本发明是关于肿瘤坏死因子生成的抑制剂，以及将经脂多糖刺激的巨噬细胞或单核吞噬细胞用于制备这些抑制剂的方法，以及这些抑制剂作为治疗和预防由肿瘤坏死因子引起的疾病的应用。 炎症反应是免疫机制的过度表达，这种机制的存在本来是为了保护宿主机体的。最近几年已经明白，由宿主形成的蛋白质可能以游离形式引起炎症终末介质的释放，从而产生疾病症状。这种激素样蛋白质称作组织介素（Gupta，Scand J Rheumatol Suppl.，（1988）76，189）。现已确定，组织介素对于炎症过程的发展是至关重要的。
在组织介素中，肿瘤坏死因子（TNF）对于急性炎症的发生尤其重要，因为这种物质（主要由巨噬细胞产生）能导致哺乳动物处于菌血症和脓毒症特有的休克状态（Tracey等，Science，234，（1986），470）。进一步的发现表明，抗TNF单克隆抗体可降低患细菌性脓毒症的猴子的死亡率（Tracey等，Nature，330，（1987），662）。这些发现清楚地表明，TNF对于内毒素休克的许多特征的发生是充分且必要的因子。
这种内源性TNF生成与急慢性炎症之间的明确联系已导致许多尝试，即用药理学抑制剂来阻断内源性TNF的生成。可以举出用甾体、黄嘌呤衍生物和脂氧酶抑制剂进行治疗的实例（Zabel等，Lancet，23，（1989），1474）。另一事实是组织介素IL4（白细胞介素4）也是一种TNF生成的抑制剂（Essner等，J.Lmmunol.142，（1989），3857）。
本发明之目的是寻找可以抑制内源性TNF生成地新的生理学抑制剂。
令人惊奇地发现，巨噬细胞或单核吞噬细胞能够产生TNF生成的抑制剂。
因此，本发明是关于：
1.肿瘤坏死因子生成的抑制剂（以下称TIM），它们可通过来自对脂多糖耐受的脊椎动物的巨噬细胞或单核吞噬细胞的培养获得。
2.以1项表征的抑制剂的制备方法，其特征是对脂多糖耐受的脊椎动物的巨噬细胞或单核吞噬细胞进行培养，然后再加入脂多糖。
3.以1项表征的抑制剂的应用，即制备用来治疗或预防由肿瘤坏死因子引起的疾病的药物。
脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的成分。它由类脂A和各种多糖组成，因细菌种类不同而包含各种糖的成分。LPS作为一种内毒素，可导致发热、白细胞减少和增多，产生兔体内局部施瓦茨曼反应。例如，脂多糖可用酚-水法从弗里德瑙沙门氏菌中提取出来，冷冻干燥并转变为三乙胺盐形式（Galanos等，Zentralbl Bakteriol.Parasitenkd.Infektionskd.Hyg.Abt.1：Orig Reihe A：243，（1979），226）。肿瘤坏死因子（TNF）是一种特别是由巨噬细胞产生的组织介素，具有溶解某些转化细胞素的活性。
IL4是一种B细胞生长因子，它的作用是活化巨噬细胞，分子量为15，000-20，000。IL6是一种B细胞分化因子，它以杂交瘤细胞系的生长因子发挥作用，分子量为22，000-34，000。
本发明的TNF抑制剂是一种产品，其特征概括如下：
-分子量为40，000-80，000
-通过巨噬细胞抑制TNF的合成
-不象白细胞介素6那样作为杂交瘤细胞系的生长因子发挥作用。
例如，抑制剂可以由对脂多糖耐受的脊椎动物的巨噬细胞产生。合适的例子是从对脂多糖耐受的NMRI小鼠或C3H/HeJ小鼠中获得巨噬细胞（NMRI表示海军医学研究院）。而且，人的单核吞噬细胞也可用于产生本发明的抑制剂。
本发明的抑制剂的最佳制备方法是先在脊椎动物身上诱发对LPS的耐受性。例如可选用NMRI雌性小鼠（6-8周，Lippische Versuchstieranstalt，Dextertal，德国），通过腹腔注射含大约80微克LPS的200微升无热原的缓冲液，从而产生对LPS的耐受性，注射用LPS系用酚-水法从弗里德瑙沙门氏菌中获得。96小时后，小鼠则处于对LPS耐受状态，此种状态由下法显示，每只小鼠注射2毫克LPS后，耐受小鼠无一死亡。而正常小鼠的LD100为0.7毫克。
按文献所示方法从LPS耐受小鼠中获得腹膜巨噬细胞（Conrad，Manual of macrophage methodology.Herscowitz等编（1981））。把游离的巨噬细胞转移至无菌的培养容器中，用哺乳动物细胞、细胞系和组织培养物的培养基，在CO2的培养箱中培养2-3小时。除去培养基，用缓冲液洗去未附着的细胞，再加入新鲜培养基，用LPS进行刺激。
下文中所述的LPS总量指用酚-水法从弗里德瑙沙门氏菌中获得的。巨噬细胞用1-100微克LPS/毫升基质诱导，最好用5-60微克/毫升。巨噬细胞置于37℃、8%CO2的CO2培养箱中培养。巨噬细胞将本发明的抑制剂释放到周围基质中，诱导15至36小时抑制剂浓度达到最大。从基质中除去巨噬细胞，例如用离心或过滤的方法。而本发明的抑制剂仍留在基质中，可采用浓缩蛋白质的常规方法得到。文献中报导的培养细胞系的其它方法同样可用。已经证明，第一次合成TIM后，用LPS再次诱导巨噬细胞，用新鲜培养基重新产生TIM，这种方法具有优越性。这样，观察TIM的产生可持续一周多。
此外，TIM也可由C3H/HeJ小鼠的巨噬细胞产生（Bomholtgard有限公司，丹麦）。这种情况下无需对小鼠进行LPS处理。将腹膜巨噬细胞游离，再用LPS诱导，然后按用NMRI小鼠所述的方法把TIM分离出来。
本发明的抑制剂的另一种制备方法是由人的单核吞噬细胞获得。此法的最佳方法是先在受试者身上产生对LPS的耐受性。例如，为达到这个目的，可以静注100毫微克的马流产沙门氏菌。诱导3天后，抽取50毫升血液，按文献方法从中得到单核吞噬细胞（单核细胞）。细胞可例如用Percou梯度法分离。游离的单核细胞（1×106个细胞/毫升基质）置于文献所述的哺乳动物细胞、细胞系及组织培养物的培养基中，在常规条件下培养2-3小时。用LPS诱导抑制剂的合成。所用LPS的浓度为1-100微克/毫升基质，最好为5-60微克/毫升。将LPS加入基质中，单核细胞在与LPS-耐受小鼠的巨噬细胞相同的培养条件下进行培养，然后把TIM分离出来。
抑制剂通过巨噬细胞对TNF合成的影响可以证明它的特有作用。本发明的抑制剂的作用效果可通过如细胞株RAW264.7（美国菌种收藏所71TIB（ATCC），Maryland，美国）加以确定。这种细胞株在LPS刺激后可生成TNF。含TIM的溶液可抑制这种细胞株TNF的生成。
实施例1
NMRI雌性小鼠（6-8周，Lippische Versuchstieranstalt，Dextertal，德国），腹腔注射约含80微克LPS的200微升无热原的缓冲液，从而产生对LPS的耐受性。注射所用的LPS用酚-水法从弗里德瑙沙门菌中获得。96小时后，小鼠处于LPS耐受状态，此种状态由下法显示，每只小鼠注射2毫克LPS后，耐受小鼠无一死亡。而正常小鼠的LPS的LD100
为0.7毫克。从LPS耐受小鼠上获取腹膜巨噬细胞。为此将小鼠用CO2杀死，固定于软木盘上，喷以70%的酒精。然后，在无菌工作台上，将小鼠的腹部皮肤切开，腹腔内注射5毫升的灌流液（Iscove氏基质+2.5单位/毫升的肝素;Sigma）。小心地按摩该充满的小鼠腹部，从而使粘着于组织的细胞脱落下来。用一根无菌巴氏移液管将含有细胞的液体抽吸出来。
用移液管将含107个细胞的液体移至细胞培养皿中，在培养基上培养（Iscove氏基质，2小时，37℃，8%CO2）。为了纯化被各种细胞类型污染的巨噬细胞培养物，将上清液从附着的细胞上除去，再将细胞用缓冲液洗两遍，每次10毫升（37℃），加入10毫升新鲜的Iscove氏基质。然后在每毫升基质中加入50微克/毫升的LPS。
所用的LPS是用酚-水法从弗里德瑙沙门氏菌中分离出来的。巨噬细胞在37℃、8%CO2的CO2培养箱中培养。巨噬细胞将本发明的抑制剂释放到周围介质中。诱导15-36小时后抑制剂达到最大浓度。将细胞培养物上清液离心（1000×g）。巨噬细胞沉降下来，抑制物仍留在基质中。由TIM对细胞株RAW264.7（ATCC 71 TIB）的TNF产生的作用测定生成的TIM的浓度。基质中所含抑制剂的量使RAW264.7合成的TNF下降到对照组的30%。
TNF的诱导：将RAW264.7细胞移至充满Iscove氏基质的微滴度皿上（含10%胎牛血清（FCS）的Iscove氏基质;Gibco/BRL，Eggenstein，联邦德国）。将细胞浓度调至约1×106个细胞/毫升基质。2小时后，用缓冲液洗涤细胞，并覆盖上新鲜介质，加入200毫微克LPS/毫升，在TIM存在下培养。采用无血清的Iscove’s基质。经18小时培养后，取出上清液，在测定TNF前于-70℃下保存。
TNF的测定：TNF系用ATCC纤维细胞L929株生物检测法测定。将此细胞移入盛有100微升的培养基质（RPMI1640+10%FCS+5微克/毫升放线菌素，Gibco）的96眼平皿（2×104个细胞/眼;平底）。细胞在37℃含5%CO2的空气中培养4小时。然后将待测样品的系列稀释液各取100微升移至细胞上。此混合物在同样条件下培养18小时，然后在每100微升培养基中加入10微升的含有5毫克/毫升 MTT的溶液（MTT＝3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑鎓溴化物;溶于缓冲液中;Sigma，Deisenhofen），再培养4小时。
此后弃去上清液，加入100微升的0.04N Hcl异丙醇溶液。剧烈振摇后，用ELISA读数仪（MR700，Dynatech厂）在570毫微米处测定其吸收度。用下式计算样品的TNF滴度：
%细胞毒性＝ (A对照-A稀释)/(A对照) ×100
A对照是对照样的吸收度。A稀释是含TNF稀释液的吸收度。一个单位的TNF定义为有50%的细胞溶解时的稀释度的倒数。
实施例2
诱导作用的剂量依赖性
从实施例1所述的LPS耐受小鼠制备腹膜巨噬细胞（1×106个细胞/毫升），加入不同剂量的LPS进行体外培养（18小时，37℃，8%CO2）。测定所得上清液的抑制剂活性。
为了以好的收率（与对照样相比，45±4.90%TNF合成受到抑制，n＝5，p＜0.026）获得本发明的抑制剂（TIM），LPS耐受小鼠的巨噬细胞需要至少50微克/毫升的LPS进行体外刺激。从巨噬细胞培养物中获得的TIM（用5微克/毫升LPS刺激）使释放的TNF从660单位/毫升下降到511±43单位/毫升（＝对照组的78±6%，n＝2）。对照组的TNF活性为660单位/毫升TNF。
实施例3
在C3H/HeJ小鼠的巨噬细胞中诱导本发明的抑制剂
通过由遗传决定的LPS耐受性，对LPS低反应的亲缘C3H/HeJ小鼠（Bomholtgard有限公司，丹麦）进行辨别。从C3H/HeJ小鼠制备腹膜巨噬细胞，加入不同浓度的LPS（0.5微克/毫升和50微克/毫升），体外培养18小时（1×106/毫升，37℃，8%CO2）。操作程序与实施例1中耐受小鼠的巨噬细胞相同。此操作程序完成后，检测重新溶解的冻干品的活性。以LPS（200微克/毫升）刺激的RAW264.7细胞分泌TNF为3050单位/毫升（对照组）。表1显示C3H/HeJ小鼠产生少量的TIM。LPS的体外刺激可大大增加TIM的合成。
表1：C3H/HeJ小鼠的培养物上清液的
TNF抑制活性的诱导
鼠种 LPS 细胞数 TNF滴度
（微克／（×106） （单位／毫升）
毫升）
------------------------------------------------------------
NMRI 50 3.0 300
NMRI 50 1.0 100
NMRI 50 0.5 400
C3H/HeJ 0 3.0 2100
C3H/HeJ 0 1.0 2300
C3H/HeJ 0 0.5 2100
C3H/HeJ 5 3.0 800
C3H/HeJ 5 1.0 800
C3H/HeJ 5 0.5 1100
C3H/HeJ 50 3.0 335
C3H/HeJ 50 1.0 398
C3H/HeJ 50 0.5 335
------------------------------------------------------------
实施例4
人外周单核细胞的TIM
将两名受试者经内毒素处理（马流产沙门氏菌的LPS，每人100毫微克（ng））3天后，取血共50毫升，用此制备单核吞噬细胞（即单核细胞）。该单核细胞通过粘附纯化，并在无血清基质中用LPS刺激（20小时，50微克/毫升，37℃，8%CO2）。象小鼠巨噬细胞中所述的一样，从上清液制备粗提物，并检测其中的TIM的活性。此步骤是在人单核细胞培养物和经LPS刺激的RAW细胞培养液中合成TNF。如表2所示，从内毒素（hTIM）处理后的受试者而得到的LPS刺激单核细胞，它所产生的部分纯化的上清液，可抑制人单核细胞培养物中的TNF的合成（hMφ+LPS：870±64单位/毫升，hM∮+LPS+hTIM：230±42单位/毫升）。如果用小鼠TIM（如实施例1所述制备），可发生对TNF程度相同的合成抑制（hM∮（人）+LPS+mTIM（鼠）：190±53单位/毫升）。另一方面，hTIM也可抑mM∮的合成，其作用程度与mTIM相同（mM∮+LPS：1026±132单位/毫升，mM∮+LPS+hTIM：98±24单位/毫升，mM∮+LPS+mTIM：134±16单位/毫升）。
由此可见，从用内毒素预处理的人体中所获得的单核细胞可以合成TIM。关于它们的抑制TNF生成的生物活性，hTNF和mTNF具有交叉反应。
表2：人和鼠TIM对人单核细胞和RAW264.7
细胞合成TNF的作用
培养 TNF（单位/毫升）
hM∮ 44+26
hM∮+LPS 870+64
hM∮+LPS+hTIM 230+42
hM∮+LPS+mTIM 190+53
实施例5
由小鼠腹膜巨噬细胞获得的TIM的纯化
含抑制剂的上清液可用超滤法进行浓缩，同时保留其生物活性。耐受的、LPS刺激的腹膜巨噬细胞培养物的上清液（如实施例1中制备：1×106/毫升，50微克/毫升的弗里德瑙沙门氏菌，37℃，8%CO2），通过排阻限为10KD的膜过滤。当样品体积浓缩到原来的10%时，则停止过滤。留置物和滤液用过滤法灭菌，取100微升的留置物或1毫升的滤液，在RAW细胞培养物上检测TIM的活性。在留置物中恢复了生物活性，即RAW264.7细胞（其培养基中含有10%的浓缩细胞培养物上清液）经LPS刺激，仅分泌出LPS-刺激RAW细胞所分泌的TNF的17.8±11.5%（n＝6），后者释放1142±87单位/毫升TNF（n＝6）。含有抑制剂的浓缩上清液中，含有大量的脂多糖，它可用多粘菌素B-琼脂糖（Sigma）亲合层析法除去。将2毫升的多粘菌素B-琼脂糖放于0.2微米的圆形过滤器的膜上，用15毫升无热原的水洗涤，然后将含LPS的留置物层析分离，流速约1毫升/分。经多粘菌素亲合层析所获得的物质具有抑制剂活性，可使RAW细胞的TNF合成抑制71%（1×106个细胞，100微升洗脱液，200毫微克/毫升弗里德瑙沙门氏菌，18小时，37℃，8%CO2）。
多粘菌素B-琼脂糖的层析处理后，在水中透析，当培养基所含酚红消失时则停止透析。将透析物冷冻干燥。冻干物具有抑制活性。冻干品在新鲜基质中可使RAW细胞TNF的合成下降为LPS刺激对照组的18±6%（n＝5，P＜0.009）。
含TIM的物质可进一步用交联葡聚糖S-200凝胶进行层析分离（磷酸缓冲液0.5毫摩尔/当量+NaCl 0.2摩尔/当量，3毫升/小时）。
主要在层析分离的第6份液中发现有生物活性：正好100微升（相当于总体积的10%）可抑制约86%TNF的释放（RAW264.7，1×106+200毫微克/毫升LPS+100微升TIM：152单位/毫升TNF）。用比较SDS凝胶电泳法测得分子量为40，000-80，000。
实施例6
对弗波醇酯诱导的TNF合成的抑制
弗波醇酯（PMA）和干扰素（IFN-r，Amersham，德国）联合诱导TNF的合成。RAW264.7细胞（1×106/毫升）分别与LPS（10微克/毫升）和干扰素-r（50单位/毫升）一起，以及与各种浓度的弗波醇酯（500毫微克/毫升，100毫微克/毫升和20毫微克/毫升）和干扰素-r（50单位/毫升）一起培养（18小时，37℃，8%CO2）。在LPS/干扰素-r刺激下和与PMA/干扰素-r一起培养时，RAW264.7细胞均产生TNF（LPS/IFN-r：2450±274单位/毫升TNF＝100%，n＝4;500毫微克/毫升PMA/50单位/毫升IFN-r：1460±60单位/毫升TNF（n＝2），＝60±2.5%的LPS/IFN-r诱导产生的数量）。PMA/INF-r培养产生的TNF量具有剂量依赖性：100毫微克/毫升PMA/50单位/毫升IFN-r时释放1140±213单位/毫升（＝LPS/IFN-r对照组的47±4.6%，n＝2），20毫微克/毫升PMA/50单位/毫升IFN-r时释放680±164单位/毫升TNF（＝LPS/IFN-r对照样的28±7%）。
为了研究TIM对PMA/IFN诱导产生TNF的作用，将RAW细胞在有抑制剂时与PMA/IFN-r一起培养（1×106/毫升，18小时，37℃，8%CO2）。本发明的抑制剂对LPS/IFN-r及PMA/IFN-r-诱导的TNF合成和释放都有抑制作用。当抑制剂抑制LPS/INF-r-诱导释放TNF达到LPS对照组的70%到29±6%（n＝2;p＜0.08）时，其所用抑制剂的量对PMA/IFN-r刺激释放TNF的抑制作用则为90%到10±4%，达到40单位/毫升TNF（n＝5，p＜0.04）。
实施例7
对巯基乙酸酯诱导的腹膜巨噬细胞的TNF合成的抑制作用
巯基乙酸酯诱导的腹膜巨噬细胞与LPS和不同数量的抑制剂一起培养18小时（1×106毫升;200毫微克/毫升LPS：37℃，8%CO2）。抑制剂用量相当于耐受小鼠分泌：1×107/毫升（＝TIM 1），5×106/毫升（＝TIM2）;2.5×106/毫升（＝TIM 3）和5×105/毫升（＝TIM4）腹膜巨噬细胞的量。本实验也采用冻干制品，在培养基中重新溶解，冻干品是由耐受小鼠的LPS-刺激腹膜巨噬细胞的上清液而来的。LPS在这些细胞中诱导产生TNF（6700单位/毫升）。在抑制剂的影响下，培养物上清液中可测得的TNF的量以所用抑制剂量的函数关系下降：混合物TIM1的抑制剂浓度和TIM 2的浓度可使TNF的释放下降至＜40单位/毫升（＜LPS对照组的1%，n＝4，p＜0.04）。2.5×106个腹膜巨噬细胞的产物使TNF生成减少至1440±100单位/毫升TNF（相当于21±1.4%，n＝2，p＞0.15）;5×105个腹膜巨噬细胞的产物则可使TNF释放下降至34±4.6%（2260±310单位/毫升TNF，p＞0.22）。
实施例8
TIM 无IL 6活性
取实施例5中经G200层析法分离的具有的TIM生物活性的组份6的一定量，检查它是否具有白细胞介素6（IL6）的生物活性。所取的体积量为它能抑制70%TNF合成（用RAW细胞检验其合成）。该体积量在一系列稀释液（1∶2）中，与杂交瘤细胞株B13.29的细胞（由L.Aarden博士提供，输血站中心实验室，P.O.Box9406，1006AK Amsterdam，荷兰）放在96眼微滴度皿中，加入100微升细胞培养基（Iscove氏基质，含有牛血清蛋白、铁传递蛋白、大豆脂、β-巯基乙醇。Boehringer，Mannheim提供的现成溶液），37℃，8%CO2下培养48小时。对照组采用经一系列不同浓度的重组体IL6（IC Chemikalien，慕尼黑）处理的B13.29培养物。细胞的染色和测定在实施例1中已述。IL6的绝对含量可通过一系列的IL6的浓度相比较而得。实验表明，B13.29细胞不能被由巨噬细胞上清液所得的具有TIM活性的该组份刺激生长，该巨噬细胞的上清液是培养物中加入了重组体IL6所得到的。显然，试验的这份样品中不含IL6，TIM不是IL6。