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1、(10)申请公布号 CN 103642936 A (43)申请公布日 2014.03.19 CN 103642936 A (21)申请号 201310535934.0 (22)申请日 2013.11.04 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 江苏和创生物科技有限公司 地址 212009 江苏省镇江市镇江新区南纬四 路 36 号 1 幢 416 室 (72)发明人 丁小静 其他发明人请求不公开姓名 (54) 发明名称 55型腺病毒的特异性检测用引物探针组合和 试剂。
2、盒 (57) 摘要 本发明涉及一种采用荧光 PCR 技术， 特异性 检测样品中 55 型腺病毒核酸存在的寡核苷酸序 列组合， 以及包括该组合的试剂盒。 该试剂盒能够 灵敏地检测并鉴别样品中存在的 55 型腺病毒核 酸， 其检测下限均为 20 拷贝每反应体系， 在疾病 监测、 临床诊断等领域具有重要的应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103642936 A CN 103642936 A 1/1 。
3、页 2 1. 一种用于特异性检测样品中 55 型腺病毒核酸的引物组合， 这套序列组合特征在于 包括下列引物 ： P1 ： 5-CAGGATGCTTCGGAGTACCT-3, P2 ： 5-CTTATTTCCCAGATTGAAGTAGGT-3。 2. 一种用于特异性检测样品中 55 型腺病毒核酸的引物和寡核苷酸探针组合， 其中引 物为权利要求 1 所述的引物， 寡核苷酸探针为 ： Probe1 ： 5-X1-CCGGGTCTGGTGCAGTTTGCC-Y1-3 ； X1为荧光报告基团， Y1为荧光淬灭基团。 3.如权利要求2所述， 这套序列组合特征还在于， 其中Probe1荧光报告基团X1为Fa。
4、m， 荧光淬灭基团 Y1为 Eclipse。 4. 如权利要求 2 所述， 这套序列组合特征还在于， 可用于单重实时荧光聚合酶链反应 检测， 即一个反应体系可检测出 55 型腺病毒核酸。 5. 一种用于特异性检测样品中 55 型腺病毒核酸的试剂盒， 其中包括 PCR 反应液、 酶混 合液、 阴性质控品和阳性质控品， 其特征在于 PCR 反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下 ： P1 ： 5-CAGGATGCTTCGGAGTACCT-3, P2 ： 5-CTTATTTCCCAGATTGAAGTAGGT-3。 6. 如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷 酸。
5、探针的序列如下 ： Probe1 ： 5-X1-CCGGGTCTGGTGCAGTTTGCC-Y1-3， X1为荧光报告基团， Y1为荧光淬灭基团。 7. 如权利要求 5 所述的的试剂盒， 其特征还在于 PCR 反应液中用于荧光信号监测的寡 核苷酸探针 ： 其中 Probe1 荧光报告基团 X1为 Fam， 荧光淬灭基团 Y1为 Eclipse。 8. 如权利要求 5 所述的的试剂盒， 其特征还在于 PCR 反应体系为 20l， 包括 2PCR 缓冲液 10 l、 10mmol/L dNTP 1.0l、 25mol/L 引物各 0.5 l、 10mol/L 探针 0.2 l、 热 启动 Taq 。
6、酶混合液 0.4l、 样品 DNA 2l， 加灭菌水至终体系 20 l。 9. 如权利要求 5 所述的的试剂盒， 其特征还在于 PCR 反应循环参数为 ： 94， 2min; 进入循环阶段 ： 94变性 10s， 56退火 50s， 72延伸 15s， 共反应 40 个 循环。 权 利 要 求 书 CN 103642936 A 2 1/4 页 3 55 型腺病毒的特异性检测用引物探针组合和试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种采用荧光PCR技术， 特异性检测样品中55型腺病毒核酸存在的寡 核苷酸序列组合， 以及包括该组合的试剂盒。 背景技术 0002 腺病毒是一种无包膜、 线状的双链 DN。
7、A 病毒， 对呼吸道、 胃肠道、 尿道和膀胱、 眼、 肝脏等均可感染。 0003 腺病毒引起的呼吸道感染暴发疫情在国内外时有报道， 主要发生于封闭环境内的 人群， 如寄宿制学校， 托幼机构。临床症状除发热、 寒战、 头痛、 咳嗽外， 常有明显的咽痛及 咽喉部溃疡 ； 在临床上， 腺病毒呼吸道感染分为以下几种类型 ： 急性发热性咽喉炎、 咽结膜 炎、 急性支气管炎和肺炎 4 中临床类型。 0004 目前， 腺病毒共有 55 型， 腺病毒 4、 7 和 21 型是部队入伍新兵及其他在封闭环境内 的人群， 如寄宿制学校、 托幼机构急性呼吸道疾病暴发的常见病原体， 55 型腺病毒在我国发 现， 是腺病。
8、毒 11 型与 15 型基因重组而成的新型病毒， 曾于 2006 年在我国北方学校学生群 体中引起呼吸道暴发疫情， 以轻型病例为主。 0005 在实验室检测中， PCR 法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和 血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于 PCR 方法来说， 引物的特异性是其检测的 特异性和敏感性的基础。本发明针对 55 型腺病毒特异的靶序列设计引物和 Taqman 探针， 利用 real-time PCR 的方法， 用来鉴别检测样品中 55 型腺病毒核酸， 可以快速获得特异性 检测结果。 发明内容 0006 为了更加准确地检测样品 55 型腺病毒核酸存在， 本发明提。
9、供一种特异性检测样 品中 55 型腺病毒的寡核苷酸序列组合和包含该组合的试剂盒， 其特征在于序列组合或试 剂盒的 PCR 反应液中用于核酸扩增的引物为 ： P1 ： 5-CAGGATGCTTCGGAGTACCT-3, P2 ： 5-CTTATTTCCCAGATTGAAGTAGGT-3。 0007 P1和P2为针对55型腺病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引 物。 0008 本发明的特征还在于， 序列组合或试剂盒的 PCR 反应液中用于荧光信号监测的寡 核苷酸探针为 ： Probe1 ： 5-X1-CCGGGTCTGGTGCAGTTTGCC-Y1-3。 0009 X1为荧光报告基团。
10、， Y1为荧光淬灭基团。Probe1 为针对 55 型腺病毒基因组特异 性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针。 0010 本发明的特征还在于， 试剂盒包括 PCR 反应液、 酶混合液、 阴性质控品和阳性质控 品。其中 PCR 反应液主要含有上述的引物和探针、 反应缓冲液、 Mg2+和 dNTP 等， 酶混合液主 说 明 书 CN 103642936 A 3 2/4 页 4 要含有热启动 Taq 酶， 阴性质控品为去离子水， 阳性质控品为含有检测靶序列的核酸。 0011 本发明的一优选实施方案为 ： 序列组合或试剂盒的 PCR 反应液中用于荧光信号 监测的寡核苷酸探针的荧光基团分， 其中 Pr。
11、obe1 荧光报告基团 X1为 Fam， 荧光淬灭基团 Y1 为 Eclipse。 0012 本发明的另一优选实施方案为 ： 试剂盒的 PCR 反应液包含上述特异性引物和特异 性探针， 属于实时荧光单重 PCR 检测， 可在同一个反应体系中对百 55 型腺病毒核酸进行检 测。 0013 本发明的另一优选实施方案为 ： 试剂盒的 PCR 反应循环参数为 94， 2min; 进入 循环阶段 ： 94变性 10s， 56退火 50s， 72延伸 15s， 共反应 40 个循环。 0014 本发明的另一优选实施方案， 试剂盒选用的PCR反应体系为20l， 包括2PCR缓 冲液 10 l、 10mmol。
12、/L dNTP 1.0l、 25mol/L 引物各 0.5 l、 10mol/L 探针 0.2 l、 热启 动 Taq 酶混合液 0.4l、 样品 DNA 2l， 加灭菌水至终体系 20 l。 0015 本发明提供的试剂盒对 55 型腺病毒核酸的检测下限为 20 个拷贝每反应体系。 0016 本发明分别根据 55 型腺病毒基因组保守区分别设计特异性引物和探针， 提供的 试剂盒可以检出55型腺病毒的核酸， 但不能检出非55型腺病毒病原体的核酸， 说明试剂盒 具有很好的特异性。 0017 本发明提供的试剂盒2小时内即可完成检测， 可为55型腺病毒的疾病监测和临床 诊断提供实验依据。 附图说明 00。
13、18 图 1 为单重实时荧光 PCR 检测 55 型腺病毒核酸灵敏度的扩增曲线图。从左至右 的 5 条曲线分别为 55 型腺病毒特异性 PCR 片段构建质粒梯度稀释 （105-101） 后扩增结果。 横坐标为反应循环数， 纵坐标为不同循环数荧光检测信号的 DRn 值。 图 2 为实时荧光单重 PCR 检测体系对 55 型腺病毒核酸检测特异性扩增曲线图。55 型 腺病毒出现 S 型扩增曲线， 而其他病原微生物质控菌均未出现 S 型扩增曲线。横坐标为反 应循环数， 纵坐标为不同循环数荧光检测信号的 DRn 值。 具体实施方式 0019 下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，。
14、 这里列出 的实施例仅仅为示例性说明的目的， 而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使 用的试剂盒、 缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂， 应理解， 本领域技术人 员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。 0020 1、 引物和 TaqMan 探针的设计与合成 利用 Blast 工具对 Genbank 和国内外文献中的所有的 55 型腺病毒基因组序列进行分 析， 分别选择其稳定的保守区域作为检测靶序列， 并针对这测靶序列设计和合成引物和探 针 （见表1） 。 引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成， 其中55型腺病毒的检测探 针 5 端标记 FAM 荧。
15、光基团， 3 端标记 Eclipse 荧光淬灭基团。 0021 2、 检测菌种的准备 本实施例中所使用的 55 型腺病毒以及其他阴性对照菌株 （腺病毒 3 型、 7 型、 流感病毒 说 明 书 CN 103642936 A 4 3/4 页 5 AH1N1、 AH3N2、 肺炎链球菌、 b 型流感嗜血杆菌、 肺炎支原体、 肺炎衣原体和卡他莫拉菌） 均购 买于中国药品生物制品检定所。 0022 3、 菌株 DNA 的抽提 选用 Qiagen 公司 QIAamp DNA Mini Kit（货号 ： 51306） 提取菌株 DNA。具体步骤试剂 盒参考操作说明书。 0023 4、 引物和探针的筛选 采。
16、用设计的引物和探针分别检测提取的 55 型腺病毒和阴性对照菌株细菌的基因组 DNA， 经反复实验， 筛选出灵敏度、 特异性和重复性最佳的引物探针组合 （见序列表， 55 型腺 病毒正向引物 p1、 反向引物 p2 和探针 probe1） 。 0024 5、 标准品的构建与制备 分别利用 p1、 p2 引物， PCR 扩增 55 型腺病毒特异性基因片段， 将 PCR 产物克隆至 pMD-18T 载体， 转化 DH5a 大肠杆菌， 利用碱裂解法提取阳性克隆质粒， 利用紫外可见分光光 度计分别测定在波长 260nm 处、 280nm 处 DNA 的吸光率， 然后计算质粒浓度与纯度。然后 10 倍梯度。
17、稀释至 10 个拷贝每微升。 0025 6、 反应条件优化 对引物、 探针、 酶等要素逐一优化， 确定的反应体系为 ： 2PCR 缓冲液 10 l、 10mmol/ L dNTP 1.0l、 25mol/L 引物各 0.5 l、 10mol/L 探针 0.2 l、 Takara 聚合酶混合物 0.4l、 模板 2ul， 加灭菌水至终体系 20 l。 0026 根据扩增片段长、 引物和探针的退火温度以及酶的特性， 主要对反应退火温度和 延伸时间进行了优化， 最终确定的循环参数为 ： 94， 2min; 进入循环阶段 ： 94变性 10s， 56退火 50s， 72延伸 15s， 40 个循环， 。
18、每个循环在退火阶段采集荧光信号。 0027 在扩增结束后按同一条件分析数据， 确定各样品的 Ct 值。 0028 7、 检测限的评价 以上述 5 中的阳性标准品评价本发明的提供的试剂盒的检测限， 阳性标准品浓 度为 ： 1105copies/l， 1104copies/l， 1103copies/l， 1102copies/l， 1105copies/l， 1105copies/l， 本发明提供的试剂盒对 55 型腺病毒核酸的检测下 限为 20 个拷贝每反应体系。 0029 8、 检测特异性的评价 以上述 2 中的菌株 DNA 为模板评价了本试剂盒的特异性。对 55 型腺病毒 DNA 进行检 。
19、测时均可见明确的扩增曲线， 对上述9种其他咽部常见病原微生物DNA检测时， 未产生阳性 扩增曲线， 说明我们使用的探针和引物与我们选定的其他菌株之间不存在交叉反应。 0030 尽管上文中以优选的方式， 通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方 式， 但是本领域技术人员应了解， 本发明并不限于上面所公开的实施方式， 而是可以根据本 发明所属技术领域的知识对其进行修改， 所作修改不会超出本发明要求保护的范围。 例如， 本发明所使用的荧光实时 PCR 也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧 光基团和荧光淬灭基团以外的标记物质， 如 Tet、 FAM、 HEX、 TAMRA、 ROX 。
20、、 Cy3、 TxRd、 JOE 等 标记物 ； 或使用Taqman技术之外的其他标记体系， 例如MGB探针、 分子信标MB探针、 蝎形探 针、 荧光双杂交探针等荧光探针标记技术 ； 或使用染料嵌合法如 SYBR Green I 等不饱和染 料与 LC Green 等饱和染料， 只要其使用了本发明所述的特异性引物序列， 即可定性或定量 说 明 书 CN 103642936 A 5 4/4 页 6 检测目的基因的存在， 进而特异性地检测 55 型腺病毒的存在。所以， 这些本领域技术人员 所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。 本发明的保护范围应由所附 的权利要求书所限定。 说 明。
21、 书 CN 103642936 A 6 1/1 页 7 江苏和创生物科技有限公司 55 型腺病毒的特异性检测用引物探针组合和试剂盒 3 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 primer_bind (1)(20) 根据基因组保守区设计的引物序列， 用于核酸扩增和检测。 1 caggatgcttcggagtacct 20 2 24 DNA 人工序列 primer_bind (1)(24) 根据基因组保守区设计的引物序列， 用于核酸扩增和检测。 2 cttatttcccagattgaagtaggt 24 3 21 DNA 人工序列 misc_binding (1)(21) 根据基因组保守区设计的探针序列， 用于核酸扩增和检测。 3 ccgggtctggtgcagtttgcc 21 序 列 表 CN 103642936 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103642936 A 8 。