一种生物芯片基底技术领域
本发明涉及生物芯片领域，具体涉及生物芯片基底，特别涉及到适合于原位合成
的生物芯片基底。
技术背景
生物芯片技术在疾病诊断、药物开发、转基因分析、毒理分析等领域的研究取得了
很大的进展。基因芯片一般通过两种方法得到，一种是将预先合成的探针链通过点样技术
固定在固体基片而成。点样法不需要使用复杂的设备，但要求合成大量的探针，实验成本比
较高，同时反应位点探针的均一性也是难于解决的问题。另外一种则是通过平行原位合成
技术制备，原位合成法不仅能克服点样法这些缺点而且能避免cDNA芯片制备时需要的大量
克隆的问题。Affymetrix公司的光脱保护法是高密度芯片制备中的典型代表，为生物样本
高通量分析提供重要的手段。
生物样本中的DNA浓度一般比较低，在实施杂交检测之前，需要对样本中的DNA靶
序列进行PCR扩增放大，耗时耗力，很难实现样本的快速诊断；需要使用贵重的PCR扩增仪，
增加检测成本；同时，扩增的失败或副产物的扩增可能导致假阴假阳性结果的出现。因此，
高灵敏度的芯片检测技术一直是人们的研究目标。靶标分子捕获能力的提高，是提高检测
灵敏度，简化生物样本检测的重要途径之一，微纳技术在这方面起到了很重要的积极作用。
纳米颗粒基底的引入，不仅提高了反应位点的探针密度，同时也可以进一步修饰，为探针提
供了一个更接近溶液的杂交环境，有利于检测灵敏度的提高。现有的灵敏度放大技术主要
是通过点样技术把预合成的探针固定在微纳结构表面制备芯片。如能利用微纳技术制备出
适于原位合成反应制备基因芯片的基底，实现探针在反应位点的高密度固定，将大力提高
芯片检测的灵敏度，进一步凸显原位合成的优点。现有的微纳结构的构成有两种方式一种
是直接将玻片浸入TiO2或者SiO2溶胶中，匀速提拉干燥焙烧之后获得表面粗糙有凸起的涂
膜结构，结构比较稳定牢固，但对比表面积的提升不够，为了解决这个问题，也有提出直接
将纳米颗粒共价结合到平面基底(如CN201410224306)，但发明人研究发现现有技术的这类
方法制备基底的稳定性不高，耐受不了生物芯片原位反应修饰过程中的超声洗涤等操作。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种不但可有效增加了反应位点的探针密度，且基底修
饰层稳定性好，可以有效的耐受超声洗涤操作的纳米颗粒修饰的生物芯片基底。
为了实现本发明的目的，发明人作了多次尝试，经过很多次的失败后，无意中发现
本发明的以下技术方案可以很好的实现本发明的目的。
一种生物芯片基底，包括基板，由含氟硅烷自组装修饰的基板，含氟硅烷与氨基化
纳米颗粒作用形成基板上的纳米颗粒修饰层。
发明人通过研究发现由本发明方案所得到的生物芯片基底含氟硅烷的氟烷基为
长链层含有大量C-F键，每个-F都可与氨基形成氢键；但同时也形成了一个类似于“绒毛层”
的结构，每根绒毛都有很多可抓住氨基化纳米硅球的触手，可以牢固地把氨基化纳米硅球
固定住，可以很好的提高稳定性。
含氟硅烷的碳原子数不低于3，优选6-18。
所述的基板的材质可以是平整的玻璃、陶瓷、硅片、金属或聚合物。
所述的氟烷基化硅烷可以是全氟辛基三乙氧基硅烷、全氟辛基三甲氧基硅烷、全
氟癸基三乙氧基硅烷、全氟癸基三甲氧基硅烷全氟癸基甲基二氯硅烷、全氟辛基甲二氯硅
烷、三氟丙基三甲氧基硅烷、三氟丙基三乙氧基硅烷、全氟庚基丙基三甲氧基硅烷、全氟庚
基丙基三乙氧基硅烷、全氟丁基丙基三甲氧基硅烷、全氟丁基丙基三乙氧基硅烷中的一种
或几种。
所述的纳米颗粒可以是化学惰性的陶瓷、金属、金属氧化物、非金属氧化物或聚合
物纳米颗粒。
所述的化学惰性为能耐受生物芯片制备过程中使用的酸、碱和/或有机溶剂等的
侵蚀。
所述的纳米颗粒优选的直径为10～500nm。
本发明的制备方法是：首先通过化学氧化或等离子处理，在平整的基板上衍生出
氨基或羟基；接着用含氟硅烷溶液处理氨基或羟基化的基板，得到含氟硅烷自组装修饰的
的基板；随后将所述的基板浸泡在氨基化的纳米颗粒溶液中反应，将所得氨基化纳米颗粒
修饰的基板经过超声处理，去除物理吸附的纳米颗粒，得到密集稳定的具有纳米颗粒修饰
层的生物芯片基底。
本发明的生物芯片原位合成基底，由一平整基板上组装功能化纳米颗粒组构成。
如图1所示，氨基化纳米颗粒沉积在基板表面，通过氨基与基板表面氟烷基的相互作用，形
成密集稳定的纳米颗粒修饰膜。
使用本发明的芯片基底，纳米颗粒牢固结合在平整基板上，可以耐受生物芯片原
位合成过程中的高强度超声洗涤等操作，稳定性好。组装的氨基化纳米颗粒密集度高，其上
固定分子探针制备生物芯片，可以有效提高反应位点的探针密度，提高芯片探针对靶标分
子的捕获能力，从而降低对样本靶标含量的要求，有利于提高芯片的检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明的氨基化纳米颗粒在平板基底结合示意图，小圆圈代表氟原子，箭头
代表可能形成的氢键；
图2为本发明的纳米颗粒组装过程及组装原理及结果图；
图3为常规共价结合的纳米颗粒在平板基底上共价结合示意图，三角形代表环氧
基，箭头代表可能形成的共价键；
图4为氨基化纳米硅球沉积玻片超声处理前(a)、后(b)的SEM照片，图(a)、(b)中的
左右两边分别是氟烷基修饰诱导沉积区及共价键合修饰沉积区。
图5为本发明的芯片基底原位标记荧光试剂罗丹明B与平面玻璃芯片基底原位标
记荧光试剂罗丹明B的荧光扫描结果对比。(a)氨基化纳米颗粒沉积玻片的荧光扫描图；(b)
氨基化平面玻片荧光扫描图；(c)荧光强度分析结果对比。
具体实施方式
本发明的生物芯片基底，通过在平整的基板上组装氨基化纳米颗粒组成。如图1所
示，基板常规基因芯片载玻片，通过含氟烷基自组装反应衍生出氟烷基修饰层；纳米颗粒为
化学惰性的氨基化二氧化硅纳米颗粒；氨基化纳米颗粒沉积在基板表面，通过氨基与基板
表面氟烷基的相互作用，形成密集稳定的单层纳米颗粒修饰膜。
通过法制备二氧化硅纳米颗粒，并对其进行修饰，得到氨基化的二氧化硅
纳米颗粒；通过自组装技术得到全氟硅烷偶联剂修饰的玻璃基底；氨基化二氧化硅纳米颗
粒表面氨基与玻片表面修饰的全氟硅烷偶联剂之间存在氢键作用，诱导氨基化的二氧化硅
纳米颗粒在全氟硅烷偶联剂修饰的玻璃表面沉积，得到纳米微球功能化芯片基底，修饰过
程如图2所示
实施例1：
功能化的纳米粒子具体制备方法为，在50ml烧瓶中加入1.6ml去离子水、15ml无水
乙醇和1.6ml浓氨水，在40-45℃下搅拌30min。调节磁力搅拌器转速至500转/分钟，一次性
快速加入2ml正硅酸乙酯，继续搅拌2min后，调低转速至200转/分钟。在40-45℃下低速搅拌
4h。超声处理1h，静置24h。4000转速离心，真空干燥箱50℃干燥，得到粒径为200nm左右表面
氨基化的纳米二氧化硅。
常规载玻片通过Piranha溶液(浓硫酸与30％的双氧水的混合物，体积比为3比1)
浸泡1小时，蒸馏水洗涤，丙酮洗涤，氮气吹干；将玻片浸没于2％(体积百分数)全氟癸基甲
基二氯硅烷的异辛烷溶液中反应20分钟，玻片先后用甲苯和正己烷各冲洗3次；得到全氟硅
烷偶联剂自组装单层膜，如图2b所示；将氨基化的核壳型纳米颗粒分散在甲苯中，将上述玻
片浸入该甲苯溶液中，静置20小时，将玻片至于甲醇中超声3分钟，扫描电镜分析如图2d所
示，可见获得了纳米颗粒较均匀沉积的玻璃基底。
实施对比例2：
本例对比常规在基板上通过共价结合固定的纳米粒子与本发明的纳米粒子固定
方法的耐受力。常规载玻片通过Piranha溶液(浓硫酸与30％的双氧水的混合物，体积比为3
比1)浸泡1小时，蒸馏水洗涤，丙酮洗涤，氮气吹干；将光刻胶均匀旋涂整块玻片，置于干燥
箱中60度热处理30min，95度热处理30min；用遮光掩模板遮挡一半玻片，在紫外灯下曝光
20min；之后浸没于2.38％四甲基氢氧化铵中5min，去离子水冲洗，吹干备用。将玻片置于
2％(体积百分数)全氟癸基甲基二氯硅烷的异辛烷溶液中反应20min，玻片先后用甲苯和正
己烷各冲洗3次；用丙酮冲洗掉玻片上的光刻胶，将玻片至于丙酮溶液中超声20min，吹干；
进一步将玻片置于5％(体积百分数)的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的三氯甲烷溶
液中50℃隔夜反应20h；三氯甲烷超声10分钟，干燥，得到一半为全氟硅烷偶联剂自组装，一
半为3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷自组装的单层膜；将氨基化的核壳型纳米颗粒分
散在甲苯中，将上述玻片浸入该甲苯溶液中，静置20小时，从溶液中拿出，依次用甲苯、甲
醇、双蒸水和甲醇洗涤，氮气吹干，得到左边为氨基化纳米颗粒在氟烷基修饰表面沉积(原
理如图1所示)，右边为氨基纳米颗粒在烷氧基修饰表面沉积(原理如图3所示)的基底，所得
纳米颗粒修饰基底的扫描电镜结果如图4a所示；进一步将玻片置于甲醇中超声处理3分钟，
扫描电镜结果图如图4b所示。
对比图4可知，氨基化纳米硅球在玻片全氟癸基三氯硅烷修饰区域沉积得比3-(2,
3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰区域密集得多，并且在经过超声清洗后全氟癸基三氯
硅烷修饰区域的硅球仍然牢固结合在玻片表面；而在3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷
修饰区域，硅球“星星点点”沉积于其中，经过超声后，硅球全部脱离。出现这种结果的原因
可能是3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰羟基区域后，其单层的环氧基位点与纳米
硅球氨基形成的共价键不足以在超声环境下固定200nm以上的硅球。而全氟癸基三氯硅烷
修饰区域形成的氟烷基(-(CF2)9CF3)长链层含有大量C-F键，每个-F都可与氨基形成氢键。
这就类似于一个“绒毛层”，每根绒毛都有很多可抓住氨基化纳米硅球的触手，可以牢固地
把氨基化纳米硅球固定住，显示出比常规共价修饰的优势。
实施对比例3：
本例利用本发明的芯片基底，通过原位反应，在氨基化纳米颗粒阵列上进行荧光
原位标记，得到荧光分子标记的阵列，其基本操作与原位合成芯片阵列一致，只是采用纳米
颗粒修饰基底代替未经纳米颗粒修饰的平面玻璃基底。本实施例使用罗丹明B异氰酸酯标
记阵列的制备为例进行说明，并与未经纳米颗粒修饰的平面玻璃基底进行比较。
配制0.05M的罗丹明B异硫氰酸的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液含通过点样方法，在
实施例1中所得到的纳米颗粒修饰基底以及未经修饰的平面玻璃基底点样得到罗丹明B异
硫氰酸阵列，30min后用N,N-二甲基甲酰胺溶液冲洗，并将玻片置于DMF、甲醇、二氯甲烷中
各超声洗涤5min，GenePix 4000B生物芯片扫描仪扫描(参数设置：分辨率10um，激光强度
100％，PMT 600，激发波长532nm，荧光波长635nm)，得到荧光分析结果如图5所示。
氨基化的平面玻片基底标记荧光扫描结果如图5a所示，共8行4列，对每一行样点
内取样分析，样点荧光强度均值在3000-4500以内(图5c)，比较均匀，可见通过该方法成功
进行了原位标记反应。二氧化硅纳米颗粒修饰的玻片标记荧光扫描图如图5b所示，点阵各
处的扫描亮度较均衡，同一个样点内的荧光强度差异较小。同样对每一行样点内取样分析，
样点的荧光强度均值分布在30000-45000范围内(图5c)，偏差在4000以内，相对偏差在10％
以内，说明氨基化效果均衡；该方法修饰每个样点的荧光强度是常规平面基底的10倍以上，
可见该方法氨基化效率高。说明相对于在平整玻片上氨基化，本发明的氨基化硅球修饰的
玻片能显著提升单位基底面积的氨基密度。同时在荧光标记过程中，经历了生物芯片原位
合成所需要的偶联及高强度清洗过程，可见氨基化纳米二氧化硅修饰的玻片是一种高质量
的芯片基底。