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1、(10)申请公布号 CN 103977848 A (43)申请公布日 2014.08.13 CN 103977848 A (21)申请号 201410093616.8 (22)申请日 2008.04.04 60/922,296 2007.04.06 US 200880015296.7 2008.04.04 B01L 3/00(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 加利福尼亚技术学院 地址 美国加利福尼亚州 (72)发明人 戴聿昌 郑斯扬 JC-H林 HL卡斯丹 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 焦丽雅 (54)。
2、 发明名称 微流体装置 (57) 摘要 本文描述了与微流体装置有关的特定实施方 案， 所述微流体装置可用于细胞感测、 计数、 和 / 或分选。特定的方面涉及能够从稠密的细胞群体 中区分单个细胞型的微制造装置。一个特定的实 施方案涉及装置和使用该装置来从完整的、 未经 稀释的血液样品感测、 计数、 和 / 或分选白细胞的 方法。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图10页 (10)申请公布号 CN 103977848 。
3、A CN 103977848 A 1/1 页 2 1. 微流体装置， 其包括 基板， 所述基板具有 ： 与至少一个用于接受流体的入口流体连通的至少一个第一通道 ； 其中所述第一通道逐渐缩窄， 并导向第二通道， 所述第二通道具有固定宽度， 其包括检 测区域并具有与所述第一通道相比降低的横截面流动区域 ； 和 其中所述第二通道与至少一个流体流出口流体连通。 2. 权利要求 1 的微流体装置， 其中所述第一通道无障碍物。 3. 权利要求 1 的微流体装置， 其中所述第二通道无障碍物。 4. 权利要求 1 的微流体装置， 其中所述第一通道和第二通道都无障碍物。 5. 权利要求 1 的微流体装置， 其中。
4、从所述入口到所述流体流动出口之间的直接流体流 动路径无障碍物。 6. 权利要求 1 的微流体装置， 其中所述第二通道具有足够细胞通过的宽度。 7. 权利要求 6 的微流体装置， 其中所述细胞是白细胞。 8. 权利要求 7 的微流体装置， 其中所述白细胞选自单核细胞、 粒细胞、 巨噬细胞、 嗜中 性白细胞、 嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。 9. 权利要求 1 的微流体装置， 进一步包括流体递送模块， 用于将流体流以层流方式从 所述入口、 通过所述第一通道和所述第二通道， 导向所述流体流动出口。 10. 权利要求 1 的微流体装置， 其中所述装置中仅有的通道是所述第一通道和所述第 二通道。 11. 。
5、权利要求 1 的微流体装置， 其中所述第二通道具有的宽度足够单个细胞流动通过。 12. 权利要求 1 的微流体装置， 其中所述第二通道的高度是约 5m- 约 40m。 13. 权利要求 1 的微流体装置， 其中所述第二通道的宽度是约 5m- 约 50m。 14. 用于鉴定靶标的方法， 包括为权利要求 1 的微流体装置提供流体样品， 其中所述流 体样品包含至少一种染料 ； 提供激发源以便在靶标中诱导至少一种荧光信号 ； 使用微流体 装置中的传感器检测荧光信号 ； 和部分基于对荧光信号的分析鉴定靶标。 15. 权利要求 14 的方法， 其中所述靶标选自 ： 细胞、 细胞器、 细胞核、 颗粒、 DN。
6、A、 和 RNA。 16. 权利要求 14 的方法， 其中所述靶标包括选自以下的细胞 ： 单核细胞、 粒细胞、 巨噬 细胞、 嗜中性白细胞、 嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞、 或其它白细胞。 17. 权利要求 14 的方法， 其中所述靶标包括白细胞， 且所述染料包括吖啶橙。 18. 权利要求 14 的方法， 另外包括通过分析荧光信号来计数或分选样品中的靶标。 19. 权利要求 14 的方法， 其中所述流体样品包括血液。 20. 权利要求 14 的方法， 其中所述提供流体样品包括将所述流体样品泵送到所述微粒 体装置。 21. 权利要求 14 的方法， 其中所述提供所述流体样品包括将所述流体样品抽吸。
7、到所述 微流体装置中。 22. 权利要求 14 的方法， 其中所述流体样品以层流方式从所述入口、 通过所述第一通 道和第二通道， 到所述流体流动出口。 权 利 要 求 书 CN 103977848 A 2 1/10 页 3 微流体装置 0001 本申请是申请日为 2008 年 4 月 4 日， 申请号为 200880015296.7， 发明题目为 “微 流体装置” 的分案申请。 0002 相关申请的交叉引用 0003 本申请要求 2007 年 4 月 6 日提交的美国临时专利申请 60/922,296 的利益。 0004 政府利益的声明 0005 这 项 工 作 部 分 地 得 到 NASA 。
8、的 the National Space Biomedical Research Institute 的支持， 拨款编号 NCC9-58-317。美国政府在本发明中具有某些权利。 发明领域 0006 本公开涉及可用作细胞传感器和 / 或致动器的制造的微流体装置。在某些实施方 案中， 所述微流体装置可用于标记、 感测、 区分、 和 / 或分选目标， 特别是细胞群体。 0007 发明背景 0008 标准的细胞传感器或致动器通常是基于流细胞计数法且采用电阻抗感测、 光散射 测量、 和化学或免疫染色随后进行光学感测中的一种或其组合。 0009 对于通过电阻抗感测进行的血细胞区分， 借助溶胞除去红细胞，。
9、 以降低血容量。 溶 胞通常使用皂甙或表面活性剂进行。在溶胞处理过程中， 由于不同程度的细胞质内容物的 渗漏和细胞核收缩， 白细胞容积变化由细胞型决定。Fujimoto,Sysmex J.Int.9(1999)。 因此， 通过简单的粒子体积电阻抗测量可以实现通常 2 部分 ( 淋巴细胞对粒细胞 ) 或 甚至 3 部分 ( 淋巴细胞、 嗜中性白细胞、 和其它白细胞 ) 区分。Hughes-Jones 等人， J.Clin.Pathol.27 ； 623-625(1974) ； Oberjat 等人， J.Lab.Clin.Med.76 ； 518(1970) ； Vandilla 等人， Pro。
10、c.Soc.Exp.Biol.Med.125 ； 367(1967) ； Maeda 等人， Clin.Pathol.27 ； 1117-1200(1979) ； Maeda等人， Clin.Pathol.9 ； 555-558(1982)。 将直流阻抗和交流阻抗组 合， 在嗜碱性粒细胞通道中使用特殊的酸性溶血和在嗜酸性粒细胞通道中使用碱性溶血， 可以实现 5- 部分白细胞区分。Tatsumi 等人， Sysmex J.Int.9 ； 9-20(1999)。 0010 可供选择的光学方法基于细胞器、 颗粒和细胞核的光散射和荧光染色。 通常， 低角 散射的光包含关于细胞大小的信息， 而高角散射的。
11、光可用于探测细胞的内部组成。为了实 现 5 部分区分， 某些白细胞种群 ( 例如嗜酸性粒细胞 ) 需要特殊的染色使其散射特征改变 为与其它粒细胞不同， 且嗜碱性白细胞典型地需要在其它白细胞差别溶胞之后加以单独计 数。 McKenzie,Clinical Laboratory Hematology,Prentice Hall,2004 ； Fujimoto,Sysmex J.Int.9(1999)。 0011 一般说来， 常规的自动细胞分析器体积庞大、 价格昂贵、 并且机械上复杂， 这限制 了将其设置在医院或中心实验室。 常规的细胞分析器需要更大的样品体积且产生比使用微 装置开发的系统更多的废物。
12、。此外， 对于某些细胞型 ( 例如白细胞 ) 的分析， 计数、 区分、 和 / 或分选的准确性和速度对于确定疾病状态和治疗来说是重要的。 0012 附图简述 0013 图 1A 显示了吖啶橙的分子结构。 说 明 书 CN 103977848 A 3 2/10 页 4 0014 图 1B 显示了用吖啶橙进行的白细胞染色结果。 0015 图 2 显示了新的制造的微流体装置的一个实施方案的顶视图。 0016 图 3 显示了光学系统设置的一个实施方案。 0017 图 4A 显示了全血中的红细胞浓度。 0018 图 4B 显示用 100ng/mL 浓度的吖啶橙进行的全血中的白细胞染色。 0019 图 4。
13、C 显示用 1g/mL 浓度的吖啶橙进行的全血中的白细胞染 色。 0020 图 4D 显示用 10g/mL 浓度的吖啶橙进行的全血中的白细胞染色。 0021 图 4E 显示用 100g/mL 浓度的吖啶橙进行的全血中的白细胞染色。 0022 图 4F 显示在用 1mg/mL 浓度的吖啶橙进行的全血中的白细胞染色。 0023 图 5 显示在一个实施方案中的从单独的白细胞漂白得到的荧光信号。 0024 图 6A 显示根据一个实施方案用具有长波通发射过滤器 (long pass emission filter) 的 CCD 摄像机拍摄的具有聚焦的激光照射流的背景和 5m 小珠的图像。 0025 图 。
14、6B 显示根据一个实施方案用具有长波通发射过滤器的 CCD 摄像机拍摄的具有 激光照射流的背景和 5m 小珠的图像。 0026 图 6C 显示根据一个实施方案用具有长波通发射过滤器的 CCD 摄像机拍摄的具有 散射激光照射流的背景和 5m 小珠的图像。 0027 图 6D 显示根据一个实施方案用具有长波通发射过滤器的 CCD 摄像机拍摄的具有 散射激光照射流的背景和 5m 小珠追踪的图像。 0028 图 7 显示用具有长波通发射过滤器的光电二极管检测器进行的 5m 荧光小珠检 测的图。 0029 图 8A 显示根据一个实施方案得自用具有长波通发射过滤器的 CCD 摄像机拍摄的 视频的聚焦的激光。
15、束的背景图像。 0030 图 8B 显示根据一个实施方案用具有长波通发射过滤器的 CCD 摄像机拍摄的视频 的得自稀释的全血试验的白细胞信号。 0031 图9显示根据一个实施方案用中心处于525nm的绿色发射过滤器得到的吖啶橙染 色的未经稀释的全血的放大的光电二极管信号的时间描图， 峰经过标记。 0032 图 10 显示用具有中心处于 525nm 的绿色发射过滤器的光电二极管检测器得到的 信号强度的柱状图。 0033 图 11 显示用具有中心处于 650nm 的红色发射过滤器的光电二极管检测器得到的 信号强度的柱状图。 0034 图 12A 显示根据一个实施方案的手持检测盒器具的示例。 003。
16、5 图 12B 显示根据一个实施方案的组合的检测盒器具。 0036 图 13A 显示根据一个具体实施方案的装置的顶视图。 0037 图 13B 显示根据一个具体实施方案的装置的顶视图。 发明内容 0038 本文中公开的某些实施方案包括微流体装置， 其中所述微流体装置包括具有第一 通道的基板， 所述第一通道具有限定的物理特性， 其中所述第一通道与用于接受流体的至 少一个入口流体连通， 其中所述第一通道通向限制性进口， 并且其中所述第一通道与第二 说 明 书 CN 103977848 A 4 3/10 页 5 通道流体连通， 所述第二通道具有限定的物理特性， 其中所述第二通道与至少一个流体流 出口。
17、流体连通 ； 和流体生物样品。在某些实施方案中， 所述限定的物理特性是凹陷或突起。 在特定的实施方案中， 所述流体生物样品包括血液。 在某些实施方案中， 所述微流体装置另 外包括检测区域、 和 / 或过滤器阵列， 各自与所述通道和所述流体流出口流体连通。 0039 微流体装置包括基板， 所述基板具有至少一个第一通道， 所述第一通道具有限定 的物理特性 ； 在所述第一通道中形成至少一个第一入口， 用于接受第一流体 ； 其中所述第 一通道与一个分叉的通道流体连通， 其中所述分叉的通道与第三通道检测区域流体连通 ； 至少一个第二入口用于接受第二流体， 其中所述第二入口与一个有分支的通道流体连通 ； 。
18、过滤器结构与储存器流体连通， 其中所述储存器与所述第三通道检测区域流体连通 ； 在所 述第三通道中形成至少一个流体流出口 ； 和流体样品 ； 其中所述第二通道的横截面积与所 述第一通道的横截面积的比值为 1:10。在某些实施方案中， 所述限定的物理特性是凹陷或 突起。 0040 在某些实施方案中， 所述过滤器结构包括过滤器阵列， 所述第一流体包括鞘流体 (sheath fluid) 且所述第二流体包括血液。 0041 本文中公开的某些实施方案涉及包括一个微流体装置且另外包括光源的检测系 统 ； 透镜组件 ； 过滤器组件 ； 和图像采集装置。在一些实施方案中， 所述检测系统另外包括 至少一个显示。
19、单元或至少一个记录单元。 在某些具体实施方案中， 所述激发源包括激光， 特 别是氩气激光。 在特定的实施方案中， 所述过滤器组件包括激发过滤器， 和至少一个发射过 滤器。在某些实施方案中， 所述过滤器组件另外包括至少一个孔口和至少一个中性密度过 滤器。在特定的实施方案中， 所述过滤器组件另外包括至少一个玻璃偏光器。 0042 在某些实施方案中， 检测系统的透镜组件包括至少一个聚光透镜、 至少一个物镜、 和至少一个分束器。在特定的实施方案中， 所述图像采集装置包括至少一个 CCD 摄像机、 CMOS 装置、 光电二极管、 或光电倍增管。在某些实施方案中， 所述过滤器组件包括至少两 个发射过滤器且。
20、所述图像采集装置包括至少一个光电倍增管。在某些实施方案中， 所述显 示单元包括一个计算机和所述记录单元包括示波器。在特定的实施方案中， 所述激发源包 括氩气激光 ； 所述透镜组件包括聚光透镜、 物镜、 和分束器 ； 所述过滤器组件包括激发过滤 器、 针眼孔口和中性密度过滤器、 和至少一个发射过滤器 ； 所述图像采集装置包括 CCD 摄像 机和光电二极管， 且所述显示单元包括个人计算机， 且另外包括放大器。 0043 在特定的实施方案中， 检测系统的所述激发源包括氩气激光 ； 所述透镜组件包括 聚光透镜、 物镜、 和分束器， 所述过滤器组件包括激发过滤器、 至少一个发射过滤器 ； 所述图 像采集。
21、装置包括光电倍增管， 且所述显示单元包括个人计算机。 0044 本文中公开的其它实施方案涉及用于鉴定靶标的方法， 包括为至少一个微流体装 置提供流体样品， 其中所述流体样品包含至少一种染料 ； 提供激发源以便在靶标中诱导至 少一种荧光信号 ； 使用装置中的传感器检测荧光信号 ； 和部分基于对荧光信号的分析鉴定 靶标。在某些实施方案中， 所述靶标选自 ： 细胞、 细胞器、 细胞核、 颗粒、 DNA、 和 RNA。在其它 实施方案中， 所述靶标包括选自单核细胞、 粒 细胞、 巨噬细胞、 嗜中性白细胞、 嗜酸性粒细 胞、 嗜碱性粒细胞、 或其它白细胞的细胞。 在具体的实施方案中， 所述靶标包括白细胞。
22、， 且所 述染料包括吖啶橙。 所述方法的特定的实施方案另外包括借助荧光信号的分析计数或分选 样品中的靶标。在特定的实施方案中， 所述流体样品包括血液。 说 明 书 CN 103977848 A 5 4/10 页 6 0045 发明详述 0046 本公开涉及可用作细胞传感器和 / 或致动器的制造的微流体装置。在某些实施方 案中， 所述微流体装置可用于标记、 感测、 区分、 和 / 或分选细胞群体。 0047 微流体细胞传感器和致动器可以提供细胞感测和计数， 具有更准确的结果 和较低的成本。颗粒计数 ( 包括小珠、 红细胞、 和培养细胞 ) 已经通过例如电阻抗感 测、 光散射检测、 和荧光感测来说。
23、明。Gawad 等人， Lab Chip1 ； 76(2001) ； Lee 等人， Proceedings of the18thIEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems(MEMS)678-681(2005) ； Satake 等人， Sens.Actuators B:Chem.83 ； 77(2002) ； Morgan 等 人， Curr.Appl.Phys.6,367-370(2006) ； Lee 等 人， J.Micromech.Microeng.15 ； 447-454(2005) ； Alt。
24、endorf 等 人， Proceedings of the International Conference on Solid State Sensors and Actuators(Transducers 97)v.1,p.531,Chicago,IL(1997) ； Holmes 等人， Biosens.Bioelectron.21 ； 1621-1630(2006) ； Yang 等人， Meas.Sci. Technol.17 ； 2001-2009(2006) ； Simonnet 等人， Anal.Chem.78 ； 5653-5663(2006) ； Niehren 等人， A。
25、nal.Chem.67 ； 2666-2671(1995)。 0048 在光学感测领域中， 微制造已经允许开发微装置来代替基于玻璃毛细管的流动 室， 和用于使紧凑的光学器件一体化和提供芯片上的样品转运。 0049 细胞 ( 特别是白细胞 ) 的感测和计数是麻烦的， 这部分是由于细胞种群数量。对 于基于光学感测的微装置中的白细胞区分， 通过硅基片 的各向异性湿法蚀刻制造 V 型槽 微通道并且通过二参数光散射对经过稀释的血液进行 3 部分的白细胞区分， 而没有鞘流 动。Altendorf,Proceedings of the Int l Conference on Solid State Sens。
26、ors and Actuators,v.1,p.531(1997)。 0050 然而， 在本公开之前， 由于种种原因， 需要稀释用于细胞传感器和致动器的细胞样 品。一个原因是需要进行稀释以防止其中多种细胞同时出现在检测区域中的重合效应。在 人血液中， 红细胞或红血球与白细胞的比值为约 1000:1 的数量级， 典型地需要约一百到几 万的稀释系数， 以避免红细胞干涉电阻抗或光散射检测。此外， 对于在其中白细胞经过特 异性荧光标记的样品中计数白细胞， 通常需要至少十倍的稀释。Sheenan and Storey,J. Pathol.Bacteriol.59 ； 336(1947) ； Kass,J。
27、.Clin.Pathol.76 ； 810-12(1981) ； Weigl 等 人， Biomed.Microdev.3 ； 267-274(2001) ； 0051 还经常需要稀释避免堵塞样品室， 还为了除去在运行样品之前溶解的红细胞， 特 别是对于电阻抗或光散射检测来说。这些规程中的一些还需要另外的固定缓冲液。 0052 染料 0053 在本公开中， 可以将染料 ( 例如吖啶橙 (3,6- 二甲基胺吖啶， 图 1) 用于区分靶 标， 例如细胞、 细胞器、 颗粒、 细胞核、 分子 ( 包括双链或单链的核酸， 例如 DNA、 或 RNA、 染色 体、 还包括合成的形式 )。在一个特定的实施方。
28、案中， 可以在无需使红细胞溶胞或固定细 胞样品的情况下来检测、 计数或分选白细胞。某些染料， 例如吖啶橙， 由于快速扩散到细胞 中、 容易商购得到、 以及与常见光源 ( 即， 氩气激光和可见范围中的其它广谱光源 ) 和滤光 器的激发和发射波长相容性， 也是合乎需要的。Kosenow,Acta Haematol.7,217(1952) ； Schiffer,Blood,19,200(1962) ； Jackson,Blood,17,643(1961) ； Hallermann 等 人， Verh Deutsch Ges Inn Med.70,217(1964)。 说 明 书 CN 1039778。
29、48 A 6 5/10 页 7 0054 吖啶橙是一种对 pH 敏感的荧光阳离子染料， 其通过静电引力结 合于双链 DNA 并且将吖啶橙插入在碱基对之间。在结合时， 激发最大值变为 502nm， 发射最大值变为 525nm( 绿色 )。吖啶橙还结合于 RNA 和单链 DNA， 激发最大值移位到 460nm， 发射最大值为 650nm( 红色 )。Adams and Kamentsky,Acta Cytol.15,289(1971) ； Adams and Kamentsky Acta Cytol.18,389-91(1974) ； Steinkam等人， Acta Cytol.17,113-1。
30、7(1973)。 吖啶橙在其 在中性 pH 时为疏水性的且可以容易地扩散通过细胞膜和细胞核膜以结合于 RNA 和 DNA 方 面也是合乎需要的。 在活细胞中， 吖啶橙在溶酶体的酸性环境中被质子化， 这使得其为阳离 子型的并防止染料从溶酶体膜泄漏出来。Moriyama 等人， J.Biochem.92 ； 1333-36(1982)。 在吖啶橙用于白细胞分析时， 细胞核被染色为绿色带有轻微混合的红色， 是由于双链 DNA 和单链 DNA 引起的， 而细胞质被染色为红色， 是由于 RNA 和溶酶体。因此， 可以通过使用绿 色荧光通道的强信号容易地实现白细胞计数。 可以通过分析得自红色荧光通道的信号。
31、来实 现白细胞区分。 0055 对于新染色的白细胞， 可以通过研究用吖啶橙染色的经过稀释的血液样品 的红色荧光信号实现 3 部分区分 ( 淋巴细胞、 单核细胞、 和粒细胞 )， 而已经用低渗稀 释物和新鲜的吖啶橙染色的白细胞样品显示了 5 部分区分白细胞 ( 淋巴细胞、 单核 细胞、 嗜中性白细胞、 嗜酸性粒细胞、 和嗜碱性白细胞 )。Adams and Kamentsky,Acta Cytol.15,289(1971) ； Adams and Kamentsky,Acta Cytol.18,389-391(1974) ； Steinkam等 人， Acta Cytol.17,113-17(1。
32、973)。 0056 其它染料可用于本文中描述的某些实施方案中， 例如溴化乙锭、 三染料组合物 ( 溴化乙锭、 brilliant sulfaflavine、 和均二苯乙烯二磺酸衍生物 ) ； 恶嗪染料、 碱性橙 21、 和聚甲炔染料。Shapiro 等人， J.Histochem.Cytochem.24,396-411(1976) ； Shapiro 等 人， J.Histochem.Cytochem.25,836-844(1977) ； U.S.Patent No.4,376,820 ； U.S.Patent No.4,882,284 ； Tibbe 等人，Nat.Biotechnol.1。
33、7,1210-1213(1999) ； U.S.Patent No.4,400,370 ； Kass,J.Histochem.Cytochem.36,711-715(1988)。 0057 装置 0058 本公开的一个实施方案涉及用于细胞计数和 / 或分化的设备或装置。在特定的 实施方案中， 所述设备或装置包括由例如硅、 玻璃、 塑料、 金属、 或其它材料的材料形成的 基板。本公开的一个特定的实施方案是使用软石板印刷术 （soft lithography） 制造的。 Quake,Science290,1536-40(2000)。根据具体的实施方案， 也可以使用其它光刻或蚀刻技 术。 0059 。
34、装置的一个实施方案是使用以 10:1 比例剧烈混合的两部分 PDMS( 聚二甲硅 氧烷 )(Sylgard184,Dow Corning,MI,USA) 微制造的 (microfabricated)。在真空脱气 约 30 分钟之后， 将混合物倾倒在 DRIE 蚀刻的硅模具上， 所述模具已经用 HMDS( 六甲基 二硅氮烷 ) 预先处理以便在烘焙之后容易分离。将模具在 80烘焙 30 分钟。将硬化 的 PDMS 从硅模具上分离， 并将 PDMS 片材切割成碎片并在每个碎片上用 Luer 短柱适配 器 (Becton Dickinson,NJ,USA) 刺扎射流进入孔。将每个 PDMS 碎片小心地。
35、置于经过净 化的载玻片上并在 80烘焙过夜。在一些情况中， 对 PDMS 和载玻片进行氧气等离子体 处理 (300mTorr,25W,30s)， 以便改善它们之间的粘着， 特别是对于意在重复利用的装置。 Bhattacharya 等人， J.Microelectromechan.Syst.14,590-97(2005)。 说 明 书 CN 103977848 A 7 6/10 页 8 0060 在一个特定的实施方案中， 在 1cm x1cm PDMS 块上模制通道结构， PDMS 块的厚度 小于 3mm。在一个特定的实施方案， 通道深度为 16m， 以便容纳大的白细胞。 0061 所述装置的一。
36、个示例性实施方案显示在图 2 中。对于这个特定的实施方案， 第一 流体流动入口 200 允许例如鞘流动流体的沉积并与具有第一通道臂 260 和第二通道臂 270 的分叉通道流体连通， 所述第一通道臂 260 和第二通道臂 270 都汇合在储存器 290 和检测 区域 240 的接头处。在这个特定的实施方案中， 所述装置另外包括第二流体流动入口 210， 其允许沉积例如样品流体例如血液， 第二流体流动入口 210 经由有分支的样品流动区域通 道 220 与过滤器阵列结构 230 流体连通并与流体流出口 250 流体连通。在这个特定的示例 性实施方案中， 采用二维的水动力聚焦来控制检测区域 240。
37、 中的细胞样品的颗粒位置。根 据图2中所示的实施方案， 鞘流动与中心样品流动的横截面积之比为10:1， 检测区域240的 通道宽度为50m， 被聚焦的样品流动的宽度优选为5m或更小。 在特定的实施方案中， 通 道包括物理特性， 例如凹陷或突起。 0062 装置的一个其它示例性实施方案显示在图 13A 中。对于这个特定的实施方案， 流 体流动入口 1340 允许样品流体例如生物样品或包含靶标的其它流体样品的沉积。在一 个特定的实施方案中， 生物样品包括细胞样品， 例如血液。在这个示例性的实施方案中， 流体入口与第一通道 1330 流体连通， 第一通道 1330 包含与第二通道 1310 并列的限。
38、制性 进口 1320， 所述第二通道 1310 包括检测区域， 所述检测区域还与流体流出口 1300 流体连 通。在某些实施方案中， 第一和 / 或第二通道的高度为大约 5m、 大约 8m、 大约 10m、 大约 12m、 大约 15m、 大约 20m、 大约 25m、 大约 30m、 大约 35m、 大约 40m、 或其 之间的任何值。在某些实施方案中， 第二通道的宽度为大约 5m、 10m、 大约 15m、 大约 20m、 大约 25m、 大约 30m、 大约 35m、 大约 40m、 大约 45m、 大约 50m、 或其间的 任何数值。在图 13A 中所示的示例性实施方案中， 第二通道宽。
39、度为大约 20m 大小。 0063 装置的一个其它示例性实施方案显示在图 13B 中。对于这个特定的实施方案， 流 体流动入口 1440 允许样品流体例如生物样品或包含靶标的其它流体样品的沉积。在一 个特定的实施方案中， 生物样品包括细胞样品， 例如血液。在这个示例性的实施方案中， 流体入口与第一通道 1430 流体连通， 第一通道 1430 包含与第二通道 1410 并列的限制性 进口 1420， 所述第二通道 1410 包括检测区域， 所述检测区域还与流体流出口 1400 流体连 通。在某些实施方案中， 第一和 / 或第二通道的高度为大约 5m、 大约 8m、 大约 10m、 大约 12m。
40、、 大约 15m、 大约 20m、 大约 25m、 大约 30m、 大约 35m、 大约 40m、 或其 之间的任何值。在某些实施方案中， 第二通道的宽度为大约 5m、 10m、 大约 15m、 大约 20m、 大约 25m、 大约 30m、 大约 35m、 大约 40m、 大约 45m、 大约 50m、 或其间的 任何数值。在图 13B 中所示的示例性实施方案中， 第二通道宽度为大约 30m 大小。 0064 装置的某些实施方案使用聚焦的激光源用于照射， 因为非常期望细胞聚集在检测 区域 240 中。然而， 本公开中所包括的其它实施方案使用更均匀地散射的光源和缝隙孔径。 这种实施方案利用直的。
41、通道几何形状而不用细胞集中。在一个实施方案中， 检测区域 240 的通道长度为 1000m。在某些实施方案中， 还可以在在样品流动区域 220 的上游包括过 滤器结构 230， 其将包括红细胞叠连和其它大粒子聚集物在内的污染物过滤掉， 以防止检 测区域 240 中的堵塞。在某些实施方案中， 过滤器结构 230 的矩形基柱结构部件的大小为 200mx40m。在三列基柱中的每一列之间的间距分别为 40m、 30m、 和 20m， 其甚至 说 明 书 CN 103977848 A 8 7/10 页 9 允许最大的白细胞通过过滤器区域 230。 0065 系统 0066 如图 3 中所示， 在光具座上。
42、建立光学系统 ( 透射的激光诱导的荧光检测系统或 LIF)。在一个特定的实施方案中， 系统设置包括激发或激光光源 300、 透镜组件 340、 微流体 装置 350、 可选的另外的透镜组件 360、 过滤器组件 320、 330、 和图像采集装置 390、 395。在 某些实施方案中， 一个或多个发射过滤器包括过滤器组件 320、 330， 在某些实施方案中， 图 像采集装置 395 包括电荷耦合器件 (CCD) 照相机、 互补型金属氧化物半导体 (CMOS) 装置、 或光电倍增管 (PMT) 装置。在特定的实施方案中， 图像采集装置 395 可以偶接为与显示单 元或计算装置 396 例如个人。
43、计算机相通讯。本领域技术人员会认识到， 有多种和不同的计 算机软件程序可用于从系统接受到的数据的积分、 汇编、 分析、 再组合、 和其它操作， 特别是 借助于计算装置 396。 0067 在 一 个 特 定 的 示 例 性 实 施 方 案 中，将 氩 气 激 光 (National Laser NLC210BL,488nm， 和 15-30mW 可调， Salt Lake City,UT,USA) 用作激发源。将直径 50m 的孔口 310 置于激光输出前面， 以促进对准过程和降低照射强度。在某些实施方案中， 可选 的激光 - 线带通过滤器 ( 带宽等于约 1.9nm， 中心波长处于 488n。
44、m) 用于进一步纯化激光光 源。在某些其它实施方案中， 可选的中性密度过滤器 (NDF) 用于衰减激光激发。或者， 针眼 和 NDF 被两个线性的玻璃偏光器 (Edmond Optics TECH SPEC,Barrington,NJ,USA) 代替， 以便可以容易地调节装置上的照射水平。 0068 在一个特定的实施方案中， 使用长工作距离显微镜物镜 (USMCO M Plan Apo,10x,0.28NA,Dayton,NV,USA) 作为聚光透镜 340。使用另一个长工作距离的显微镜物 镜(Bausch&Lomb,50x,0.45NA,Rochester,NY,USA)作为物镜360。 在。
45、相同的实施方案中， 在 一个特定的试验中使用三个发射过滤器 320 ： 488nm 长通过滤器 (Chroma H1500LP， 转换宽 度 4.9nm， 边沿陡度 =2.5nm,Rockingham,VT,USA)、 中心波长为 525nm 且频带宽度 50nm 的 绿色带通过滤器 (Chroma D525_50m)、 和中心波长 650nm 且频带宽度 50nm 的红色带通过滤 器 (Chroma D650_50m)。使用宽带非偏振混频立方体分束器 370(Newport05BC17MB.1,400 -700nm,R/T=45%/45%,Irvine,CA,USA) 来将光同时引导到光电二。
46、极管检测器 380 和 CCD 摄 像机。 0069 信号经过电学放大并用硅光电二极管接收机组件 390(Electro-Optical S ystems,UVS-025-H,Phoenixville,PA,USA) 或光子倍增管 (PMT,Hamamatsu H5784-20,Japan) 检测。电压信号被送往深记忆示波器 (deep memory oscilloscope， HP54645A,PaloAlto,CA,USA)。 在示波器中的缓冲器充满时， 数据可以被加载到计算机并用 Matlab 峰值 - 检测程序来分析。可以用模拟的 CCD 摄像机 (Hitachi KP-D20B,Ja。
47、pan) 以每 秒 30 帧拍取视频， 然后转化为数字格式并储存在计算机 396 中。在本文中所描述的特定的 实施方案中也可以使用其它图像采集装置 395， 例如 CMOS、 PMT、 或其它装置。在某 些示例 性试验运行过程中， 利用光电二极管检测器和PMT的系统设置比CCD摄像机更灵敏， 具有更 快的时间响应。在一个示例性的试验运行过程中， 首先借助得自 CCD 摄像机的图像将光学 系统粗糙地对准哑设备 (dummy device)。使用适当的对准容易地实现检测区域上的 10m 直径的照射斑点。 0070 如图12A和图12B中所示， 本发明的装置可以被并入到手持的单元中， 所述手持单 说。
48、 明 书 CN 103977848 A 9 8/10 页 10 元包括激光光源 ( 例如激光发射二极管或 LED120)、 至少一个透镜 190、 至少一个具有可选 的分束器的过滤器组件 195、 在微芯片或其它基板上的本文中所述的微流体装置 185、 输入 /输出端口130、 至少一个图像采集装置100、 110(其可以是光电倍增管)。 在某些实施方案 中， 手持单元可以用外罩壳或壳体 150、 180 和铆钉或螺栓 140、 160 组装并包装起来。 0071 细胞检测 0072 本公开的一个方面涉及利用微制造的装置从未经稀释的细胞样品 ( 例如人或其 它动物的血液 ) 计数和 / 或区分。
49、细胞 ( 特别是白细胞 ) 的方法。在一个示例性的实施方案 中， 细胞检测利用吖啶橙和新鲜的全人血来进行。 0073 在一个示例性实施方案中， 新鲜的人血液得自健康的供体并且在收集的 3 天 内使用。向血液样品中添加 EDTA 以防止凝固。对于吖啶橙染色， 可以加入储备溶 液， 以 得 到 在 Ficoll-Paque Plus 中 的 10g/mL 的 最 终 染 料 浓 度。Ficoll-Paque Plus 还用作鞘流动溶液。荧光的聚苯乙烯小珠 (5m 绿色荧光小珠 ) 购自 Duke Scientific Corporations,Fremont,CA,USA。 细 胞 核 染 色 吖 啶 橙 得 自 Molecular Probes,Eugene,OR,USA， 并 溶 解 于 水 中， 以 实 现 10mg/mL 的 储 备 溶 液。 。