丝氨酰组氨酸、磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸用作核酸切割剂 本发明涉及丝氨酰组氨酸、磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸用作核酸切割剂的新用途，属生物技术领域。
DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是生物体的遗传物质。对其结构和功能的研究，是分子生物学研究的主要内容之一。要研究核酸结构与功能的关系，就需要对核酸进行各种操作，如对核酸链的切割与连接等。而对核酸链的切割是核酸操作过程中必不可少的过程。目前，用以核酸链切割的核酸切割剂的种类有从生物体中分离的各种天然核酸酶或人工合成的模拟核酸酶以及其他种类的化学试剂。在此，将能够以任何方式断裂核酸链的试剂统称为核酸切割剂。列述如下：
(1)天然核酸酶，即天然存在的具有水解核酸磷酸二酯键功能的酶。
其中限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，其识别序列一般为4或6个碱基对的回文结构，切割产生的片段较短，不易得到完整地基因片段。其它的核酸内切酶和外切酶切割产生的核酸片段则更短。因此，现有的天然核酸酶不能满足研究基因时需定点切割以得到大片段基因簇的要求。
(2)金属及其络合物
a、以自由基机理切割核酸的切割剂：其中包括EDTA-Fe(II)，Cu(II)-硫醇，1，10-二氮杂菲-Cu(I)，抗坏血酸-Cu(II)，Cu(II)-Gly-Gly-His，CNBr-甲基硫醚，Mn(II)-甲基肼，等。这类切割剂是通过产生自由基而断裂核酸链，会产生活性自由基，本身就会造成对生物体的伤害，不能用于基因治疗。
b、以酯基转移反应机理切割核酸的切割剂：其中包括Zn(II)、Cu(II)、Co(III)以及三价镧系金属离子，即(La，Ce，Eu，Gd，Tb，Lu)的胺类络合物。虽然单纯的Lna+可以有效促进RNA的切割，但是，必需精心选择合适的配体才能得到有催化活性的金属络合物。另一方面，配体必需是热力学稳定的，又要求在动力学上是惰性的，以防止金属离子的释放。另外，金属络合物同样需要与识别系统偶联才能达到定点切割的目的。因此，要使金属离子能够结合在与合适的识别剂相连的配基上，仍然是一关键。若将金属络合物用于生理条件下的治疗，就更为严格。
c、以水解磷酸二酯键机理切割核酸的切割剂：其中包括Co(III)、Ln(III)等。目前报道的都需要较高的温度。
(3)含咪唑基的化合物
这类切割剂主要是利用咪唑基作为一般酸碱催化剂达到水解RNA的目的。但不适合用于切割DNA。
本发明的目的是将已有的丝氨酰组氨酸、磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸用于核酸切割。天然核酸酶本身数量有限，作用后产生的片段太小；以及以上所述的化学切割剂在应用上存在种种不足，本发明根据天然核酸酶活性中心对核酸的切割机理，利用天然氨基酸、小肽及其衍生物所具有的活性基团，以水解机理切割核酸，从而获得与天然酶解产物相同的水解末端，为应用于分子生物学提供可行性。另外，为了应用于基因治疗、抗病毒、抗肿瘤等，本发明使用的天然氨基酸、小肽及其衍生物，不会带来毒副作用。
本发明的内容是根据天然酶活性中心的结构，设计并合成具DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)切割功能的化合物，属于生物高技术探索领域。本发明采用丝氨酰组氨酸(Ser-His二肽)，磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸的组氨酸溶液切割DNA及RAN。
1、Ser-His切割DNA及RNA
将Ser-His溶于无菌高纯水，配成溶液。将此溶液与切割底物混合，被切割的核酸即切割底物为双链线状DNA(本发明中选用λDNA)、超螺旋质粒DNA(本发明中选用pUC8及pBR322质粒DNA)、RNA(本发明中选用poly和UpolyA)。以20mM(毫摩尔/升)的伯瑞坦-罗比森(Britton-Robison)(由磷硫、乙酸、硼酸组成，其浓度分别为0.04M)缓冲液作为缓冲体系，用氢氧化钠调pH值在4.0-9.0的范围。Ser-His的终浓度为1-200毫摩尔/升(mM)，底物的终浓度为0.05-50mM(按单个碱基的浓度计算)。将Ser-His与底物的混合物置于10-80℃下保温，保温0-96h取出，即完成对底物的切割。将切割后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，RNA采用紫外分光光度法检测，其结果如下：在30℃以下切割现象不明显；37℃时，5mM的Ser-His在保温24h后即有明显的切割现象。随着温度提高或Ser-His浓度的提高，切割速度加快；在50℃保温4h，就有明显的切割现象。在上述pH值范围内，Ser-His都有切割活性。在pH值为7左右时，切割速度最快。
2、磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸切割DNA及RNA
本发明的磷酰化丝氨酸为N-O，O-二异丙基磷酰化丝氨酸(DIPP-Ser)、N-O，O-二正丁基磷酰化丝氨酸(DBP-Ser)和N-O，O-二甲基磷酰化丝氨酸(DMP-Ser)。本发明的磷酰化苏氨酸为N-O，O-二异丙基磷酰化苏氨酸(DIPP-Thr)、N-O，O-二正丁基磷酰化苏氨酸(DBP-Thr)。用无菌高纯水配制浓度为280mM的饱和组氨酸溶液，将切割剂即磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸溶于其中，配成溶液。将该溶液与被切割的核酸即切割底物混合，切割底物为双链线状DNA(本发明中选用λDNA)、超螺旋质粒DNA(本发明中选用pUC8质粒DNA)、RNA(本发明中选用酵母tRNA)，以组氨酸作为缓冲体系，将pH值调整在7.5左右，组氨酸缓冲液的浓度范围为10-280mM。切割剂的终浓度为0.5-200mM，底物的终浓度为0.05-50mM(按单个碱基的浓度计算)。将切割剂、组氨酸与底物的混合物置于10-80℃下保温，保温0-96h取出即完成底物切割。对切割后的溶液，进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如下：在37℃保温24h，0.5mM的DIPP-Ser即对λDNA有明显的切割现象；可将超螺旋DNA切成线状；将酵母tRNA切成碎片。随着温度提高或磷酰化丝氨酸浓度增大，切割速度加快。
本发明发现了Ser-His、磷酰化氨基酸可以切割DNA及RNA。是一类新的核酸切割试剂。将其与核酸识别系统偶联，可以成为核酸定点切割试剂，用作分子生物学研究的人工工具酶以及基因治疗药物。本发明的切割剂可以在较宽的温度和pH范围内切割核酸，应用范围更广。由于磷酰化氨基酸、小肽可自身活化，发生多种仿生化反应-磷上酯交换，自成肽、成酯、磷酰基N→O转位等。其反应活性受侧链官能团的精密调控，反应类型随磷酰基、氨基酸及反应介质、温度、pH值的变化而变化。因而它们具有酶性特征。
实施例：
1、用Ser-IIis(丝氨酰组氨酸)在水溶液中切割线状双链DNA：Ser-His的使用浓度为5mM，7.5mM，15mM，20mM；作用底物为λDNA，底物浓度为0.15mM(以碱基对计)，反应温度为37℃，反应体系的pH值为7.0，反应时间为0-96h。切割结果由琼脂糖凝胶电泳检测。保温48h后，4种浓度均可见明显的切割现象，并且随浓度的增加或保温时间的延长，切割程度逐渐增加。
切割活性与pH值的关系：实验采用的pH值为pH4.98，pH6.05，pH6.3，pH6.7，pH7.0，pH8.0，保温时间为50h。在pH7左右，切割速度最快。
切割活性与温度的关系：实验采用的温度为-20℃，10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃。在pH6.7的Briton-Robison缓冲液中保温45h，切割结果由琼脂糖凝胶电泳检测。温度升高，切割速度加快。30℃以下保温45h，切割不明显。40℃保温45h，有明显的切割现象。50℃时，保温4h，即可见切割现象；保温8h，切割现象明显。
2、用Ser-His在水溶液中切割超螺旋质粒DNA：Ser-His的使用浓度为10mM，20mM，作用底物为pBR322质粒DNA、pUC8质粒DNA，底物浓度为0.20mM(以碱基对计)，反应温度为37℃，反应体系的pH值为7.0，反应时间为0-96h。切割结果由琼脂糖凝胶电泳检测，对于pBR322DNA，保温24h，即可见明显的切割现象；对于pUC8DNA，24h后大部分超螺旋形式已切成线状形式，48h后已全部切成线状，72h后可见由线状切成小片段。Ser-His浓度增加，切割速度加快。
由1、2可见，Ser-His浓度增加，切割速度加快；反应温度提高，切割速度加快；Ser-His在一定的pH范围内对双链DNA都有切割作用。除了实验1和2中的条件之外，Ser-His还有可能在类似条件下(比如在同样pH值下改变缓冲体系)对DNA和RNA有切割活性。
3、用Ser-His在水溶液中切割RNA：Ser-His的使用浓度为10mM，作用底物为polyA和polyU，底物浓度为0.06mM(以碱基计)，反应温度为37℃，反应体系的pH7.0，反应时间为0-60h。由于核酸被切割后紫外吸收会增加，切割结果由紫外分光光度法检测。将吸光度对保温时间作图，可得一近似直线，增加值为3.6×10-3/h。
4、用N-DIPP-Ser(N-O，O-二异丙基磷酰化丝氨酸)的组氨酸溶液切割线状双链DNA：N-DIPP-Ser的使用浓度0.1mM、0.2mM、0.6mM、0.9mM、1.3mM，组氨酸的使用浓度为200mM-280mM，作用底物为λDNA，底物的浓度为0.2mM(以碱基对计)，反应温度为37℃，反应pH7.5，反应时间为24h。切割结果由琼脂糖凝胶电泳检测，各浓度的N-DIPP-Ser都有切割现象，随着浓度的增加，切割程度明显增加，切割产生的片段逐渐减小。DBP-Ser、DMP-Ser的切割条件同DIPP-Ser。在同样浓度时切割活性大小顺序为DIPP-Ser＜DBP-Ser＜DMP-Ser。
5、用N-DIPP-Ser(N-O，O-二异丙基磷酰化丝氨酸)的组氨酸溶液切割超螺旋质粒DNA：N-DIPP-Ser的使用浓度1.1mM，3.3mM，组氨酸的使用浓度为200mM-280mM，作用底物为pUC8质粒DNA，底物浓度为0.2mM(以碱基对计)，反应温度为37℃，反应pH7.0，反应时间为24-48h。切割结果由琼脂糖凝胶电泳检测，48h后3.3mM的DIPP-Ser已全部将超螺旋形式的DNA切成线状形式。DBP-Ser、DMP-Ser的切割条件同DIPP-Ser。在同样浓度时切割活性大小顺序为DIPP-Ser＜DBP-Ser＜DMP-Ser。
6、用N-DIPP-Ser(N-O，O-二异丙基磷酰化丝氨酸)的组氨酸溶液切割RNA：N-DIPP-Ser的使用浓度为0.5mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM，2.5mM；组氨酸的使用浓度280mM，作用底物为酵母RNA，底物浓度为0.5mM(以碱基计)，反应温度为37℃，反应体系的pH7.5，反应时间为17.5h。切割结果由琼脂糖凝胶电泳检测，与对照相比，五种浓度下都有切割，并且随着DIPP-Ser浓度的增加，切割程度逐渐增强。DBP-Ser、DMP-Ser的切割条件同DIPP-Ser。在同样浓度时切割活性大小顺序为DIPP-Ser＜DBP-Ser＜DMP-Ser。
由4、5、6可见，DIPP-Ser、DBP-Ser、DMP-Ser在组氨酸溶液中可以切割双链DNA以及RNA。并且随浓度的增加，切割速度加快；提高温度，切割活性提高。
7、用N-DIPP-Thr的组氨酸溶液切割超螺旋质粒DNA以及线状双链DNA：N-DIPP-Thr的使用浓度为0.5mM，1mM，3mM，5mM，10mM，组氨酸的使用浓度为20mM-280mM，作用底物为pUC8质粒DNA、λDNA，底物浓度为0.2mM(以碱基对计)，反应温度为37℃，反应pH7.5，反应时间为24h。切割结果由琼脂糖凝胶电泳检测，24h后10mM的DIPP-Thr已全部将超螺旋形式的DNA切成线状形式。并且随着DIPP-Thr浓度的增加，切割速度加快。对于线状的λDNA，保温24h后可见明显的切割现象。DBP-Thr的切割条件同DIPP-Thr。在同样浓度时切割活性大小顺序为DIPP-Thr＜DBP-Thr。并且随着磷酰化苏氨酸浓度的增加，切割速度加快；提高温度，切割速度加快。