活化蛋白C表达)、间充质组织(例如通过染色波形蛋白⁺表达)或内皮组织(例如通过染色CD31表达)的组织样品的X射线、超声、CT、MRI、组织学染色。
如在本文中使用的，术语“受试者”或“需要其的受试者“是指哺乳动物，优选人类，任何年龄的雄性或雌性，由于疾病、病症或受伤的结果，其患有或易患上皮、间充质或内皮组织损伤或缺陷。
如在本文中使用的，术语“治疗”包括消除(abrogate)、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状，或基本上预防病症的临床或美学症状的出现。
如在本文中使用的，术语“其中上皮、间充质和/或内皮组织的再生是有益的疾病或病症”是指任何疾病、紊乱、病症，或是指任何病理学或不希望的病症、状态或综合征，或是指任何物理学、形态学或生理学异常，其涉及上皮、间充质和/或内皮组织的损失或缺陷(缺失)。通常，这样的疾病或病症包括肺功能紊乱、疾病或损伤；肾功能障碍、疾病或损伤；肝功能障碍、疾病或损伤；胃肠道紊乱、疾病或损伤；皮肤功能障碍、疾病或损伤；血管功能障碍、疾病或损伤；心脏功能障碍、疾病或损伤；或脑功能紊乱、疾病或损伤。
其中上皮组织的再生是有益的示例性疾病或病症包括但不限于慢性溃疡、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、阿尔茨海默氏病、帕金森病、皮肤烧伤、皮肤溃疡、皮肤创伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、气肿、石绵沉着病、肺纤维化(例如特发性肺纤维化)、肺动脉高压、肺癌、结节病、肺衰竭、急性肺损伤(成人型呼吸窘迫综合征)、先天性膈疝、早产儿呼吸窘迫综合征、早产儿慢性肺疾病(支气管肺发育不良)、表面活化蛋白B缺乏症(例如纯合表面活化蛋白B缺乏症)、肺泡蛋白沉着症、肺发育不良和肺损伤、角膜变性以及癌症。
其中间充质组织的再生是有益的示例性疾病或病症包括但不限于心脏疾病或病症、糖尿病、耳聋、克罗恩氏病、自体免疫病、白血病和淋巴瘤、癌症(例如乳癌)、镰状细胞病、肌萎缩侧索硬化以及代谢病。
其中内皮组织的再生是有益的示例性疾病或病症包括但不限于血管病、缺血、镰状细胞病、心血管病、动脉粥样硬化、糖尿病和自体免疫病[例如系统性红斑狼疮(SLE)和抗磷脂抗体综合征(aPS)]。
癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。癌性疾病的特定实例包括但不限于：髓样白血病如慢性髓细胞源性白血病、急性髓系白血病部分分化型(Acute myelogenous leukemia with maturation))、急性前髓细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病伴随嗜碱细胞增多、急性单核细胞性白血病、急性髓细胞性单核细胞白血病伴随嗜伊红细胞增多；恶性淋巴瘤，如伯基特氏(Birkitt's)非霍奇金淋巴瘤；淋巴细胞性白血症，如急性淋巴母细胞性(lumphoblastic)白血病、慢性淋巴细胞性白血病；骨髓增生性疾病，如实体瘤、良性脑膜瘤、唾液腺混合瘤、结肠腺瘤；腺癌，如小细胞肺癌、肾癌、子宫癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、肉瘤、脂肪肉瘤(Liposarcoma)、粘液型肉瘤(myxoid)、滑膜肉瘤(Synovial sarcoma)、横纹肌肉瘤(肺泡)、骨骼外粘液样软骨肉瘤、尤因氏瘤(Ewing's tumor)；其他癌性疾病包括睾丸和卵巢无性细胞瘤(dysgerminoma)、视网膜母细胞瘤、维尔姆斯氏瘤(Wilms'tumor)、神经母细胞瘤(Neuroblastoma)、恶性黑色素瘤、间皮瘤、乳癌、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌。
自体免疫失调/疾病的实例包括但不限于心血管疾病(例如动脉粥样硬化、血栓症、心肌梗死等)、类风湿病(例如类风湿性关节炎和强直性脊柱炎)、腺病(例如胰疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、格雷夫斯氏病(Graves’disease)、甲状腺炎等)、胃肠疾病(例如慢性炎症性肠疾病、乳糜泻(celiac disease)、结肠炎、回肠炎和克罗恩氏病)、皮肤疾病(例如自身免疫性大疱性皮肤病，如但不限于寻常性天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶状天疱疮)、肝病(例如肝炎、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎)、神经疾病(例如多发性硬化、阿尔茨海默氏病、重症肌无力、神经病、运动神经病；吉-巴综合征和自身免疫性神经病、肌无力、兰-伊肌无力综合征；肿瘤形成性神经疾病、小脑萎缩、肿瘤形成性小脑萎缩和僵人综合征；非肿瘤形成性僵人综合征、进行性小脑萎缩、脑炎、拉斯马森氏(Rasmussen’s)脑炎、肌萎缩侧索硬化、西德纳姆(Sydeham)舞蹈症、抽动秽语综合征(日勒德拉图雷特综合征，Gilles de la Tourette syndrome)和自身免疫性多内分泌腺病；免疫不佳神经病；获得性神经性 肌强直、先天性多发性关节挛缩(congenita)、神经炎、视神经炎和神经退行性(neurodegenerative)疾病)、肌肉疾病(例如肌炎、自身免疫性肌炎、原发性舍格伦氏(Sjogren’s)综合征和平滑肌自身免疫性疾病)、肾疾病(例如肾炎和自身免疫性间质性肾炎)、与生殖有关的疾病(例如反复流产)、结缔组织病(例如耳病、自身免疫性耳病和内耳的自身免疫性疾病)和系统性疾病(例如系统性红斑狼疮和系统性硬化)。如在本文中使用的，术语“肺疾病或损伤”是指任何疾病、失调、病症或是指任何病理学或不希望的病症、状态或综合征，或是指涉及肺组织的损失或缺陷的任何物理学、形态学或生理学异常。
与肺疾病或损伤相关的示例性疾病或病症包括但不限于囊性纤维化、气肿、石绵沉着病、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维化(例如特发性肺纤维化)、肺动脉高压、肺癌、结节病、肺衰竭、急性肺损伤(例如成人型呼吸窘迫综合征)、先天性膈疝、早产儿呼吸窘迫综合征、早产儿慢性肺疾病(支气管肺发育不良)、表面活化蛋白B缺乏症(例如纯合表面活化蛋白B缺乏症)、肺泡蛋白沉着症、肺发育不良和肺损伤。
可以以许多方式来给予受试者细胞悬液的分离群体，其取决于各种参数，如例如，待治疗疾病的类型、阶段或严重性，个体受试者特有的身体或生理参数，和/或所期望的治疗结果。例如，取决于应用和目的，可以以径选自以下组成的组的途径来完成给予细胞悬液的分离群体：气管内途径、支气管内途径、肺泡内途径、静脉内途径、腹腔内途径、鼻内途径、皮下途径、髓内途径、鞘内途径、心室内途径、心内途径、肌内途径、浆膜内途径、粘膜内途径、经粘膜途径、经鼻途径、直肠途径和肠途径。
根据一种实施方式，通过静脉内途径来完成给予。
可替代地，可以通过给予至各种合适的解剖位置来给予受试者细胞悬液的分离群体以具有治疗效果。因此，取决于应用和目的，可以将胎儿肺细胞的分离群体给予至同位(homotopic)解剖位置(细胞的器官或组织类型的正常解剖位置)，或给予至异位解剖位置(细胞的器官或组织类型的异常解剖位置)。
因此，取决于应用和目的，可以有利地将胎儿肺细胞的分离群体植入(例如移植)在肾小囊下，或植入肾、睾丸脂肪、皮下组织、网膜、门静脉、肝脏、脾脏、心腔、心脏、胸腔、肺、胰腺、皮肤和/或腹腔内空间。
例如，为了治疗胃肠疾病或病症，可以将本发明的细胞悬液的分离群体给予至肝脏、门静脉、肾小囊、皮下组织、网膜、脾脏、腹腔内空间、胰腺、睾丸脂肪和/或肠袢(小肠的U环的浆膜下层)。为了治疗肺部疾病或病症，可以将本发明的细胞悬液的分离群体给予肺、肾小囊下、肝脏、门静脉、皮下组织、网膜、脾脏、腹腔内空间、胰腺和/或睾丸脂肪。
可以将本发明的一些实施方式的胎儿肺细胞的分离群体本身或在药物组合物中(其中它与适宜的载体或赋形剂混合)给予生物体。
如在本文中使用的，"药物组合物"是指本文描述的一种或多种活性组分与其他化学成分如生理上适宜的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进将化合物给予生物体。
在本文中，术语"活性组分"是指负责生物效应的来自哺乳动物胎儿肺组织的细胞悬液的分离群体。
在下文中，短语"生理用载体"和"药用载体"(其可以互换使用)是指载体或稀释剂，其并不引起对生物体的显著刺激并且并不消除所给予化合物的生物活性和性能。佐剂包括在这些短语下。
在本文中，术语"赋形剂"是指加入药物组合物以进一步促进活性组分的给予的惰性物质。赋形剂的非限制性的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种类型的糖和淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于配制和给予药物的技术可以参见“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,PA，最新版本，其以引用方式结合于本文。
适宜的给予途径可以，例如，包括口服途径、直肠途径、经粘膜途径，尤其是经鼻、肠或胃肠道外递送，包括肌内、皮下和脊髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内，例如进入右或左心室腔、进入总冠状动脉(common coronary artery)，静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
用于药物递送到中枢神经系统(CNS)的常规方式包括：神经外科策略(例如，脑内注射或脑室内输注)；药剂的分子操纵(例如，生产嵌合融合蛋白，该蛋白包含转运肽，其对于与本身不能穿越BBB的药剂结合的内皮细胞表面分子具有亲合力)以尝试开发BBB的内源性转运途径中的一种；设计用来增加药剂的脂质溶解度的药理学策略(例如，水溶性剂与脂质或 胆固醇载体的结合)；以及通过高渗性破坏来短暂破坏BBB的完整性(甘露醇溶液注入颈动脉或使用生物活性剂如血管紧张肽的结果)。然而，这些策略都有局限性，如与侵入性外科手术相关的固有风险、由内源性转运系统内在的限制施加的尺寸限制、与全身给予嵌合分子(其由在CNS以外可以是活性的载体模体(基序，motif)组成)相关的潜在的不期望的生物副作用以及在BBB受到破坏的脑区内脑损伤的可能的风险，其使它成为非最佳的递送方法。
可替代地，可以以局部而非全身的方式来给予药物组合物，例如，经由将药物组合物直接注射到患者的组织区域(例如肺组织)。
可以通过本领域中众所周知的方法来制造本发明的一些实施方式的药物组合物，例如，用常规的混合、溶解、粒化、糖衣丸制作、磨细、乳化、包封、截留或冷冻干燥方法。
因此，可以以常规方式并使用一种或多种生理用载体(包括赋形剂和助剂，其促进将活性组分处理成制剂(其可以是药学上使用的))来配制供根据本发明的一些实施方式使用的药物组合物。适当的制剂取决于所选择的给予途径。
对于注射，可以在水溶液中、优选在生理相容性缓冲液如汉克氏(Hank’s)溶液、林格氏(Ringer’s)溶液或生理盐缓冲液中配制药物组合物的活性组分。对于经粘膜给予，在制剂中使用适用于待渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中通常是已知的。
对于口服给予，可以通过使活性化合物与在本领域中众所周知的药用载体结合来容易地配制药物组合物。这样的载体使得能够将药物组合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、稠浆剂(slurry)、混悬剂等，用于由患者口服摄取。可以使用固体赋形剂来制备用于口服使用的药物制剂，其中在添加适宜的助剂(如果需要的话)以后，可选地研磨产生的混合物，并处理颗粒的混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。适宜的赋形剂尤其是填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇；纤维素制剂如，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
糖衣丸核心被提供有适宜的涂层。为此目的，可以使用浓糖溶液，其可以可选地包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料加入片剂或糖衣丸涂层用于鉴别或用来表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括制备自明胶的压配式(push-fit)胶囊剂，以及制备自明胶和增塑剂，如甘油或山梨醇的软密封胶囊剂。压配式胶囊剂可以包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及可选的稳定剂混合的活性组分。在软胶囊剂中，可以将活性组分溶解或悬浮在适宜的液体中，如脂肪油、液状石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。用于口服给予的所有制剂应具有适用于所选给予途径的剂量。
对于口腔给予，组合物可以具有以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入的给予，方便地以喷雾剂的形式来递送供根据本发明的一些实施方式使用的活性组分，上述喷雾剂来自加压包或喷雾器，其中用适宜的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀门来递送计量的量以确定剂量单位。可以配制用于分配器的例如明胶的胶囊剂和药筒，其包含化合物和适宜的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可以配制本文描述的药物组合物用于胃肠道外给予，例如，通过推注或连续输注。可以以单位剂型来提供用于注射的制剂，例如，以安瓿或以多剂量容器，其可选地具有添加的防腐剂。组合物可以是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以包含配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠道外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，可以将活性组分的悬浮液制备成适当的油性或水性注射混悬剂。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬剂可以包含这样的物质，其增加悬浮液的粘度，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。可选地，悬浮液还 可以包含适宜的稳定剂或制剂，其增加活性组分的溶解度以允许制备高浓缩溶液。
可替代地，活性组分可以为粉末形式，用于在使用前与适宜的载体(例如，无菌、无热原水基溶液)结合(构造，constitution)。
还可以使用例如，常规的栓剂基质如可可脂或其他甘油酯将本发明的一些实施方式的药物组合物配制成直肠组合物如栓剂或滞留型灌肠剂。
适用于本发明的一些实施方式的药物组合物包括这样的组合物，其中以有效地实现预期目的量包含活性组分。更具体地，治疗有效量是指对于预防、减轻或改善病症的症状(例如，上皮的疾病，如，肺部疾病或病症)或延长待治疗的受试者的存活有效的活性组分(即包含胎儿肺细胞的细胞悬液的分离群体)的量。
治疗有效量的确定是在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细的公开内容。
对于在本发明的方法中使用的任何制剂，最初可以由体外测定和细胞培养测定估计治疗有效量或剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量以实现所期望的浓度或滴度。这样的信息可以用来更准确地确定在人类中的有用剂量。
可以用来评价胎儿肺细胞的分离群体的治疗有效量的示例性动物模型包括鼠科动物模型(例如小鼠)，其中通过例如腹腔内注射萘(例如大于99％纯)有或没有进一步的照射(例如在萘给予以后40-48小时)来诱导肺损伤，如详细描述于随后的实施例部分。
可以在体外、在细胞培养物或实验动物中，通过标准制药程序，来确定本文描述的活性组分的毒性和疗效。获自这些体外和细胞培养测定以及动物研究的数据可以用于制定用于人的剂量范围。取决于所采用的剂型和给予途径，剂量可以变化。可以由单个医生鉴于患者的病情来选择确切的制剂、给予途径和剂量。(参见例如，Fingl,et al.,1975,in"The Pharmacological Basis of Therapeutics",Ch.1p.1)。
可以单独调节剂量和间隔以提供充足水平的活性组分，其足以诱导或抑制生物效应(最小有效浓度，MEC)。对于每种制剂，MEC将会有所不同， 但可以估计自体外数据。为实现MEC所必要的剂量将取决于个体特征和给予途径。检测测定可以用来确定血浆浓度。
取决于待治疗病症的严重性和响应性，可以单次或多次给予剂量，其中治疗过程持续数天至数周或直到治愈或实现疾病状态的减弱。
给予的组合物的量当然将取决于待治疗的受试者、病痛的严重性、给予方式、处方医生的判断等。
根据一种实施方式，细胞悬液的分离群体包含至少约0.5x10⁵、1x10⁵、0.5x10⁶、1x10⁶、1.5x10⁶、2x10⁶、2.5x10⁶、3x10⁶、3.5x10⁶、4x10⁶、4.5x10⁶、5x10⁶、5.5x10⁶、6x10⁶、6.5x10⁶、7x10⁶、7.5x10⁶、8x10⁶、8.5x10⁶、9x10⁶、9.5x10⁶、10x10⁶个细胞/受试者的公斤体重。
根据一种具体实施方式，细胞悬液的分离群体包含至少约1x10⁶个细胞/受试者的公斤体重。
如果需要的话，可以以包或分配装置来提供本发明的一些实施方式的组合物，如FDA批准的试剂盒，其可以包含含有活性组分的一个或多个单位剂型。包可以，例如，包括金属或塑料箔，如透明包。包或分配装置可伴有给予说明书。包或分配器还可伴有关于由政府机构规定的形式的容器的通告，其中上述政府机构管理药物的制造、使用或安全，上述通告反映了政府机构对组合物或人或兽用给予的形式的认可。这样的通告，例如，可以是由美国食品和药物管理局批准的用于处方药物的标签或批准的产品说明书。配制在相容的药物载体中的包含本发明的制剂的组合物还可以加以制备，放置在适当的容器中，并标记用于治疗指定病症(如上文进一步详述的)。
胶囊化技术通常可分为微囊化，其涉及小球状载体，和巨囊化(macroencapsulation)，其涉及较大的扁平片材和中空纤维膜(Uludag,H.et al.(2000).Technology of mammalian cell encapsulation.Adv Drug Deliv Rev42,29-64)。
制备微囊剂的方法是本领域中已知的并且包括例如那些方法，其公开于：Lu,M.Z.et al.(2000).Cell encapsulation with alginate and α-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine).Biotechnol Bioeng 70,479-483；Chang,T.M.and Prakash,S.(2001)Procedures for microencapsulation of enzymes,cells and genetically engineered  microorganisms.Mol Biotechnol 17,249-260；以及Lu,M.Z.,et al.(2000).A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamineα-cyanocinnamylideneacetate).J Microencapsul 17,245-521。
例如，使用与甲基丙烯酸-2-羟乙基酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元聚合物壳复合的改性胶原来制备微囊剂，获得2-5μm的胶囊厚度。可以用另外的2-5μm的三元聚合物壳来进一步包封这样的微囊剂，以赋予带负电荷的光滑表面并以最大限度地减少血浆蛋白吸收(Chia,S.M.et al.(2002).Multi-layered microcapsules for cell encapsulation.Biomaterials 23,849-856)。
其他微囊剂是基于藻酸盐，一种海洋多糖(Sambanis,A.(2003).Encapsulated islets in diabetes treatment.Diabetes Thechnol Ther 5,665-668)，或它的衍生物。例如，可以在氯化钙存在的条件下通过在聚阴离子海藻酸钠和纤维素硫酸钠与聚阳离子聚(亚甲基-胍)盐酸盐之间的聚电解质络合来制备微囊剂。
可以理解的是，当使用较小胶囊时，改善细胞胶囊化。因此，当胶囊尺寸从1mm被减小到400μm时，会改善例如，胶囊化细胞的质量控制、力学稳定性、扩散性能和体外活性(Canaple,L.et al.(2002).Improving cell encapsulation through size control.J Biomater Sci Polym Ed 13,783-96)。此外，发现具有良好控制的孔尺寸(小至7nm)、定制的表面化学性质和精确的微结构的纳米多孔生物胶囊可以成功地免疫分离细胞的微环境(参见Williams,D.(1999).Small is beautiful:microparticle and nanoparticle technology in medical devices.Med Device Technol 10,6-9；以及Desai,T.A.(2002).Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation.Expert Opin Biol Ther 2,633-646)。
如上所述，为了促进非同源细胞的植活，本发明进一步设想，在给予细胞悬液的分离群体的以前、同时或以后，用免疫抑制疗法来治疗受试者。
在本领域的文献中提供了用于选择和给予用于移植的适宜的免疫抑制方案的充足的指导(例如，参考：Kirkpatrick CH.and Rowlands DT Jr.,1992.JAMA.268,2952；Higgins RM.et al.,1996.Lancet 348,1208；Suthanthiran M.and Strom TB.,1996.New Engl.J.Med.331,365；Midthun DE.et al.,1997.Mayo Clin Proc.72,175；Morrison VA.et al.,1994.Am J Med.97,14；Hanto DW.,1995.Annu Rev Med.46,381；Senderowicz AM.et  al.,1997.Ann Intern Med.126,882；Vincenti F.et al.,1998.New Engl.J.Med.338,161；Dantal J.et al.1998.Lancet 351,623)。
根据一种实施方式，免疫抑制方案由给予受试者至少一种免疫抑制剂组成。
免疫抑制剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤、他克莫司、环磷酰胺、环磷酰胺、环孢素A、氯喹、羟氯喹、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)(柳氮磺胺吡啶，sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素、英夫利昔单抗(REMICADE)、依那西普、考帕松(Copaxone)、强的松、甲基泼尼松龙、咪唑硫嘌呤(azathioprene)、环磷酰胺和氟达拉滨、CTLA4-Ig、抗CD40抗体、抗CD40配体抗体、抗B7抗体、抗CD3抗体(例如，抗人CD3抗体OKT3)、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)、达利珠单抗[人源化(IgG1Fc)抗IL2Rα链(CD25)抗体]和结合于毒素(例如，霍乱A链或假单胞菌(Pseudomonas)毒素)的抗T细胞抗体、TNF.α阻断剂、靶向炎性细胞因子的生物剂、以及非类固醇抗炎药物(NSAID)，包括，乙酰水杨酸、胆碱水杨酸镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸盐、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂、曲马多、雷帕霉素(西罗莫司)以及雷帕霉素类似物(如CCI-779、RAD001、AP23573)。可以单独或组合地给予这些药剂。
取决于细胞的类型和待治疗的疾病或病症，以及为了促进胎儿肺细胞的分离群体的植活，上述方法可以进一步有利地包括在给予细胞悬液的分离群体之前在亚致死、致死或超致死条件下调理受试者。
如在本文中使用的，当涉及本发明的受试者的调理时，术语“亚致死”、“致死”和“超致死”是指骨髓毒性(myelotoxic)和/或淋巴细胞毒性治疗，当适用于受试者的代表性群体时，其通常分别是：在无菌的正常条件下，对于群体的基本上所有成员是非致死的；对于群体的一些但不是所有成员是致死的；或对于群体的基本上所有成员是致死。
根据一种实施方式，调理包括全身照射(TBI)、全淋巴照射(TLI，即暴露所有淋巴结、胸腺和脾脏)、身体局部照射(例如，肺、肾、脑等的特定暴露)、清髓性调理、共刺激阻断、化疗剂和/或抗体免疫治疗。
如在接着的实施例部分中所说明的，使用萘来调理受试者会在呼吸性细支气管中和在支气管肺泡结中诱导克拉拉细胞的位点特异性消融，因而促进胎儿肺细胞的分离群体的植活。为了进一步有效地消除固有(residential)肺干细胞(在萘处理以后其可以快速增殖)，在给予胎儿肺细胞的分离群体之前，进一步使受试者经受亚致死TBI(例如6Gy)(参见接着的实施例部分的实施例2)。
因此，根据本发明的一种实施方式，调理方案包括萘处理。
根据一种实施方式，在给予细胞悬液的分离群体之前1-10天(例如3天)，将萘处理给予受试者。
根据一种实施方式，调理包括萘处理和TBI治疗。
根据一种实施方式，TBI包括0.5-1Gy、0.5-1.5Gy、0.5-2.5Gy、0.5-5Gy、0.5-7.5Gy、0.5-10Gy、0.5-15Gy、1-1.5Gy、1-2Gy、1-2.5Gy、1-3Gy、1-3.5Gy、1-4Gy、1-4.5Gy、1-1.5Gy、1-7.5Gy、1-10Gy、2-3Gy、2-4Gy、2-5Gy、2-6Gy、2-7Gy、2-8Gy、2-9Gy、2-10Gy、3-4Gy、3-5Gy、3-6Gy、3-7Gy、3-8Gy、3-9Gy、3-10Gy、4-5Gy、4-6Gy、4-7Gy、4-8Gy、4-9Gy、4-10Gy、5-6Gy、5-7Gy、5-8Gy、5-9Gy、5-10Gy、6-7Gy、6-8Gy、6-9Gy、6-10Gy、7-8Gy、7-9Gy、7-10Gy、8-9Gy、8-10Gy、10-12Gy或10-15Gy的单次或分次照射剂量。
根据一种具体实施方式，TBI包括在1-7.5Gy范围内的单次或分次照射剂量。
根据一种实施方式，在给予细胞悬液的分离群体之前，将TBI治疗给予受试者1-10天(例如1-3天)。
根据一种实施方式，在给予细胞悬液的分离群体之前给予受试者萘处理2-10天(例如3天)以及其后在给予细胞悬液的分离群体之前给予受试者TBI治疗40-48小时(例如1天)。
根据一种实施方式，当使用身体局部照射时，暴露是针对特定的待治疗的器官或组织(例如肺、肾、肝、胰腺、脑等)。在这样的情况下，最好是屏蔽非照射身体器官以避免不需要的器官/组织损伤。
根据一种实施方式，调理包括化疗剂(例如清髓剂)。示例性的化疗剂包括但不限于白消安、马利兰、Busulfex、氟达拉滨、美法仑、二甲基马利兰(Dimethyl mileran)、塞替派和环磷酰胺。在移植之前，可以以单剂量或以若干剂量例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量(例如日剂量)来给予受试者化疗剂。
根据一种实施方式，调理包括抗体免疫治疗。示例性抗体包括但不限于抗CD52抗体(例如，以Campath、MabCampath、Campath-1H和Lemtrada的商标销售的阿仑单抗(Alemtuzumab))和抗胸腺细胞球蛋白(ATG)剂[例如即复宁(兔ATG，rATG，可获自Genzyme)和Atgam(马ATG，eATG，可获自Pfizer)]。根据一种实施方式，在移植之前，以单剂量或以若干剂量例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多(例如日剂量)将抗体给予受试者。
根据一种实施方式，调理包括共刺激阻断。因此，例如，调理可以包括瞬时给予受试者至少一种T细胞共刺激抑制剂和至少一种CD40配体抑制剂，以及更优选地可以进一步包括给予受试者T细胞增殖的抑制剂。
根据一种实施方式，T细胞共刺激抑制剂是CTLA4-Ig，CD40配体抑制剂是抗CD40配体抗体，并且T细胞增殖的抑制剂是雷帕霉素。可替代地，T细胞共刺激抑制剂可以是抗CD40抗体。可替代地，T细胞共刺激抑制剂可以是针对B7-1、B7-2、CD28、抗LFA-1和/或抗LFA3具有特异性的抗体。
在根据本发明的教导将细胞悬液的分离群体移植到受试者以后，最好是，根据标准的医疗实践并根据各种标准技术的任何一种来监测移植细胞的生长功能和免疫相容性。例如，可以在移植以后通过标准肺功能测试来监测再生的肺组织的功能(例如，发育中的植入物的功能特性的分析，如呈现为合成表面活性物质的能力，其可通过染色表面活化蛋白C(sp-C)加以检测，以及转运离子的能力，如由染色CFTR囊性纤维化跨膜调节剂所指示的)。
本文描述的胎儿肺细胞的分离群体可以单独存储或可以包含在库中，每个群体是根据特定参数(例如HLA类型)加以分类。
因此，根据本发明的又一方面，提供了包含分离自哺乳动物胎儿肺组织的多个细胞群体的细胞库，其中胎儿肺组织处于基本上对应于在选自约 20至约22周的妊娠的范围的妊娠阶段的人肺器官/组织的发育阶段的发育阶段，并且其中多个细胞群体已按HLA分型加以归类以形成同种异体细胞库，各自单独地被安置在单独的容器内。
根据一种实施方式，人肺器官/组织处于如上文详细描述的妊娠阶段。
根据一种实施方式，库不包含来自不同于上述的妊娠阶段的细胞。
根据一种实施方式，库不包含来自不同于上述20-22周妊娠的妊娠阶段的细胞。
根据一种实施方式，库不包含来自不同于肺的组织的细胞。
根据一种实施方式，库不包含来自出生后的或成熟组织的细胞。
本发明的此方面的哺乳动物的胎儿肺细胞库源自处于对应于人20-22周的妊娠的孕龄的胎儿的一个或多个哺乳动物胎儿肺细胞群体的物理集合。这样的库优选包含每个胎儿肺细胞群体的一个以上的样品(即，等分部分)。上文描述了收获胎儿肺细胞群体。胎儿肺细胞群体可以源自各种哺乳动物生物体(上文描述的)。
在适当条件下(通常通过冷冻)存储胎儿肺细胞群体以保持细胞(例如祖细胞)存活和发挥机能。根据一种实施方式，胎儿肺细胞群体被存储为冷冻保存群体。其他保存方法描述于美国专利号US 5,656,498、US5,004,681、US 5,192,553、US 5,955,257和US 6,461,645。用于库存干细胞的方法描述于，例如，美国专利申请公开号US 2003/0215942。
根据一种实施方式，存储在库中的胎儿肺细胞群体是根据预定特征表征的，预定特征包括但不限于形态特征、分化曲线、血型、主要组织相容性复合物[人白细胞抗原(HLA)]、供体的疾病状态或与或不与疾病或病症相关的基因型信息。
根据一种实施方式，根据HLA分型来表征存储在库中的胎儿肺细胞群体。
根据一种实施方式，细胞库进一步包含目录，其包含关于胎儿肺细胞群体的预定特征(例如按HLA分型加以归类的细胞)的信息。
登记分类可以构成针对每个细胞群体获得的特性的集中记录，如但不限于聚集的书面记录或计算机数据库，其具有输入其中的信息。胎儿肺细 胞库便于从多个样品选择适用于研究者或临床医师的需要的特定胎儿肺细胞样品。
依据本发明的又一方面，提供了用于分离哺乳动物的胎儿肺祖细胞的方法，该方法包括：(a)获得哺乳动物胎儿肺组织，其中胎儿肺组织处于基本上对应于在选自约20至约22周的妊娠的范围的妊娠阶段的人肺器官/组织的发育阶段的发育阶段；(b)在胎儿肺组织细胞上检测标志物表达，其中标志物选自由CK5、CK14、CD271、CD34、c-Kit、CD326、CD31和CD45、以及它们的组合组成的组；以及(c)分离显示标志物表达的细胞，从而分离哺乳动物的胎儿肺祖细胞。
根据一种实施方式，与获自约15或17周妊娠的肺组织或器官相比，细胞的分离群体包含至少2倍以上的CK5+细胞。
根据一种实施方式，细胞的分离群体获得在受试者的肺的小细支气管中新形成的上皮细胞。
根据一种实施方式，细胞的分离群体获得肺细胞1型细胞和/或肺细胞2型细胞在受试者的肺的肺泡中的表达。
根据一种实施方式，细胞的分离群体获得CD31⁺细胞在受试者的肺的血管中的表达。
根据一种实施方式，与获自约18周妊娠的肺组织或器官相比，细胞的分离群体获得更宽的肺泡管。
根据一种实施方式，与获自约18周妊娠的肺组织或器官相比，细胞的分离群体获得更薄的肺泡壁。
根据一种实施方式，与获自约18周妊娠的肺组织或器官相比，细胞的分离群体获得更多的支气管和细支气管结构。
根据一种实施方式，与获自约15或24周妊娠的肺组织或器官相比，细胞的分离群体并不导致包囊的形成。
根据一种实施方式，与获自约15或24周妊娠的肺组织或器官相比，细胞的分离群体获得表面活化蛋白C(sp-C)和/或CFTR的阳性表达。
如在本文中使用的，术语“约”是指±10％。
术语"包含"、"含有"、"包括"、"具有"和它们的变化形式是指"包括但不限于"。
术语“由…组成”是指“包括并限于”。
术语"基本上由…组成"是指，组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但上述另外的成分、步骤和/或部分并不重大改变所要求的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。
如在本文中使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式"一"、"一种"和"该"包括复数指称。例如，术语"一种化合物"或"至少一种化合物"可以包括多种化合物，包括它们的混合物。
在整个本申请中，可以以范围格式来呈现本发明的各种实施方式。应当理解的是，以范围格式进行的描述仅是为了方便和简洁而不应该被视为是对本发明的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被视为已具体公开了所有可能的子范围以及范围内的个别数值。例如，范围如1至6的描述应被视为已具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4。2至6、3至6等，以及在范围内的个别数值，例如，1、2、3、4、5和6、这是适用的，而不管范围的宽度。
每当在本文中指出数值范围时，它意指包括在指定范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字之间的一个或多个范围和“由第一指示数字“至”第二指示数字的一个或多个范围”在本文中可互换使用并且旨在包括第一和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。
如在本文中使用的，术语"方法"是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的那些方式、手段、技术和程序，或容易由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者自已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
可以理解的是，为清楚起见描述在分开的实施方式中的本发明的某些特点也可以在单个实施方式中以组合方式来提供。相反地，为简便起见描述在单个实施方式中的本发明的各种特点也可以分开地或以任何适宜的亚组合或当合适时以本发明的任何其他描述的实施方式来提供。在各种实 施方式中描述的某些特点不应被认为是这些实施方式的基本特点，除非在没有那些要素的情况下实施方式是不起作用的。
如上文描述的和如在以下权利要求部分中要求的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中发现实验支持。
实施例
现参照以下实施例，其连同以上描述一起，以非限制性的方式来说明本发明。
通常，本文中使用的术语和在本发明中采用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在文献中充分解释了这样的技术。参见，例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；中的方法，如阐述于美国专利号US 4,666,828；US 4,683,202；US 4,801,531；US 5,192,659和US5,272,057；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可用的免疫测定广泛描述于专利和科技文献，参见，例如，美国专利号US 3,791,932；US 3,839,153；US 3,850,752；US 3,850,578；US 3,853,987；US 3,867,517；US 3,879,262；US 3,901,654；US 3,935,074；US 3,984,533；US 3,996,345；US 4,034,074；US 4,098,876；US 4,879,219；US 5,011,771和US 5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR  Protocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；它们均以引用方式结合于本文。在本文件中提供了其他一般参考文献。其中的程序被认为是在本领域中众所周知的并为方便读者加以提供。其中包含的所有信息以引用方式结合于本文。
一般材料和实验程序
胎儿肺异种移植
动物
在Weizmann Institute，在由机构动物护理和使用委员会批准条件下维持动物。使用的小鼠品系包括：NOD-SCID、RAG-/-、Balb-Nude、C57BL/6J(CD45.2)和C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J。所有小鼠均为6–10周龄。它们被保持在小笼中(在每个笼子中最多达5只动物)并饲喂无菌食品和酸性水。
动物程序
移植程序
在全身麻醉下(2.5％的2,2,2-三溴乙醇，97％，在PBS中，10ml/kg腹腔内给予)进行胚胎前体组织的移植，如先前描述的[Katchman H.et al.,Stem Cells.(2008)26(5):1347-55]。
在肾囊下植入
通过左侧切口来暴露宿主肾。在肾囊的尾端制作1.5-mm切口，然后在肾囊下以直径为1–2mm的碎片移植供体前体组织。
15至24周妊娠的人胎肺组织获自合法堕胎，其中根据由赫尔辛基伦理委员会批准的方案获得使用肺组织的书面知情同意书。胎龄是基于临床信息加以确定并通过胎儿足长测量值证实的。为了确保移植组织源自胎儿肺，仅将整个肺叶用于制备异种移植组织。在无菌条件下将新鲜下气道切割成1-3mm³片。对麻醉的免疫缺陷小鼠进行外科手术，然后将人胎肺组织放置在每只小鼠的肾小囊下(一片)。在移植以后，在不同时间点收获异种移植物。
为了在C57BL小鼠的肾囊下同源移植小鼠胚肺，收获来自不同孕龄胚胎(14-17天妊娠)的肺并以直径为1–2mm的碎片在肾囊下移植。为了确保移植组织源自胎儿肺，仅将整个肺叶用于制备移植组织。
在移植以后第2–20周，处死接受植入物的动物。然后除去带有移植的移植物的肾并固定在4％多聚甲醛中或冷冻保存。
通过苏木精和伊红(H&E)常规染色组织切片。通过组织化学和免疫组化标记来评价移植物分化和功能。
形态测定分析
在最佳切割温度化合物(OCT)中冷冻不同孕龄的人胚肺并以冷冻切割(cryocut)加以切割。用兔抗人CK5一抗(Abcam)和驴抗兔Day Light 594二抗来染色连续的12ìm切片。使用Image Pro程序(Media Cybernetics,Crofton,MD)来量化感兴趣的面积(area)。分析了相同孕龄的肺的至少3-4个不同的样品。
萘肺损伤
对于肺损伤研究，给予小鼠腹腔内注射萘[(纯度大于99％，Sigma-Aldrich)，溶解于玉米油中，200mg/kg体重，在移植以前40-48小时]。
对于“双肺”损伤，进一步照射萘处理的动物(在萘给予以后40-48小时)：用6Gy TBI照射C57BL小鼠；用3-4Gy TBI照射NOD-SCID小鼠。
肺单细胞悬液和移植
细胞制备和注射
细胞悬液获自酶消化的15-24周肺。简单地说，在37℃下，在0.1％胶原酶、2.4U/ml分散酶(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)和2.5mMCaCl₂的存在下，通过有刀片精细切碎组织来进行肺消化1小时。用通过70-和40-μm过滤器的连续过滤来除去非特异性碎片。
在用萘(NA)、TBI或两者进行调理以后，用1x10⁶个GFP阳性胚胎肺细胞移植每只动物，在照射以后4-8小时，注入尾静脉。
流式细胞计量术
通过多色流式细胞计量术来分析人(15-24周)和小鼠(14-17周)胚肺源性单细胞悬液，以及成人小鼠和成人单细胞悬液。根据制造商的说明，用结合的抗体或匹配的同种型对照来染色所有样品。抗体来自Bioscience、BD和Biolegend。在本研究中使用的抗体的完整清单总结于以下表2。用LSRII(BD Biosciences)流式细胞仪来获得数据，并用Flow Jo软件(版本7.6.5)分析。
免疫组织化学
在移植后不同时间点处死动物；用4％PFA溶液充满肺并保持24小时，然后冷冻保存在30％蔗糖中并快速冷冻在通过液态空气预先冷却的异戊烷中，或加以处理用于石蜡包埋。将石蜡块切割成4μm切片，并二甲苯去石蜡化和再水合以后加以染色，如先前描述的[Hecht G et al.,Proc Nat Acad of Sci.(2009)106(21):8659]。在本研究中使用的抗体的汇总描述于以下表2。所有二抗均来自Jackson Immunoresearch Laboratories。
通过Olympus数码相机(DP70)来获得图像，并有时通过Adobe photoshop 7.0加以处理。对于所有免疫组化染色，使用相同的技术运行阴性对照，但当添加标记的二抗时省略一抗。
表2：在本研究中使用的抗体的清单


(注意，所有二抗均购买自Jackson ImmunoResearch或Abcam)
双光子显微术
在成像以前，小鼠被安乐死，或I.V.注射血示踪物量子点655纳米颗粒，用于血管标记(Invitrogen-Molecular Probes)，然后安乐死。切除肺并放置在玻璃覆盖的成像室下。
使用了结合有脉冲Mai Tai^TMTi-蓝宝石激光器(Newport Corp.,CA)的Ultima^TM多光子显微镜(Prairie Technologies Middleton,WI)。将激光器调谐至850nm以同时激发EGFP和血示踪物。使用了水浸渍的20X(NA 0.95)或40X物镜(NA 0.8)或10X空气物镜(NA 0.3)(来自Olympus)。
为了产生典型的Z堆叠，在大约30-150μm的深度用3μm Z步骤，扫描包含GFP细胞的肺切片。使用软件(Perkin-Elmer,Coventry,UK)来分析数据。
显微CT成像
在全身麻醉下(2.5％的2,2,2-三溴乙醇，97％，在PBS中，10ml/kg腹腔内给予)进行显微CT成像。
用配备有双源检测器系统的30S Duo扫描仪(CT Imaging，德国)进行体内显微CT实验。两个管的工作电压均是40kV。第一和第二方案的积分时间是90ms(360旋转)和5分钟(3600旋转)并以80μm的各向同性分辨率获得轴向图像。使用ImageJ软件分析CT数据的处理。
统计分析
通过学生t检验评价了组之间的差异。根据指示，数据表示为平均值±SD或平均值±SEM，并且当p值≤0.05时，被认为是统计上显著的。
实施例1
用于收获人胚肺前体组织的最佳‘窗口’
在不同妊娠时间点收获的人胚肺组织的生长潜力
为了评估胚胎阶段对生长和分化潜能的影响，在NOD-SCID小鼠的肾小囊下首先移植源自15至24周人胎儿的肺胚胎祖细胞组织。总的来说，根据移植后8周的检查，超过98％的来自所有年龄的供体组织的移植物会存活并且所有回收的移植物表明增大的尺寸，而在任何回收的移植物中没有瘤形成的证据。然而，当使用更早或更晚妊娠肺作为供体组织来尝试类似的移植时，结果是明显不同的。
如在图1A中可以看出，与在15-19或23-24周妊娠收获的组织(分别为61.6+/-3.5mm和10.6+/-2.0mm)相比，在20-22周收获的组织(n＝25，尺寸为1-3mm)在移植以后的8周时呈现增强的生长(达到300.7+/-15.2mm的尺寸)。
为了获得不断增长的肺植入物(宏观上示于图1B)的不同的结构特性的定量评价，采用了形态测定分析。
如图1C-图1F中所示，在生长自20-22周组织的植入物中检测了呼吸树(它们的外观类似于成人肺组织)的所有要素。因此，不断增长的植入物均展示具有肺泡的肺泡管(图1C-图1F)、覆盖有纤毛上皮的气管(图 1E)、肌层和软骨(图1E)、以及肺泡上皮单层(图1F)的形成。同样，清楚地表达了参数，其定义了正发育植入物的功能特性，如由合成表面活性物质的能力所指示的，其可以通过使表面活化蛋白C(sp-C)染色(图1G-H)加以检测，以及转运离子的能力，如由染色CFTR囊性纤维化跨膜调节剂(图1I)所指示的。通常，在成熟过程中相对较晚出现的这些功能标志物与更加分化的表达细胞角蛋白18(CK 18)的要素一致，并且在移植之前它们并不在20w组织中表达(数据未示出)。
令人惊讶地，与上述结果相反，源自在15周(图1J-L)或24周(图1M-O)收获的组织的植入物发展包囊并且对于sp-C和CFTR染色是阴性的(数据未示出)，而源自18周组织的植入物，虽然显示分化和成熟的所有模式，包括染色sp-C和CFTR(数据未示出)，但仍然有缺陷，这是因为形成的肺泡管是较窄的，以及肺泡壁是较厚的(图1P-R)。总而言之，这些结果表明，用于收获用于移植的人胚肺组织的最佳‘窗口’是在妊娠的20-22周之间。
在不同妊娠时间点时，在人胚肺组织中识别干细胞祖细胞和它们的巢
在识别用于移植的最佳‘窗口’人胚肺组织以后，与在较早或较晚的妊娠时间点收获的组织相比，评价了在此‘窗口’组织中假定的干细胞的存在。
如图2A-图2D中所示，H&E染色表面与在较早的时间点收获的组织相比，在20-22周收获的组织中发现更多的支气管和细支气管结构。为了解释在这些组织中在祖细胞水平上的潜在差异，检查了基底上皮肺细胞的假定的祖细胞亚群(其先前显示表达细胞角蛋白5(CK5)和14(CK14))的存在。在分化以后，这些不同的标志物被下调，平行于更加成熟的CK8/CK18阳性表型的表达。
如在图2E中可以看出，在较大气道中发现CK5阳性细胞的明显的频率以及CK14的表达(图2F)，而在发育中的肺泡中则发现稍低的丰度。此外，此免疫组化染色揭示了CK5+细胞被巢蛋白⁺细胞所包围(图2G)，并且它们中的一些表现出由降钙素基因相关蛋白(CGRP)标记的神经上皮体的性能性质。如在图2H中可以看出，通过染色神经细丝(NF)，进一步揭示了这种神经分布，这提示干细胞巢的结构，其类似于先前针对在骨髓和在成人小鼠气道中的造血干细胞所定义的那些结构。此外，根据关于BM巢的最近的报告，上皮CK5⁺巢还包含α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞(图2I和图5A-D)和波形蛋白⁺间充质细胞(图2J)。
重要的是，形态测定分析表明在妊娠20-22周的‘窗口’组织中CK5⁺祖细胞的相对丰富，提示最佳窗口可能与这些祖细胞的较高数目相关。因此，在妊娠20-22周收获的组织中，与分别在15w和17w组织中的5.26％±1.06(P＝0.0006)或6.05％±0.18(P＝0.002)(图2K-O)相比，发现CK5+分布面积平均是总肺组织的14.1％±5.6。
总而言之，可以部分地通过CK5阳性上皮祖细胞的频率和它们的各自巢来解释用于收获胚肺作为用于移植的来源的这种“机会窗口”。为了进一步研究在不同胚胎组织中的其他假定的祖细胞，FACS分析用来确定最近归因于多能人肺干细胞的若干表型的存在。尤其是，注意力集中于两种表型。第一种表型，稀少的亚群，对于c-kit(CD117)是染色阳性的而对于许多分化标志物(包括CD34)是染色阴性的，最近由Kajstura等加以描述，其主要在成人肺组织中，但也在胚胎组织中，作者认为，这些细胞是多能肺干细胞，具有自我更新能力[Kajstura J.et al.,N Engl J Med.(2011)364(19):1795-806；Anversa P.et al.,Nat Med.(2011)17(9):1038-9]并具有用于所有肺谱系的再生潜能。然而，Suzuki等坚持认为，在胚肺中，C-Kit⁺细胞还表达CD34并且可能是内皮祖细胞[Moodley Y.et al.,N Engl J Med.(2011)365(5):464-6；Suzuki T.et al.,American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine(2010)181(1Meeting Abstracts):A4898]，因此，还评价了C-Kit⁺CD34⁺细胞的存在(图2P-Z)。
为此，对于获自在16、18和20周妊娠时收获的酶处理的人胚肺组织的单细胞悬液，分析了若干分化标志物的表达，包括CD34(对造血和内皮祖细胞特异)、CD45(造血细胞)、CD31(用于内皮细胞的标志物)、CD117(c-KIT，用来识别早期祖细胞)、CD271(NGFR，间充质干细胞标志物)和CD326(EPCAM，上皮分化标志物)。
引人注目的是，发现非造血的、CD45阴性群体包含三种不同的C-Kit⁺祖细胞群体，包括CD34^高、CD34^中等和CD34^阴性细胞(图2P-T)。虽然后者群体与早期多能成人肺干细胞相容，但其他CD34⁺细胞可以被更强烈分化为还表达高水平的CD31的内皮细胞世系(图5A-I)。
有趣的是，与较早孕龄(小于0.15％)或与用作对照的成人肺组织(小于0.45％，图6A-图6L)相比，在20周收获的组织中C-Kit⁺CD34^阴性亚群是明显更丰富的(约最高达2-3％的CD34^阴性群体)。这些独特的C-Kit⁺CD45^-CD34^-CD271^-细胞，其相对于CD31和CD326也是阴性的(图 7A-图7I)，根据Kajstura等，也可以通过免疫组织学加以确定。因此，如图3A-图3C中所示，这些假定的祖细胞以低水平存在于紧密靠近较大气道，主要在血管周边间隙中。
重要的是，当通过对CD117和CD34的免疫组化染色来分析肺组织时，发现若干不同的细胞亚群体类似于通过FACS分析发现的那些细胞亚群体。20周人肺的分析示于图4A-图4K；大多数的CD117⁺细胞共表达CD34并存在于血管中(图4A-图4C)，其围绕发育中的肺泡(图4D-图4G)，同时发现较小的CD117⁺单阳性细胞亚群体紧密靠近较大血管和较大气道(图4H-图4K)。在较早孕龄肺组织中发现CD117+细胞分布的类似模式(图8A-图8D)，虽然在20w组织中如通过FACS揭示的总百分比显著较高(图2A-图2Z)。此外，如图9A-图9D中所示，20周胚胎组织还显示早期和晚期内皮祖细胞(EPC)，其在肺微血管修复中可以具有独特作用。因此，还发现此组织呈现两种不同的CD34+CD31+亚群的存在。通过对CD14和CD45的阳性染色确定了第一亚群，而根据先前的研究，第二亚群是CD45^-CD105+，这提示在人外周血中在在这些两种主要类型的EPC[Yoder MC et al.,Blood.(2007)109(5):1801-9]。称作‘早期EPC’的前者的特征在于体外早期生长、CD34/CD31/CD14阳性、在基底膜管形成测定中不能形成管、以及高水平的细胞因子分泌。其他类型的EPC，称作‘后期衍生(outgrowth)的EPC’、衍生的内皮细胞(OECs)’或‘内皮细胞集落形成细胞(ECFC)’的特点在于CD31和CD105阳性、缺乏CD45和CD14、以及当以凝胶形式植入免疫缺陷小鼠时自发形成人血管(与体循环的小鼠血管整合)的独特的能力。
实施例2
在用于‘窗口’胚肺移植物的再生潜能的小鼠模型中的概念验证
用于收获用于移植的小鼠胚肺前体组织的最佳‘窗口’
为了评价在适当的小鼠模型中胚肺源性组织的治愈潜力，起初限定用于收获用于移植的小鼠胚肺的最佳“窗口”，如针对它的人对应物。因此，在不同的妊娠时间点(E14-E17)收获小鼠肺胚胎组织，植入在同源小鼠的肾囊下，并在移植以后的8周，评估植入物的肺实质、支气管和肺泡结构的存在，以及纤维化和包囊的不需要的存在。
如在图10A-图10E中可以看出，在囊下肾移植以后12周，E14和E17肺组织导致囊性和纤维变性组织的形成(图10A-图10B)，而E15-E16小鼠胚肺则呈现进一步分化和达到肺泡期的显著的潜力(图10C-图10E)。因此，与人肺组织类似，肺发育的小管阶段提供了用于收获用于移植的组织的最佳窗口(图10F)。此外，与人‘窗口’组织类似，E16肺组织并没有呈现肺泡(图11A)；在较大气道中CK-5阳性细胞是丰富的，并且在整个样品内发现许多神经上皮体，其对CGRP是染色阳性的并定位于巢中(图11B)，这类似于骨髓和成年小鼠肺(图12A-图12F)。同样地，在较大气道的区域中发现CCSP阳性细胞，其富含在巢蛋白-阳性细胞中(图11C)，这提示干细胞巢，以及被α-SMA阳性细胞所包围(图11D)。
另外，与它们的人对应物类似，与早期或后期妊娠组织相比，E15-E16组织富含有假定的祖细胞，如CD45^-CD31^-EpCAM⁺CD24⁺CD49f⁺CD104⁺细胞的FACS分析所示，上述细胞最近被建立为在成年小鼠肺中的假定的肺祖细胞[McQualter JL et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences.(2010)107(4):1414]。因此，如在图3E-图3Y(其示出E13、E14、E15和E16单细胞悬液的代表性FACS分析)中可以看出，与在E13和E14组织中的水平(分别为0.002±0.00057％和0.012±0.0057％)相比，在E15和E16肺组织中发现显著更高水平的CD45^-CD31^-EpCAM⁺CD24⁺CD49f⁺CD104⁺细胞(分别为0.062％±0.007和0.073％±0.005)。
移植用于治疗肺损伤的E16小鼠胚胎肺细胞
考虑到在移植以后E15-16组织呈现明显的生长和分化潜力，在用于肺损伤的小鼠模型中进一步评价了这种‘窗口’组织。
为此，在基于用萘进行的损伤诱导的模型中，起初评价了这些细胞，如先前描述的[Stripp B et al,American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology.(1995)269(6):791]。这种肺损伤模型模拟由轻度上皮损伤引起的肺病，其可以通过肺克拉拉细胞的表达的变化加以检测。
克拉拉细胞在呼吸性细支气管中和在支气管-肺泡结中的特定解剖位置使得能够准确定位在萘暴露以后损伤的部位，以及在同源受体中测试胚细胞“窗口”细胞的单细胞悬液定居(colonize)和恢复受伤的上皮层的能力。
在萘给予以后两天，用源自GFP阳性妊娠小鼠的1x10⁶E16肺细胞输注受体C57BL小鼠。随后，在不同时间点，组织学评价经治疗的动物的 肺的GFP阳性细胞的存在。这些初步实验(未示出)揭示了，通过萘的克拉拉细胞的消融是短暂的并且不能使供体源性克拉拉细胞能够明显植活并发育。因此，本发明的发明人假设更具侵略性(aggressive)的调理方案、更有效地消融固有干细胞增殖，可能是评估供体细胞的再生能力所需要的，如通常在研究中发现的，上述研究测量在骨髓移植以后的嵌合现象(chimerism)诱导。
为了检验此假设，在萘损伤以后40小时，用亚致死TBI(6Gy)另外地治疗动物以消除固有肺干细胞，通过先前的萘处理，其被潜在地诱导增殖。
在1天以后，小鼠接受E16肺细胞，然后接着通过与形态测定分析结合的免疫组化染色，以及通过2光子显微图的在它们的肺中供体源性细胞的植活和发育。
如图13A-图13C中所示，与单独TBI(图13A)或单独萘(图13B)调理的小鼠相比，在移植后30天时，在用萘和6Gy TBI调理的小鼠中，GFP阳性‘斑块(patch)’(其指示供体源性细胞在受体肺中的植活)显著增加(图13C)。调理对肺嵌合现象水平的这种显著影响定量地示于图13D，其示出在三个独立实验(在每组中，包括总共9只小鼠)中发现的GFP斑块的形态测定分析。因此，虽然在用萘和6Gy TBY调理的小鼠中发现55个病灶/mm³(foci/mm³)供体源性病灶，但在分别仅用萘或TBI调理的小鼠中，发现仅10-12个病灶/mm³和2-3个病灶/mm³。
显示嵌合肺的小鼠的免疫组化检查进一步揭示了在受体肺中整合到功能元件的水平。如图14A中所示，未经治疗的对照小鼠的较大气道的腔清楚展示CCSP⁺克拉拉细胞的存在，而在调理之后这些细胞立即经历消融和剥落(图14B)。然而，在所选择的调理以后移植的小鼠在移植后和第30天呈现新上皮层的形成，并且在支气管腔中发现植活的GFP⁺细胞。这些供体源性GFP+细胞加入宿主支气管和肺泡气道，并被血管化，如通过V-钙粘蛋白的染色所示(图14C)。它们还表达CCSP(图14D-图14F)，并且对于Sp-c(图14G-图14I)和CFTR表达(图14J-图14L)是阳性的，这提示它们产生表面活性物质和参与离子转运的能力。如预料的，根据它们的位置，植活的GFP⁺细胞差异地显示这些特定的功能标志物。因此，在较大气道中，细胞对于CCSP是阳性的，并且在肺泡中，植活细胞对于sp-C是阳 性的，但发现所有细胞表达CFTR，其对于囊性纤维化(CF)的潜在矫正具有特别重要的意义。
有趣的是，当在移植后的稍后的时间点测试时，初始病灶清楚地具有不断增长的尺寸，从而占据更大比例的植活肺。这进一步说明于2光子显微图，其使得能够在处死之后立即直接查看肺，其中有或没有用用于荧光血管标记的红色量子点来活体内(intravital)共染色血管(数据未示出)。如在图15A-图15C中可以看出，虽然在移植后6周时发现供体类型细胞对肺的中等植活，但用移植GFP⁺细胞在支气管肺泡和血管结构中的优势整合(图15A-图15B)，在移植后4个月时发现占据肺组织的几乎三分之一的供体类型细胞的进一步进展(图15C)。
此外，在移植以后16周时这些嵌合肺的免疫组织学评价揭示了在血管界面处的气体交换表面上以及在肺泡上皮结构中供体源性细胞的完全整合(图16A-图16L)。因此，通过用CD31和抗泛细胞角蛋白抗体的三重染色发现GFP⁺细胞被并入移植肺的血管和上皮区室，而没有疤痕或纤维化的体征(图16A-图16D和图17A-图17E)。同样地，AQP(图16E-图17H)和SP-C(图16I-图17L)染色揭示了分别在I型和II型肺泡细胞的气体交换表面上供体源性细胞的并入。
共同地，这些结果强烈表明收获自‘窗口’组织的胚肺细胞可以提供用于肺组织修复的新细胞来源。此外，可以预料，如果与亚致死调理结合，用这样的细胞进行的治疗可以是更加有效的，虽然在通过正在进行的损伤显著消融宿主肺祖细胞的临床情况下这可能是不太重要的。
在用萘和TBI进行的肺损伤诱导以后，将源自20-22w人胚肺的单细胞悬液移植到NOD-SCID小鼠
为了研究‘窗口’人胚肺细胞整合到损伤肺的能力，建立了免疫缺陷SCID小鼠的肺损伤模型。考虑到NOD-SCID小鼠对TBI是更加敏感的，使用3.0GY TBI来代替在用小鼠供体组织进行的研究中使用的6.0GyTBI*(上文描述的)。此外，作为GFP基因标记的替代，用小鼠和人特异性抗体的免疫组织学用来区分宿主和供体上皮细胞、内皮细胞和间充质细胞。
因此，当将在20w人胚肺细胞的酶消化以后收获的1x10⁶个细胞注入NOD-SCID小鼠时，单独用NA进行的调理并不导致任何明显水平的植 活(数据未示出)，在将相同数目的细胞注入用萘以及随后用3.0Gy TBI进行治疗而加以调理的NOD-SCID小鼠以后则获得明显的嵌合现象(图18A-图18I和图19A-图19F)。
在最初的短期实验中，用跟踪荧光染料，5-(和-6)(((4-氯甲基)苯甲酰基)氨基)四甲基罗丹明)(CMTMR)来染色人类胚胎(20w)肺源性单细胞悬液，然后将细胞输注进入经调理的NOD-SCID小鼠。当2周以后检查时，可以在受体小鼠的肺中的明显的斑块内可视化植活的人类细胞(图24A)，其类似于在同源移植模型中发现的GFP⁺斑块(图24B)。因为CMTMR染色是短暂的，所以进行第二组实验以在移植以后的稍后的时间点来区分人和小鼠细胞，其中通过免疫组化染色并使用抗小鼠MHC抗体，其并不与对照人类组织交叉反应(图24C-图24E)，以及抗人类细胞角蛋白MNF 116抗体(染色人上皮细胞)，其并不与对照小鼠组织交叉反应，如通过在图24F-图24H中的双重着色所证实的。
重要的是，在移植后的6周时，用这些抗体进行的双重着色清楚地揭示了显著水平的嵌合现象。如在图18A-图18C(其示出低放大倍率的小鼠支气管)中可以看出，用小鼠和人标志物的双重着色清楚地显示人源性细胞并入肺结构，并且这可以在高放大倍率的两个不同的场下进一步得到理解(分别为图18D-图18F和图18G-图18I)。
在第三组实验中，将在20w时收获的人胚肺细胞移植到经NA和稍高TBI(4Gy)处理的NOD-SCID。
在移植以后7周，用另外的显著的抗小鼠和抗人标志物来染色小鼠肺。因此，将小鼠抗人类细胞角蛋白MNF 116抗体(染色人上皮细胞)、小鼠抗人V9(染色波形蛋白9，基质细胞特有的)和小鼠抗人CD31(染色内皮细胞)混合在一起并放置在组织切片上；然后用标记有Daylight 488(绿色)的第二抗小鼠IgG抗体来孵育切片。图19A和图19D示出在小鼠肺的支气管结构中人类组织的这种抗体混合物的选择性染色。用Banderia凝集素来染色在小鼠肺中的小鼠来源的细胞。已知后者结合于表达在小鼠上皮和内皮细胞上的α-Gal部分，并且如可以看出的，当单独(图19B和图19E)或连同MNF染色一起(图19C和图19F)监测时，它并不与人类组织交叉反应。此外，使用类似的标志物，在移植小鼠的肺泡中也可以检测到明显 的嵌合现象(图20A-图20F)。重要的是，还发现，源自人类胚胎细胞的移植的人肺细胞呈现若干重要的功能标志物。
如在图21A-图21C中可以看出，通过上述混合物(图21A)连同细胞角蛋白的一般标志物一起，标记为绿色的人类细胞和双重着色导致小鼠和人来源(图21B)的所有上皮细胞的染色，其示出在植活的肺的人类细胞群体内的不同的上皮细胞(图21C)。同样地，在移植以后7周时，在移植动物的嵌合肺内，可以清晰区分对于I型肺泡细胞特有的水通道蛋白-5(AQP-5)是阳性的人类细胞(图22A-图22C)和对于II型肺泡细胞特有的表面活化蛋白C(SP-C)是阳性的人类细胞(图23A-F)。
因此，人源性肺细胞不仅并入损伤的小鼠肺而且表达AQP-5(其是进行气体交换所需要的)或SP-C，这表明肺泡产生了表面活性物质。
用胚肺源性干细胞进行的治疗并不伴随畸胎瘤发展
在胚胎干细胞移植中最有争议的问题的一种(其限制它们的临床应用)是移植组织的潜在的致肿瘤性。在先前的研究中，其中本发明的发明人试图解释用于不同猪胚胎前体组织的最佳‘窗口’，结果表明，在E28以后(beyond E28)，测试的组织均不呈现畸胎瘤形成的任何风险[Eventov-Friedman S et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences.(2005)102(8):2928]。因此，考虑到，胚肺在胚胎发生的后期发育，以及考虑到，因此，针对小鼠、猪或人胚肺组织选择的‘窗口’是妊娠的相对较晚的阶段，与上述前体组织相关的畸胎瘤诱导的风险可能是非常低的。然而，为了进一步证实此重要问题，对移植小鼠(n＝30)进行了详细的组织学分析，最长达移植以后的12个月；在移植肺组织中没有发现任何肿瘤的证据。此外，通过肺显微CT(分辨率为80μm)的移植小鼠的长期随访并没有在这些小鼠中揭示任何疑似空间占据性病变。用代表性图像的这些结果的总结示于图25A-图25D。
讨论
目前的结果表明，在小管阶段获得的小鼠或人肺胚胎组织可以提供用于通过移植的组织替换的最佳来源。此外，有人提议，富含早期祖细胞的人胚肺的特性类似于骨髓和脐带血的组织，在过去十年中，其用于在造血病中的移植已显著增加。与来自较早或较晚妊娠时间点的组织相比，‘窗口’胚胎组织，其在植入同源或SCID小鼠以后呈现最佳生长和分化，显著 富含各种上皮、间充质和内皮祖细胞。此外，在它们的相应的胚胎组织中这些早期祖细胞的详细分析揭示了上皮祖细胞存在于特定的巢中，类似于针对在骨髓中的造血干细胞巢所广泛描述的那些。因此，目前的结果文献说明了，在假定的肺祖细胞的邻近，内皮细胞、巢蛋白阳性细胞和间充质细胞的集结，其通常也是神经支配的，如通过针对CGRP和神经细丝的阳性染色所发现的。这些结果与表明干细胞巢在成人小鼠肺中的潜在存在的研究相符[Engelhardt JF.American journal of respiratory cell and molecular biology.(2001)24(6):649-52]。
除限定胎儿组织用于移植的最佳窗口(其与人胚肺祖细胞巢的出现相关)之外，本研究还阐明了关于人肺祖细胞的表型的正在进行的争论。因此，虽然Kajstura等[Kajstura et al.2011，见上文]描述了对于其他标志物是阴性的并存在于靠近较大气道结构的离散的血管周围区域中的c-kit⁺细胞的小群体，但本发明的发明人在发育中的肺泡中发现了另一个c-kit⁺细胞群体，其存在于血管中，并紧密靠近CK5⁺祖细胞，其表达CD34和CD31抗原，如由Suzuki等所提议的(Suzuki et al 2010，见上文)。因此，这里表征的‘窗口’肺胚胎组织包含两个假定的c-kit阳性祖细胞群体。c-kit阳性细胞与CK5⁺上皮祖细胞的靠得很近和潜在相互作用与最近的建议相符：c-kit引发对于肺泡结构的正常发育和维持是关键的[Lindsey JY et al.,American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine.(2011)183(1MeetingAbstracts):A2445]。
重要的是，相对于来自早期发育阶段的肺组织，“最佳小管窗口”组织呈现最高水平的所有类型的祖细胞；因此，本发明的发明人假设，静脉内移植未分离细胞混合物(类似于在骨髓移植中使用的方法)可能是优选的方法。确实，E15-E16小鼠肺或20-22w人肺组织的单细胞悬液的移植表明，在通过使萘和6.0Gy亚致死TBI结合所诱导的肺损伤以后这些细胞的显著的再生能力。苛刻地，当宿主肺祖细胞以显著水平存在时，为了建立嵌合现象，在移植之前，此水平的调理是必要的，如在用萘进行的损伤诱导以后所发现的。最近由Duchesneau等进行了类似的观测[Duchesneau P et al.,Molecular Therapy.(2010)18(10):1830-6]，其表明通过使用除萘之外的清髓剂白消安的增强调理可以显著增强骨髓源性细胞在肺结构中的植活。显然，对于调理的这种要求在不同的临床情况下可以具有不同的强度，其取决于受到病理过程影响的肺损伤与宿主祖细胞的水平。
总而言之，目前的结果揭示了在宿主肺的不同区室中强大的植活并且整个呼吸单元的形成包括以下要素：a)在小细支气管中新形成的上皮细胞，如由GFP⁺CCSP⁺细胞所显示的。b)肺细胞1型细胞(GFP⁺AQP-5⁺)，对于在肺泡内的气体交换表面来说是重要的。c)肺细胞2型细胞(GFP⁺Sp-C⁺)，对于在肺泡中产生表面活性物质来说是重要的。d)在脉管系统中GFP⁺CD31⁺细胞的强有力的存在。另外，植活的组织连同呼吸元件一起，呈现CFTR的表达，其是离子转运所需要的，对于CF患者尤其是关键的。
与单独用每种制剂进行的调理相反，在“双重损伤”以后这种相当引人注目的植活可以通过在宿主和供体祖细胞之间对于它们的各自巢的竞争来解释。Reynolds等[Reynolds SD et al.,American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology.(2004)287(6):L1256-65]表明，通过萘消除表达CCSP的细胞群体会导致继发性肺泡炎症、水肿和肺泡Ⅱ型细胞群体的耗尽。因此，在特点在于严重受损肺泡功能的疾病中选择性气道损伤可以作为刺激性(inciting)损伤。此外，Volscaert等[Volckaert T et al.,J Clin Invest.(2011)121(11):4409]表明，以激活Notch信号和随后上皮到间充质过渡的方式，在萘诱导的损伤以后，在成熟的旁支气管(parabronchial)平滑肌细胞(PSMC)中重新激活Wnt/Fgf10胚胎信号级联；此发现表明，这种胚胎途径的激活很可能用来引发在不同的肺室中有效并入胚肺源性组织。同样地，辐射诱导的肺损伤表明会诱导血液-肺泡屏障的击穿和微循环功能障碍，并从而可以使得能够实现供体源性内皮细胞的显性(45-47)。
不论所涉及的机制，在细支气管和肺泡结构中获得的供体源性细胞的小鼠模型中明显的植活是惊人的。这种嵌合现象，其随时间而增加，可能归因于在植入胚胎肺组织中的多种供体祖细胞，其使得早期自我更新多能干细胞的后代能够逐渐取代宿主或供体细胞(源自后者前体)。
当在NOD-SCID小鼠中测试人肺祖细胞时，也观测到类似的肺整合和发育，虽然在此系统中，与小鼠细胞因子的通讯的潜在损失可能会减少植活。因此，在三组实验中，目前的结果说明，供体源性人类细胞并入细支气管和肺泡结构，显示出和上文针对同源胚胎小鼠肺细胞所描述的那些特点类似的特点。
需要进一步的研究以限定最佳免疫抑制方案，其将使得能够在同种异体受体中进行成功的移植。通常，早期胚期可能使得植入的供体组织较低 的免疫原性的；然而，胚胎组织移植物不能规避间接途径的排斥。然而，可以通过方案来解决这种挑战，其中上述方案包括诱导共刺激阻断的制剂。可替代地，在胚胎肺组织中显著水平的造血祖细胞(未发表的结果)可能会导致造血嵌合现象，在移植以后，其可诱导相对于供体源性肺细胞的中枢耐受。另外，冷冻保存20-22w肺组织的单细胞悬液的可能性，其可显著增强移植物的可用性，还可以使得能够建立关于脐带血的分型的HLA供体的库，从而可以潜在地减少免疫抑制需求。
最后，当在移植以后长时间随访时，通过在随访期结束时的高分辨率(80μm)显微CT以及通过病理检查，本发明的‘窗口’小鼠胚胎组织并没有呈现畸胎瘤的风险。
总而言之，目前的结果首次说明，妊娠的小管阶段提供用于收获用于再生移植的小鼠和人胚肺前体组织的最佳‘窗口’。这种组织，其没有畸胎瘤风险，高度富含若干类型的祖细胞，其是在它们的各自巢中通过免疫组织学识别的，这类似于在骨髓中的HSC。可以通过注入通过胚胎肺组织的酶消化所制备的单细胞悬液来提供这些祖细胞在损伤肺中的明显的植活、分化和强劲的并入。如在骨髓移植中，肺嵌合现象的诱导取决于某种形式的调理，以减少与宿主型内源性前体的竞争。虽然已提倡各种尝试来从成人肺分离多能干细胞以及在培养物中扩增这些细胞以用于再生移植的目的，但目前的结果说明，在妊娠20-22周时收获的胚胎肺组织可以潜在地提供用于肺修复的更简单的替代方式。
虽然已连同其具体实施方式一起描述了本发明，但显而易见的是，对于本领域技术人员而言，许多替代、改进和变化将是显而易见的。因此，它旨在涵盖在所附权利要求的精神和宽范围内的所有这样的替代、改进和变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容以引用方式结合于本说明书。另外，在本申请中任何参考文献的引用或认同不应被理解为承认这样的参考文献可作为本发明的在先技术。在使用了章节标题的范围内，它们不应该被视为一定是限制性的。