一种从藻类和真菌细胞中破壁提取DHA的方法 【技术领域】
本发明涉及一种从微生物中提取有效组分的方法，尤其是从藻类和真菌细胞中提取DHA(二十二碳六烯酸)的方法。
背景技术
藻类和真菌是生物圈中的重要组成部分，是水生生态系统中水产动物整个生长过程(或是特定发育阶段)的唯一饵料或是饵料生物的饵料，同时微藻和真菌接近植物种类，在种质、生化组成、代谢途径等方面具有多样性、复杂性和特殊性，因此这就决定其在食用、保健和药物等方面的价值。人类通过大量的培养微藻和真菌来开发人类所需的大量高附加值的生物活性产物，因此微藻和真菌在现代发酵工业中发挥着巨大的作用，很多抗生素、维生素、氨基杂环、多肽、蛋白酶、色素、脂类产物等特别是长链多不饱和脂肪酸均通过微生物进行发酵提取获得。
二十二碳六烯酸(DHA)作为一种多不饱和脂肪酸，其潜在的医用药用价值受到了世界的广泛关注，引起了食品、医药甚至化妆品等行业的高度重视。DHA的主要来源在海洋生物和微生物的微藻类及真菌中，从海洋生物提取DHA由于成本高，价格昂贵；而藻类和真菌来源广泛，成本低廉受到了研究者的青睐。
由于藻类和真菌的细胞壁组成和厚度差异比较大，所以传统上通常采用酸碱破壁，有机溶剂提取，如CN 200710025079.3专利申请中公开的，利用通过碱破壁隐甲藻后在将细胞机械破壁，然后对破碎的菌体采用有机溶剂萃取，获得DHA粗油。但是这类传统方法破壁率比较低、容易造成环境污染，且易破坏细胞内所需的提取产物，提取中采用有机溶剂萃取虽然提取得率比较高可以达到95％，但是也会影响最终产物的有机残留。还有另一种方法是采用蛋白酶进行破壁，但常常需要根据情况混合多种不同的蛋白酶才能起到破壁的效果，同时调整酶解条件成本比较高，效率也不高，不适合大规模生产使用。
【发明内容】
本发明的目的旨在于提供一种无需任何有机溶剂和化学药物的辅助，采用物理方法将藻类和真菌细胞破壁并提取胞内油脂产物DHA(二十二碳六烯酸)，适合于低成本的大规模生产。
本发明所说的方法如下：
1)将发酵结束后的微藻或真菌发酵液通过分离系统分离收集细胞，保持菌泥含水量在70～80％，用酸调节菌泥pH2.0～4.0，然后将菌泥在200～250rpm搅拌20～40min；
2)控制菌泥温度在10～20℃；
3)在菌泥中加入1～3％(重量比)的抗氧化剂；
4)将菌泥通过高压均质机进行高压均质破壁；
5)将破壁后的菌泥升温到80～90℃，然后按照重量比菌泥∶水＝1∶(1～3)从菌泥底部通过布气管加入80～90℃的水，在250～350rpm搅拌50～80min，将料液通过三相分离机分离得到DHA油脂。
上述所说的酸为盐酸、硫酸或柠檬酸。
上述所说的抗氧化剂为维生素E、天然迷迭香、抗坏血性酸棕榈酸酯中一种或其混合物。
上述高压均质破壁工作压力为20～30Mpa。
本发明克服了传统上必须进行干燥制成粉末才进行粉碎而且粉碎技术难以破碎藻类和真菌坚硬的细胞壁的技术屏障，实现了减低成本高效的破碎微藻和真菌的细胞壁。其具有以下特点：(1)为避免菌泥在高速碰撞或是高压压挤条件下，容易产生热量并提供菌泥温度，从而破坏胞内产物的生物活性，采用预先降温的手段将菌泥的温度减低到10～20℃，有效的控制了菌泥特别是胞内DHA油脂暴露在高温中，避免了因高温造成的生物活性成分分解或是失活。(2)预先添加了保护剂，在高压均质过程中，保护剂能够均匀有效的将破壁后的油脂或是颗粒包埋，形成有效的保护屏障，从而大大降低破壁后的胞内DHA油脂等不饱和脂肪酸与空气的接触，减少DHA油脂被氧化分解的可能性。(3)采用物理的提取方法，克服传统上有机溶剂带来的残留和爆炸隐患，提供一种全新的绿色无毒无残留的产品。
【具体实施方式】
下面通过实施例对本发明做进一步说明，藻类以双鞭甲藻为例，真菌以裂殖壶菌为例。
实施例1
1)将发酵结束后的裂殖壶菌发酵液通过压差加到卧式螺旋分离系统的储罐中，利用卧式螺旋分离系统分离收集裂殖壶菌细胞，保持菌泥含水量低于80％；然后将菌泥收集到一个带有冷却盘管和搅拌的储罐中，为保持料液有较好的流动性和除去细胞外围可溶性物质，利用盐酸调节菌泥pH3.0，为进一步为后续的处理提高破壁率，将调节好的菌泥在200rpm搅拌30min；
2)对储罐中已经调节好pH值的菌泥，通过在罐体的盘管中通入温度为10℃冷冻水进行冷却，等菌泥的温度降至15℃，关闭冷冻水进出口；
3)在高速搅拌的情况下，按照菌泥的重量比加入3％的抗氧化剂混合物(维生素E1％，天然迷迭香0.5％、抗坏血性酸棕榈酸酯1.5％)，混合均匀；
4)将菌泥打入均质机的桐体中，调节均质机的工作压力为30MPa，保持均质机的温度不得高于80℃，将菌泥进行连续均质破壁，破壁后的料液装入带有布气管道和盘管的储管中；
5)先将破壁后的裂殖壶菌菌泥升温到90℃，按照重量比菌泥∶水＝1∶2的比例从菌泥底部通过布气管加入80℃自来水，加完水后，在300rpm搅拌下维持1小时；将料液通过三相分离机分离得到DHA油脂，提取得率为90％。
实施例2
1)将发酵结束后的双鞭甲藻发酵液通过压差加到卧式螺旋分离系统的储罐中，利用卧式螺旋分离系统分离收集双鞭甲藻细胞，保持菌泥含水量在70％；然后将菌泥收集到一个带有冷却盘管和搅拌的储罐中，为保持料液有较好的流动性和除去细胞外围可溶性物质，利用柠檬酸调节菌泥pH2.0，为进一步为后续的处理提高破壁率，将调节好的菌泥在250rpm搅拌20min；
2)对储罐中已经调节好pH值的菌泥，通过在罐体的盘管中通入温度为10℃冷冻水进行冷却，等菌泥的温度降至20℃，关闭冷冻水进出口；
3)在高速搅拌的情况下，按照菌泥的重量比加入1％的维生素E，混合均匀；
4)将菌泥打入均质机的桐体中，调节均质机的工作压力为20MPa，保持均质机的温度不得高于80℃，将菌泥进行连续均质破壁，破壁后的料液装入带有布气管道和盘管的储管中；
5)先将破壁后的裂殖壶菌菌泥升温到80℃，按照重量比菌泥∶水＝1∶3的比例从菌泥底部通过布气管加入80℃自来水，加完水后，在300rpm搅拌下维持1小时；将料液通过三相分离机分离得到DHA油脂，提取得率为85％。