荧光碳纳米粒在心肌成像中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103773366 A (43)申请公布日 2014.05.07 CN 103773366 A (21)申请号 201310710701.X (22)申请日 2013.12.23 C09K 11/65(2006.01) C09K 11/02(2006.01) G01N 21/64(2006.01) A61K 47/04(2006.01) A61K 49/08(2006.01) A61P 9/00(2006.01) B82Y 20/00(2011.01) (71)申请人 四川大学 地址 610065 四川省成都市武侯区一环路南 一段 24 号 (72)发明人 高会乐 何。

2、勤 阮少波 (54) 发明名称 荧光碳纳米粒在心肌成像中的应用 (57) 摘要 本发明属生物材料和器官成像领域， 设计一 种荧光碳纳米粒在心脏成像中的应用。本发明将 桑蚕丝采用水热法处理后即得到荧光碳纳米粒， 该纳米粒对心肌细胞具有较好的靶向性， 且具有 较好的安全性， 因此能够用于心脏成像。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103773366 A CN 103773366 A 1/1 页 2 1. 荧光碳纳米粒在心肌造影中的应用。

3、， 其特征是一种量子点碳纳米材料， 可以靶向至 心脏而作为一种生物荧光探针。 2. 根据权利要求 1 所述的 “荧光碳纳米粒” 量子点材料， 其特征是主要由天然有机材料 （如桑蚕丝） 制备而成， 其具有荧光性质， 且有稳定的荧光量子产率。 权 利 要 求 书 CN 103773366 A 2 1/5 页 3 荧光碳纳米粒在心肌成像中的应用 技术领域 0001 本发明涉及材料学和器官成像领域， 特别涉及荧光碳纳米粒在心肌成像中的应 用。该碳纳米粒是将一系列含 “碳、 氢、 氧、 氮” 的有机材料通过 “水热法” 制备而成的粒径 在 10150nm 的纳米粒， 由于其本身的性质而能够用于心肌成像。。

4、 背景技术 0002 纳米粒作为一种常用的且较为新颖的药物载体， 近年来一直是研究的热点， 关键 在于其不断变化的存在形式， 制备方法， 理化性质。 纳米粒一般是指由天然或合成的高分子 载体材料制成， 是一种固态胶体， 粒径在 1 1000nm， 类似的分散系还有纳米球、 纳米囊、 纳 米胶束、 纳米脂质体、 纳米乳剂 （nanoemulsion,NE） 和纳米凝胶 （nanogel） 等， 其中比较常 见的是纳米粒。 0003 量子点 (quantum dot) 是准零维 (quasi-zero-dimensional) 的纳米材料， 是由 有限数目的原子组成， 三个维度尺寸均在纳米数量级。。

5、 量子点一般为球形或类球形， 是由半 导体材料 ( 通常由 II B B 或 IIIB VB 元素组成 ) 制成的、 稳定直径在 2 20 nil2 的纳米粒子。由于量子点纳米材料自身独特的元素组成及结构， 使其具有光致发光荧光效 应， 且具有稳定的荧光量子产率， 因此可作为生物荧光探针用于体内的诊断， 在生命科学邻 域具有一定的应用前景。 0004 荧光碳纳米粒为量子点的一种， 其主要材料为碳， 相比传统过渡金属量子点， 具有 安全性好、 来源丰富等优点， 因此引起广泛关注。 然而目前的研究主要集中在制备碳纳米粒 的方法， 较少研究关注其潜在的生物学应用。 0005 目前， 荧光碳纳米粒的制。

6、备方法主要分为物理方法和化学方法， 以化学方法为主， 化学方法有两种， 一种是采用胶体化学的方法在有机体系中合成， 另一种则是在水溶液中 合成。 水相直接合成法 ： 在水相中直接合成量子点的方法具有操作简便， 重复性好， 成本低， 表面电荷和表面性质可控， 生物相容性较好， 无显著性毒性， 并可以引入功能基团的优点， 其优良的性能使之作为一种新颖的生物荧光探针， 近年来受到越来越多邻域的青睐。 发明内容 0006 基于以上背景， 本发明目的之一是提供一种低毒性， 生物相容性好的量子点纳米 材料， 通过其光致发光荧光效应的性质， 作为一种生物荧光探针， 用于生物体内的影像学成 像与诊断。 000。

7、7 本发明所述的量子点纳米材料是一种含碳的有机材料通过水热法制备而成的， 即 将桑蚕丝在碱液中煮沸 1h， 再分别用乙醇、 水洗涤， 烘干后加入一定量水置于反应釜中， 于 200 C 反应 72h， 因此称为碳球纳米粒 （碳纳米粒） 。 0008 本发明的目的之一是提供一种简便易得， 成本低， 表面元素和电荷可控的碳纳米 粒， 由于其原材料的来源是天然的生物无机材料， 本身是无明显毒性的材料， 且仅由几种简 单的元素组成。 细胞学实验证明其毒性低， 生物相容性较好， 此生物无机材料制备的碳纳米 说 明 书 CN 103773366 A 3 2/5 页 4 粒荧光探针在心肌细胞的摄取与蓄积， 对。

8、心肌细胞无明显损害， 因此在用于心肌造影方面 具有一定的优势， 避免了一些有机荧光标记物质或是重金属元素制备的荧光标记物质对心 肌细胞的损害。 0009 本发明所述的碳纳米粒溶液的表征是利用其光学性质， 对于其最大激发波长 （EX） 和发射波长 （EM） 的确定， 是采用荧光分光光度计对进行扫描， 而其紫外吸收特征是采用紫 外分光光度计对碳纳米粒稀溶液进行扫描。 0010 本发明所述的碳纳米粒荧光量子产率是量子点纳米材料的一种表征， 一般采用参 比法测定， 即在相同激发条件下， 分别测定待测荧光试样和已知量子产率的参比荧光标准 物质两种稀溶液的积分荧光强度 （即校正荧光光谱所包括的面积） 以及。

9、对一相同激发波长 的入射光 （紫外 - 可见光） 的吸光度。再将这些值分别代入特定公式计算， 即得待测荧光试 样的量子产率 ; Yu = Ys Fu/Fs As/Au Yu、 Ys 分别为待测物质与参比物质的荧光量子产率 Fu、 Fs分别为待测物质与参比物质的积分荧光强度 As、 Au分别为待测物质与参比物质在该激发波长的入射光的吸收值 （A） 。 0011 运用此公式时一般要求吸光度值 As、 Au 低于 0.05， 参比标准物质与待测物质激发 波长相近的荧光物质， 据文献报道 ： 有分析应用价值的荧光化合物的 Yu 一般在 0.11 之 间。 0012 本发明的目的之一是提供一种具有可修饰。

10、的表面功能基团的碳纳米粒， 由于其 自身原材料较为单一的元素组成， 在水热法制备碳纳米粒的过程中， 其表面会产生一些含 “碳” 、“氮” 、“氧” 的功能基团， X 射线场发射电子能谱 （XPS） 进行表面元素分析， 可以分析 出有羧基、 氨基、 羟基等功能基团的存在， 红外光谱仪对其分析也进一步证实这些基团的存 在， 因此碳纳米粒在作为生物荧光探针的同时， 亦可对其修饰而作为药物传递至生物体内 的载体。 0013 本发明的目的之一是提供一种聚乙二醇 （PEG） 修饰的碳纳米粒生物荧光探针， 由 于碳纳米粒自身存在一定的聚集而致使其粒径增大， 稳定性降低， 并致使其荧光量子产率 降低， 对碳纳。

11、米粒表面的羧基进行修饰， 通过 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐 酸盐 (EDC.HCL) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 （NHS） 的活化， 使羧基形成一种 NHS 的活性酯， 加入 一端为氨基封端的聚乙二醇 （NH2-PEG， MW 5000） 室温避光反应 12h， 使碳纳米粒表面包裹 上一层 PEG， 从而延长其在体内的循环时间并增加其自身稳定性。 0014 本发明的目的之一是提供一种修饰了 PEG 并可以增加其在血液循环中的稳定性 的碳纳米粒。 由于血清蛋白的影响， 碳纳米粒的稳定性会降低， 与血清蛋白的结合而使其发 生聚集， 因此在进行血清稳定性实验时， 修饰了 。

12、PEG 的碳纳米粒的稳定性显著优于未修饰 PEG 的碳纳米粒。 0015 本发明的目的之一是提供一种可被动蓄积至心肌细胞的碳纳米粒， 由于其纳米数 量级的粒径， 在体内分布实验中， 可观察到心脏组织的摄取与蓄积较多， 因此， 利用此性质 可以用于心肌组织的造影。由于心脏毒性的存在， 限制了许多可能作为造影剂荧光探针的 使用， 如化学合成的荧光材料以及重金属元素制备的量子点纳米材料等。因此利用碳纳米 粒自身低毒性， 生物相容性好的特点， 可以对心脏组织纹理进行影像学成像， 观察心脏组织 的构造。 同时， 对于心脏组织中存在的病灶部位， 碳纳米粒生物荧光探针在摄取进入该部位 说 明 书 CN 10。

13、3773366 A 4 3/5 页 5 时会与正常组织存在差异， 因此可用于心脏组织病灶部位的诊断。 0016 有益效果 ： 本发明所介绍的碳纳米粒不仅可以作为药物传递至体内的载体， 而且 超越了常规意义上的纳米粒载体， 是一种量子点纳米材料， 其自身亦可作为一种生物荧光 探针， 用于体内的诊断， 现有的研究已经披露了其可用于肿瘤部位的诊断， 本发明与这些研 究不同的地方在于其用于心肌造影及心脏组织病灶部位的诊断方面的尝试， 同时由于其自 身低毒性及生物相容性较好 ； 表面具有可修饰的功能基团， 为进一步修饰提供可能性， 因此 具有一定的应用价值。 0017 附图说明 ： 图 1 ： 碳纳米粒。

14、的粒径分布图。 0018 图 2 ： 碳纳米粒与聚乙二醇 （PEG） 修饰的碳纳米粒在不同血清浓度条件下的稳定 性。血清浓度设置为 0%、 10%、 50%， 并设置磷酸盐缓冲液 （PBS） 作为对照。 0019 图 3 ： 心肌细胞对不同浓度碳纳米粒溶液 （31g/mL、 125g/mL、 500g/mL） 的摄取。 0020 图 4 ： 碳纳米粒对不同组织器官 （心、 肝、 脾、 肺、 肾、 脑） 及 “肿瘤” 部位分布及荧光 成像效果图。可以看出心脏组织的荧光成像效果最为明显。 0021 具体实施方式 ： 为了进一步阐述本发明， 下面给出一系列实施例。 这些实施例完全是例证性的， 它们仅。

15、 用来对本发明进行具体描述， 不应当理解为对本发明的限制。 0022 实施例一 ： 碳球纳米粒的制备 1.称取桑蚕丝约1g加入5%的Na2CO3溶液中加热煮沸， 并保持沸腾1h左右， 室温冷却。 0023 2. 将煮过的蚕丝用去离子水反复洗涤， 此过程重复 3 次， 再用双去离子水洗涤 3 次， 后用 75% 的乙醇洗涤 3 次， 再用无水乙醇洗涤 3 次， 其目的为了尽可能除去其中的杂质， 将洗涤好的蚕丝置于鼓风干燥器中充分烘干 （温度设置为 60C） 。 0024 3. 将烘干的蚕丝置于高温反应釜中的聚四氟乙烯内衬里， 加入 20mL 的双去离子 水， 此步骤要保证蚕丝被水浸没， 于 20。

16、0 C 反应 72h。 0025 4. 取出反应釜中的溶液， 用孔径为 0.22m 的水相滤膜挤压过膜， 即得到桑蚕丝碳 纳米粒溶液， 测定其粒径在 100nm 左右， 如图 1 所示。 0026 实施例二 ： 碳纳米粒的光学性质表征 1. 碳纳米粒的最大激发波长与发射波长的确定， 具体实验方案如下 ： 将原始溶液稀释2104倍， 浓度大约为1g/mL， 固定其发射波长， 对激发波长进行扫 描， 设置 EM 为 405nm、 415nm、 425nm、 435nm、 445nm、 455nm 及 430nm 分别扫描其激发波长， 可 观察到 EM 为 430nm 的激发波长强度最高， 因此大致。

17、确定最大激发波长在 350 nm 左右处。 0027 以同样的浓度为标准， 固定其激发波长， 对发射波长进行扫描， 设置 EX 为 320nm、 330nm、 340nm、 345nm、 350nm、 360nm、 370nm、 380nm、 390nm， 分别扫描其发射波长， 可观 察到EX为345n的发射波长强度最高。 因此大致确定最大激发波长在345nm， 最大发射波长 为 430nm。 0028 2. 碳纳米粒紫外吸收特征的确定， 具体实验操作如下 ： 将原始溶液稀释 125 倍， 浓度大约为 126g/mL, 于紫外分光光度计下对其进行扫 描， 扫描范围为 200800nm， 其吸收。

18、特征为随着波长的降低而升高， 在 208nm 和 274nm 处具 说 明 书 CN 103773366 A 5 4/5 页 6 有较为明显的吸收峰。 0029 实施例三 ： 碳纳米粒的荧光量子产率的测定 碳纳米粒荧光量子产率的测定是以硫酸奎宁为参比物质进行的， 具体操作如下 ： 1. 参数设置 ： 将荧光分光光度计的激发波长设置为 365nm（接近碳纳米粒的最大激发 波长） ， 紫外分光光度计的激发波长的入射光同样设置为 365nm。 0030 2. 参比溶液硫酸奎宁稀溶液的配制 ： 称取 34.2mg 的硫酸奎宁溶于 2mL 0.1N 的 H2SO4中， 超声， 振摇溶解后形成乳白色溶液 。

19、（考虑有少量未溶解） 。将该溶液稀释 6104倍， 测定其吸光度值为 0.039， 并测定其积分荧光强度 （Fs） 为 60314.775。 0031 3待测物质碳纳米粒稀溶液的配制 ： 将碳纳米粒原始浓度的溶液稀释 2104倍， 测定其吸光度值为 0.088， 并测定其积分荧光强度 （Fu） 为 60334.412。 0032 4根据 Melhuish 定律， 在 25C， 激发波长为 365nm， 硫酸奎宁的荧光量子产率为 0.546。因此将上述数据代入公式计算得到碳纳米粒的荧光量子产率为 0.342。 0033 实施例四 ： 碳纳米粒的 PEG 化 取 1mL 的浓度为 20mg/mL 。

20、碳纳米粒溶液置于 25mL 的圆底烧瓶中， 加 PBS（PH7.4） 至 5mL， 精密称取 EDC HCL 40.2mg（0.209mmol） ， NHS 22.6mg（0.196mmol） 置于溶液中， 室温 避光搅拌 3h， 即得到碳纳米粒的 NHS 活性酯。之后加入 200g 的 NH2-PEG（MW 5000） , 调 PH 至 8.0 左右， 室温避光搅拌 24h， 将反应好的溶液用 0.22m 的水相滤膜过滤， 即得 PEG 修 饰的碳纳米粒溶液。 0034 实施例五 ： 荧光碳纳米粒的血清稳定性实验 1. 碳纳米粒初始溶液与 PEG 化的碳纳米粒溶液的浓度确定 在进行血清稳定性。

21、实验时， 要对碳纳米粒与 PEG 化碳纳米粒溶液的吸光度值进行限 定， 两种溶液在 350nm 处的吸光度值应在 0.1 左右， 将碳纳米粒溶液稀释 100 倍， 再将 PEG 化的碳纳米粒溶液稀释 20 倍， 用紫外分光光度计测定两种溶液在 350nm 处的吸收值， 测得 碳纳米粒初始溶液的吸收值为 0.1024， PEG 化的碳纳米粒溶液的吸收值为 0.0826, 因此碳 纳米粒初始溶液的浓度大约是 PEG 化的碳纳米粒溶液的 1.25 倍。将稀释 100 倍的碳纳米 粒溶液再稀释 1.25 倍与稀释了 20 倍的 PEG 化的碳纳米粒溶液作为该实验浓度。 0035 2. 不同血清浓度的配。

22、制 取人血清 100L 用 PBS（PH7.4） 稀释至 1ML 制备成 10% 的人血清 , 另取人血清 500L 用 PBS（PH7.4） 稀释至 1ML 制备成 50% 的人血清。 0036 3. 用 PBS 作为空白对照， 分别取 100L 的 PBS、 10% 的人血清、 50% 的人血清置于 96 孔板， 再分别加入 100L 的碳纳米粒溶液与 PEG 化的碳纳米粒溶液。每个点设置 3 个附 孔。于化学发光仪上分别测定 0h、 1h、 2h、 4h、 8h、 12h、 24h 的紫外吸收值 （入射光的激发波长 设置为 560nm） ， 24h 时 PEG 化的碳纳米粒的血清稳定性明。

23、显好于未 PEG 化的， 如图 2 所示。 0037 实施例六、 荧光碳纳米粒的心肌成像效果 1、 取心肌细胞培养至玻璃底培养皿中， 待其生长到一定密度， 加入荧光碳纳米粒孵育， 之后于共聚焦显微镜下观察。 0038 如图 3 所示， 心肌细胞能够明显摄取荧光碳纳米粒而呈现绿色荧光。 0039 实施例七、 荧光碳纳米粒的体内心脏成像效果 1. 尾静脉注射荧光碳纳米粒至小鼠体内， 2h 后麻醉小鼠， 心脏灌流生理盐水和福尔马 说 明 书 CN 103773366 A 6 5/5 页 7 林， 之后取各脏器做冷冻切片， 并于共聚焦显微镜下观察各组织的荧光分布。 0040 如图 4 所示， 碳纳米粒在心脏具有较强的分布， 且强于肝、 脾等组织， 说明该纳米 粒具有良好的心肌靶向性和心脏成像效果。 说 明 书 CN 103773366 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103773366 A 8 2/2 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 103773366 A 9 。