一种主动靶向的靶向多肽修饰的壳聚糖载体材料及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103816547 A (43)申请公布日 2014.05.28 CN 103816547 A (21)申请号 201410098093.6 (22)申请日 2014.03.18 A61K 47/42(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C08B 37/08(2006.01) A61K 31/704(2006.01) (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大道 639 号 (72)发明人 葛亮 施秦 刘建平 李芳 (54) 发明名称 一种主动靶向的靶向多肽修饰的壳聚糖载体 材料及其制备方法 (57) 摘要 本发明。

2、设计了一系列多肽修饰的壳聚糖主动 靶向的纳米载体， 材料属于医药技术领域。作为 纳米载体材料靶头的多肽是通过新型药物辅助设 计软件 MOE2011 设计得出， 通过对接能量的考察 得到的一系列多肽并通过固相合成法所合成。纳 米载体的主体材料是 6-O 羧化壳聚糖， 多肽通过 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐酸 盐 (EDC.HCl) 作为催化剂， 将靶头多肽成功的接 枝到 6-O- 羧化壳聚糖上， 通过红外光谱和核磁共 振进行表征， 将该材料通过离子凝胶法成功制备 成纳米粒， 通过一系列体外细胞实验验证其安全 性和靶向性。结果显示其作为安全有效的纳米靶 向载体具有极好的前。

3、景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 附图6页 (10)申请公布号 CN 103816547 A CN 103816547 A 1/2 页 2 1. 一种主动靶向性的靶向多肽修饰的壳聚糖载体材料， 其特征在于， 其结构如下 ： 其中， R 的基本结构为半胱氨酸 C- 精氨酸 R- 甘氨酸 G- 天冬氨酸 D-X 氨基酸 - 半光氨 酸 C， 连接键为 -NH。 2. 根据权利要求 1 所述的靶向多肽修饰的壳聚糖载体材料， 其特征在于， 所述靶向多 肽的基本结构为半胱。

4、氨酸 C- 精氨酸 R- 甘氨酸 G- 天冬氨酸 D-X 氨基酸 - 半光氨酸 C， 两个 半胱氨酸通过二硫键的作用形成六元环肽， X 氨基酸为三种含有疏水结构的氨基酸， 分别为 酪氨酸 Y， 组氨酸 H 和丝氨酸 W， 三种多肽的结构式分别如下 ： X 氨基酸为酪氨酸 Y、 权 利 要 求 书 CN 103816547 A 2 2/2 页 3 X 氨基酸为组氨酸 H、 X 氨基酸为丝氨酸 W。 3. 根据权利要求 1 所述的靶向多肽修饰的壳聚糖载体材料， 其特征在于， 所述壳聚糖 为羧甲基化壳聚糖， 同时具有氨基和羧基结构。 4. 根据权利要求 3 所述的靶向多肽修饰的壳聚糖载体材料， 其特。

5、征在于， 所述羧甲基 化壳聚糖形成的羧甲基化反应主要发生在 6 位的羟基上， 羧甲化程度为 80-90之间。 5. 根据权利要求 3 所述的靶向多肽修饰的壳聚糖载体材料， 其特征在于， 所述羧甲基 化壳聚糖的分子量为 20 万 -30 万。 6. 权利要求 1 所述靶向多肽修饰的壳聚糖载体材料的制备方法， 其特征在于， 其主要 包括以下步骤 ： 通过 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐酸盐活化羧甲基化壳聚 糖 6 位羧甲基上的羧基， 和所述靶向多肽上的氨基通过形成酰胺键， 使多肽修饰到壳聚糖 载体结构上， 平均每 40-80 个的壳聚糖单体上修饰有一个靶向多肽。 权 利 要。

6、 求 书 CN 103816547 A 3 1/6 页 4 一种主动靶向的靶向多肽修饰的壳聚糖载体材料及其制备 方法 技术领域 0001 本发明本发明涉及了一系列多肽修饰的壳聚糖主动靶向的载体材料， 属于医药技 术领域。 背景技术 0002 整合素是一种异源二聚体组成的膜受体家族， 其分子由两个亚基 ， 两个亚基 组成， 位于细胞表面， 具有粘附和信号传导功能。研究表明， 整合素 v3 在新生血管的内 皮细胞和多种肿瘤细胞表面高度表达， 在血管新生和肿瘤生长方面发挥了重要的作用。小 分子的靶向肽通过一定的手段和生物大分子结合， 将生物大分子导入肿瘤部位， 选择性的 和肿瘤部位过度表达的整合素 。

7、v3 特异性结合， 使药物和载体实现主动靶向， 提高化学 治疗药物的靶向性， 为肿瘤患者带来新的希望。 0003 一类具有精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸序列的短肽中的 RGD 片段是上述整合素 v3 与其配体蛋白相互作用的识别位点。基于上述特点， 研究者合成了大量含有 RGD 序 列的线性或者环型多肽作为整合素 v3 的拮抗剂。构象关系表明， RGD 肽与整合素的亲 和性和特异性都取决于 RGD 氨基酸残基的侧链， 特别是天冬氨酸的侧链。大多数线性肽在 体内循环的半衰期较短， 这是因为线性肽链天冬氨酸残基易被蛋白酶水解。而引入二硫键 结构可以减少天冬氨酸残基调整自身位置来发生降解， 从而提高。

8、其稳定性， 而且可以同时 具有更强的受体结合性和受体特异性。因此环化成为 RGD 肽制备和研究的常用方法。通过 噬菌体展示库技术发现， 由两个半胱氨酸形成的二硫键而成环的RGD肽对整合素v3有 很好的亲和性， 与以酰胺键成环的 RGD 肽相比， 二硫键环刚性更强， RGD 的结构更为固定， 并 且不用在肽环结构中引入多于氨基酸作为连接位点。 0004 在结构 - 活性关系的研究中， 在形成环肽结构中， 精氨酸 1- 甘氨酸 2- 天冬氨酸 3 的结构是保证 RGD 活性所必须的， 同时在 3 位和 4 位氨基酸的位置及其氨基联接的质子所 处的位置与该 RGD 多肽与整合素 v3 的亲和性有很大。

9、的影响。其中， 最最需要考虑的是 4 位氨基酸的疏水性作用和氢键形成可能性。相比较而言， 5 位氨基酸对与整合素亲和性的 影响则不是那么的重要了。 0005 纳米载体运载抗癌药物已经成为研究的一个热点， 可以很好的克服传统的药物传 输体系的缺点。纳米粒子是一种粒径在 10-500nm 之间的， 一种超微型球型的药物载体， 其 活性部分通过溶解， 包裹作用位于粒子内部， 或者通过吸附， 附着作用位于粒子表面。今年 来发现壳聚糖具有较好的生物粘附性， 促吸收作用和酶抑制载体作用等特性， 使其在给药 系统中备受青睐。但壳聚糖在水溶液中的溶解性是其使用受限的主要因素， 所以在壳聚糖 的修饰也可以选择其。

10、亲水性增加作为研究的重点。羧化壳聚糖中既有 -COOH 也有 -NH2， 其 水溶性也得以改善， 在一定程度上使其具有更优的生物相容性。 发明内容 说 明 书 CN 103816547 A 4 2/6 页 5 0006 本发明的目的是提供了一系列多肽作为靶头及其应用。这种多肽是整合素受体 v3 亲和力较好的靶头， 能够使药物和载体实现主动靶向， 提高化学治疗药物的靶向性。 0007 本发明是通过下述方案实现的 ： 0008 本发明提供了一种主动靶向性的靶向多肽修饰的壳聚糖载体材料， 其结构如下 ： 0009 0010 其中， R 的基本结构为半胱氨酸 C- 精氨酸 R- 甘氨酸 G- 天冬氨酸。

11、 D-X 氨基酸 - 半 光氨酸 C， 连接键为 -NH。 0011 作为优选， 所述靶向多肽的基本结构为半胱氨酸 C- 精氨酸 R- 甘氨酸 G- 天冬氨酸 D-X氨基酸-半光氨酸C， 两个半胱氨酸通过二硫键的作用形成六元环肽， X氨基酸为三种含 有疏水结构的氨基酸， 分别为酪氨酸 Y， 组氨酸 H 和丝氨酸 W， 三种多肽的结构式分别如下 ： 0012 0013 X 氨基酸为酪氨酸 Y、 0014 说 明 书 CN 103816547 A 5 3/6 页 6 0015 X 氨基酸为组氨酸 H、 0016 0017 X 氨基酸为丝氨酸 W。 0018 作为另一种优选， 所述壳聚糖为羧甲基化壳。

12、聚糖， 同时具有氨基和羧基结构。 0019 进一步优选， 所述羧甲基化壳聚糖形成的羧甲基化反应主要发生在 6 位的羟基 上， 羧甲化程度为 80-90之间。 0020 另一种进一步优选， 所述羧甲基化壳聚糖的分子量为 20 万 -30 万。 0021 本发明还提供了所述靶向多肽修饰的壳聚糖载体材料的制备方法， 其主要包括以 下步骤 ： 通过 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐酸盐活化羧甲基化壳聚糖 6 位 羧甲基上的羧基， 和所述靶向多肽上的氨基通过形成酰胺键， 使多肽修饰到壳聚糖载体结 构上， 平均每 40-80 个的壳聚糖单体上修饰有一个靶向多肽。 0022 优选地， 。

13、本发明还提供了 CRGDYC 修饰 6-O- 羧化壳聚糖的合成方法及修饰后材料 说 明 书 CN 103816547 A 6 4/6 页 7 纳米粒制备的方法 ： 0023 以重量计， 精密称取 6- 羧甲基壳聚糖 25-100 份， 溶于 100-200 份水中， 搅拌使 其充分溶解， 加入一定量的 EDC.HCL， 搅拌 5-10min， 随后加入 5-30 份的 CRGDYC 多肽， 在一定温度和时间下进行搅拌， 搅拌后加入 0.1mol L 的盐酸调节 pH 使产物析出， 2000-4000rpm、 40-80min冷冻离心， 取上清液测荧光吸收， 沉淀收集透析24-72h， 每隔6h。

14、换 液一次， 产物冷冻干燥处理， 收集产物， 即得。 0024 将冻干的 CRGDYC-6-O 羧化壳聚糖溶于去离子水中， 配成 1.5-5mg ml 的 CRGDYC-6-O-CMC 溶液并调节其 PH 至 7.0-9.0 左右， 移取 5-10ml, 磁力搅拌下加入一定量 的盐酸阿霉素， 超声溶解。 再将一定浓度的氯化钙溶液加入迅速滴入上述溶液中， 持续搅拌 20-60min, 澄清的溶液出现乳光， 既得盐酸阿霉素 CRGDYC-6-O-CMC 纳米粒混悬液。将混 悬液 12000-16000rpm 转 30-60min, 收集沉淀物， 冷冻干燥， 即得纳米粒。以类似的方法不 加盐酸阿霉素。

15、， 即得空白纳米粒。 0025 本发明设计出对整合素受体 v3 亲和力较好的多肽靶头， 并且将其修饰在壳 聚糖上， 形成肿瘤靶向载体， 能够使药物和载体实现主动靶向， 提高化学治疗药物的靶向 性， 为肿瘤患者带来新的希望。 0026 多肽的合成现在越来越多人开始采用固相合成法。固相合成的主要设计思想是 ： 先将所要合成肽链的羧末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相 连， 然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活 化羧基组分反应接长肽链。这样的步骤可以重复的多次进行下去， 即缩合洗涤去 保护中和和洗涤下一轮缩合， 最后达到所需要合成的肽链长度。。

16、 0027 该设计的多肽在结构较为稳定， 二硫键所形成的连接可以提供给结构更好的结构 刚性， 更好的保证精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸结构的空间位置和结构稳定， 通过计算机软件 的拟合， 通过与同样为靶向多肽的西仑吉肽的比较， 其具有更好肿瘤细胞靶向性， 与整合素 受体 v3 的亲和力更强， 后期通过细胞实验也证明其对肿瘤细胞的亲和性极好。 0028 纳米载体运载抗癌药物已经成为研究的一个热点， 可以很好的克服传统的药物传 输体系的缺点。纳米粒子是一种粒径在 10-500nm 之间的， 一种超微型球型的药物载体， 其 活性部分通过溶解， 包裹作用位于粒子内部， 或者通过吸附， 附着作用位于粒子表面。。

17、今年 来发现壳聚糖具有较好的生物粘附性， 促吸收作用和酶抑制载体作用等特性， 使其在给药 系统中备受青睐。但壳聚糖在水溶液中的溶解性是其使用受限的主要因素， 所以在壳聚糖 的修饰也可以选择其亲水性增加作为研究的重点。羧化壳聚糖中既有 -COOH 也有 -NH2， 其 水溶性也得以改善， 在一定程度上使其具有更优的生物相容性。 0029 通过多肽形成的 6-O- 羧化壳聚糖， 通过 MTT 实验， 证实其空白载体对肿瘤细胞呈 现较高的安全性， 在最高的浓度下细胞的存活率依然达到 85以上， 而与注射剂和未修饰 载体的比较， 表现出对肿瘤细胞的更大杀伤作用。随后通过激光共聚焦实验和流式细胞实 验，。

18、 定性定量的考察其的细胞靶向性。 在激光共聚焦实验中， 可以清楚的看出肿瘤细胞对上 述多肽修饰载体和未修饰载体的摄取存在很大的差别， 多肽修饰载体的细胞摄取率明显高 于未修饰的载体。在流式细胞实验结构中， 可以清楚的看出不同时间点肿瘤细胞对两种载 体的摄取存在显著性差异， 修饰的载体的肿瘤细胞摄取量几乎是未修饰载体的两倍， 多肽 修饰的载体明显优于未修饰的载体。 说 明 书 CN 103816547 A 7 5/6 页 8 附图说明 0030 图 1CRGDYC 环肽的合成路线图 ； 0031 图 2 为多肽 CRGDYC 的 HPLC 图谱 ； 0032 图 3 为多肽 CRGDYC 的质谱。

19、图 ； 0033 图 4 为 6-O 羧甲基壳聚糖的质谱图 ； 0034 图 5 为多肽 CRGDYC 修饰后的 6-O 羧甲基壳聚糖的质谱图 ； 0035 图 6 为空白多肽 CRGDYC 修饰后的 6-O 羧甲基壳聚糖纳米粒载体的细胞毒性评价 结果 ； 0036 图7为载阿霉素CRGDYC修饰载体， 空白载体和盐酸阿霉素注射液的细胞毒性评价 结果 ； 0037 图 8 为细胞摄取的激光共聚焦实验结果图 ； 0038 图 9 为细胞摄取的细胞摄取的定量实验 - 流式细胞实验结果图 ； 0039 图 10 CRGDYC 多肽在整合素 v3 中所处位置的 2D 图。 具体实施方式 0040 实施。

20、例 1 0041 精密称取 6- 羧甲基壳聚糖 62.5mg， 溶于 150ml 水中， 搅拌使其充分溶解， 加入 3mg 的 EDC.HCL， 搅拌 5min， 随后加入 17.5mg 的 CRGDYC 多肽， 在 30条件下搅拌 60min， 搅拌后 加入0.1molL的盐酸调节pH使产物析出， 3000rpm、 60min冷冻离心， ， 沉淀收集透析48h， 每隔 6h 换液一次， 产物冷冻干燥处理， 收集产物， 即得修饰载体材料。 0042 精密称取该载体材料， 采用离子凝胶法制备纳米粒， 将冻干的 CRGDYC-6-O 羧化壳 聚糖溶于去离子水中， 配成1.5mgml的CRGDYC-。

21、6-O-羧化壳聚糖溶液并调节其PH至7.0 左右， 移取 5ml, 磁力搅拌下加入 100ug 的盐酸阿霉素， 超声溶解。再将一定浓度的氯化钙 溶液加入迅速滴入上述溶液中， 持续搅拌 20min, 澄清的溶液出现乳光， 既得盐酸阿霉素 CRGDYC-6-O-CMC纳米粒混悬液。 将混悬液16000rpm转30min,收集沉淀物， 冷冻干燥， 即得 纳米粒。以类似的方法不加盐酸阿霉素， 即得空白纳米粒。 0043 将该载体进行体外细胞实验评价， 分别对空白载体和载药载体进行评价， 见附图 5， 6。该实验结果表明该载体空白载体无细胞毒性， 载盐酸阿霉素的 CRGDYC-6-O-CMC 纳米 粒对。

22、人的乳腺癌细胞具有最强的细胞毒性。 同时通过细胞摄取实验的定性和定量的考察该 载体的靶向性， 实验结果见附图 7,8。该实验结果表明， CRGDYC 修饰的壳聚糖纳米材料具有 优良的主动靶向性。 0044 实施例 2 0045 精密称取 6- 羧甲基壳聚糖 50.0mg， 溶于 100ml 水中， 搅拌使其充分溶解， 加入 4mg 的EDC.HCL， 搅拌15min， 随后加入16mg的CRGDYC多肽， 在30条件下搅拌45min， 搅拌后加 入 0.1mol L 的盐酸调节 pH 使产物析出， 3000rpm、 90min 冷冻离心， ， 沉淀收集透析 48h， 每隔 6h 换液一次， 产。

23、物冷冻干燥处理， 收集产物， 即得修饰载体材料。 0046 精密称取该载体材料， 采用离子凝胶法制备纳米粒， 将冻干的 CRGDYC-6-O 羧化壳 聚糖溶于去离子水中， 配成 2mg ml 的 CRGDYC-6-O- 羧化壳聚糖溶液并调节其 PH 至 7.0 说 明 书 CN 103816547 A 8 6/6 页 9 左右， 移取 5ml, 磁力搅拌下加入 150ug 的盐酸阿霉素， 超声溶解。再将一定浓度的氯化钙 溶液加入迅速滴入上述溶液中， 持续搅拌 40min, 澄清的溶液出现乳光， 既得盐酸阿霉素 CRGDYC-6-O-CMC纳米粒混悬液。 将混悬液16000rpm转30min,收。

24、集沉淀物， 冷冻干燥， 即得 纳米粒。以类似的方法不加盐酸阿霉素， 即得空白纳米粒。 0047 实施例 3 0048 精密称取6-羧甲基壳聚糖25mg， 溶于180ml水中， 搅拌使其充分溶解， 加入5mg的 EDC.HCL， 搅拌 20min， 随后加入 26mg 的 CRGDYC 多肽， 在 25条件下搅拌 60min， 搅拌后加 入 0.1mol L 的盐酸调节 pH 使产物析出， 3000rpm、 70min 冷冻离心， ， 沉淀收集透析 48h， 每隔 6h 换液一次， 产物冷冻干燥处理， 收集产物， 即得修饰载体材料。 0049 精密称取该载体材料， 采用离子凝胶法制备纳米粒， 将。

25、冻干的 CRGDYC-6-O 羧化壳 聚糖溶于去离子水中， 配成 3mg ml 的 CRGDYC-6-O- 羧化壳聚糖溶液并调节其 PH 至 7.0 左右， 移取 5ml, 磁力搅拌下加入 200ug 的盐酸阿霉素， 超声溶解。再将一定浓度的氯化钙 溶液加入迅速滴入上述溶液中， 持续搅拌 30min, 澄清的溶液出现乳光， 既得盐酸阿霉素 CRGDYC-6-O-CMC纳米粒混悬液。 将混悬液12000rpm转45min,收集沉淀物， 冷冻干燥， 即得 纳米粒。以类似的方法不加盐酸阿霉素， 即得空白纳米粒。 说 明 书 CN 103816547 A 9 1/6 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 103816547 A 10 2/6 页 11 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103816547 A 11 3/6 页 12 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103816547 A 12 4/6 页 13 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103816547 A 13 5/6 页 14 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103816547 A 14 6/6 页 15 图 10 说 明 书 附 图 CN 103816547 A 15 。