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一种新型Β1,4甘露聚糖酶AUMAN26A的制备.pdf

  • 上传人:1520****312
  • 文档编号:5479314
  • 上传时间:2019-01-26
  • 格式:PDF
  • 页数:9
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  • 摘要
    申请专利号:

    CN201310666414.3

    申请日:

    2013.12.10

    公开号:

    CN103642826A

    公开日:

    2014.03.19

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情:

    发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 15/56申请公布日:20140319|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/56申请日:20131210|||公开

    IPC分类号:

    C12N15/56; C12N9/42; C12R1/66(2006.01)N

    主分类号:

    C12N15/56

    申请人:

    江南大学

    发明人:

    李剑芳; 赵梅; 王春娟; 董运海; 邬敏辰

    地址:

    214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号

    优先权:

    专利代理机构:

    代理人:

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    内容摘要

    本发明涉及一种来源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii E001的β-1,4-甘露聚糖酶基因的克隆方法,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1,命名为Auman26A。生物信息学分析表明该甘露聚糖酶属于糖苷水解酶第26家族,命名为AuMan26A,其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明还公开了AuMan26A基因在毕赤酵母中异源表达、活性测定及酶学性质的分析方法,制备的重组酶热稳定性极好,具有较大的工业化生产潜力和经济价值。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种来源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii E001的β-1,4-甘露聚糖酶基因Auman26A,其对应的核苷酸和蛋白质序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

    2.  Auman26A基因克隆、异源表达、活性测定及分析和酶学性质分析方法:
    (1)Auman26A基因的克隆:基于宇佐美曲霉与黑曲霉基因序列的相似性,参照NCBI上公布的A.nigerCBS513.88菌株基因组中推测的Man26A的基因序列(登录号:XM_001397260.1),结合生物信息学分析的手段,设计出一对扩增编码AuMan26A成熟肽cDNA的特异性上下游引物AuMan26A-F和AuMan26A-R:
    AuMan26A-F:5′-CTCGAGGCTTCCAACCAGACTCTGTCC-3′
    AuMan26A-R:5′-GAATTCTTAAGCCCCCTCCCAGTTCAG-3′
    以提取的A.usamii总RNA为模板、Oligo dT-Adaptor为引物,逆转录合成cDNA的第一条链;以所合成的链为模板、AuMan26A-F和M13primerM4为引物进行第一轮PCR,以第一轮PCR产物为模板、AuMan26A-F和AuMan26A-R为引物进行第二轮PCR,扩增出AuMan26A成熟肽的编码基因,将上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收、与pUCm-T连接(pUCm-T-Auman26A),转化E.coli JM109,蓝白斑筛选阳性转化子,送上海生工公司测序;
    (2)重组表达质粒pPIC9KM-Auman26A的构建:测序正确的重组质粒pUCm-T-Auman26A经Xho I和EcoR I双酶切,将目的基因克隆至能够实现天然N端表达的质粒pPIC9KM,转化E.coli DH5α,筛选重组表达质粒pPIC9KM-Auman26A并进行测序鉴定;
    (3)GS115/Auman26A重组子的构建、表达和酶学特性测定:测序正确的pPIC9KM-Auman26A质粒经Sal I线性化,按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选,得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Auman26A;按照手册上的标准流程进行诱导表达,用1.0%甲醇诱导72h;离心上清液为重组甘露聚糖酶粗酶液,经SDS-PAGE检测为单一条带,该酶的最适反应温度Topt为40℃;在80℃处理60min后残留酶活性为60%;90℃时的半衰期t1/290为15min,处理60min后残留酶活性为33%;其最适pH为5.5,在pH5.0~7.0的范围内较稳定;Mn2+、Ca2+、Cu2+和Sn2+对其有明显的抑制作用,其它所测金属离子和EDTA对其没有明显的影响;酶的最适底物为角豆胶,其对角豆胶的Km和Vmax值分别为4.48mg/mL和490.1U/mL。

    说明书

    说明书一种新型β-1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的制备
    技术领域
    本发明涉及一种来源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii E001的β-1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的基因的克隆、异源表达、活性测定及酶学性质的分析方法,属于生物工程技术领域。
    背景技术
    β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是内切β-1,4-甘露聚糖甘露糖苷水解酶的简称,能够随机催化甘露聚糖分子主链中β-1,4-D-甘露糖苷键的水解,是甘露聚糖降解酶系中最重要的组分,属于半纤维素酶类。它广泛存在于多种生物体内,在食品、医药、饲料、纺织、纸浆漂白、能源开发等众多领域具有重要的应用价值。基于一级结构的同源性和疏水簇分析,绝大多数β-甘露聚糖酶都属于糖苷水解酶(GH)第5或26家族。而GH5和GH26家族的β-甘露聚糖酶的活性位点作用模式不尽相同,从而表现出各自特异的生物学性质。近年来的研究表明GH26家族β-甘露聚糖酶在催化活性和热稳定性方面具有较为优良的特性,这为GH26家族β-甘露聚糖酶的深入研究提供了参考。自然界微生物中具有丰富的酶资源,利用生物信息学和基因组学相结合的方法从微生物中挖掘具有优良性状的新型酶是一条获取优良酶的有效途径。
    发明内容
    本发明的目的是提供一种来源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii E001的β-1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的基因克隆、异源表达及酶学性质的分析方法,为拓展β-甘露聚糖酶的研究领域奠定了理论基础,同时为其它新型酶的挖掘提供了新的策略。
    A.usamii E001菌株由江南大学筛选和保藏,已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vo1.31,No.4,Pg.50公开,本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。
    本发明的技术方案:基于NCBI上AspergillusnigerCBS513.88菌株的基因组序列,参照推测出的黑曲霉GH26家族β-甘露聚糖酶序列,借助RT-PCR技术从A.usamiiE001中克隆出AuMan26A的编码基因,通过pPIC9KM质粒在毕赤酵母GS115中实现了天然N端异源表达并检测其酶学性质。
    所述的一种源自宇佐美曲霉A.usamii E001菌株新型基因Auman26A对应的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
    所述的能够实现天然N端表达的质粒pPIC9KM已申请专利(专利申请号:201110410391.0)。
    所述的重组甘露聚糖酶的活性测定方法:
    采用改良的DNS试剂法,取2.4mL5mg/ml角豆胶溶液(pH5.5的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制)于40℃预热5min后加入0.1mL适当稀释的酶液,40℃下准确反应10min,加入2.5mL DNS试剂,沸水浴中显色7min,加入5mL去离子水混匀后测定O0540。在上述反应条件下,每分钟产生1μrnol还原糖(以甘露糖计)所需的酶量定义为1个酶活性单位(U)。
    所述的Auman26A基因克隆、异源表达:
    (1)AuMan26A成熟肽的编码基因的克隆:基于宇佐美曲霉与黑曲霉基因序列的相似性,参照NCBI上公布的A.niger CBS 513.88菌株基因组中推测的Man26A的基因序列(登录号:XM_001397260.1),结合生物信息学分析的手段,设计出一对扩增编码AuMan26A成熟肽cDNA的特异性上下游引物。
    AuMan26A-F:5′CTCGAGGCTTCCAACCAGACTCTGTCC-3′
    AuMan26A-R:5′-GAATTCTTAAGCCCCCTCCCAGTTCAG-3′
    以提取的A.usamii总RNA为模板、Oligo dT-Adaptor为引物,进行逆转录。以所合成的链为模板进行两轮PCR,扩增出AuMan26A成熟肽的编码基因。将上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收、与pUCm-T连接,转化E.coli JM109,蓝白斑筛选阳性转化子,送上海生工公司测序,获得重组质粒pUCm-T-Auman26A。
    (2)重组表达质粒pPIC9KM-Auman26A的构建:测序正确的重组质粒pUCm-T-Auman26A经Xho I和EcoR I双酶切,将目的基因克隆至能够实现天然N端表达的质粒pPIC9KM,转化E.coli DH5a,筛选并进行测序鉴定,获得的重组表达质粒为pPIC9KM-Auman26A(图1)。
    (3)GS115/Auman26A重组子的构建、表达及酶学特性的测定:测序正确的pPIC9KM-Auman26A质粒经Sal I线性化,按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选,得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Auman26A;按照手册上的标准流程进行诱导表达;发酵液经初步纯化后使用SDS-PAGE检测目的蛋白分子量;测定重组酶的酶学特性。
    所述的重组甘露聚糖酶酶学性质分析:
    (1)酶的最适反应温度及热稳定性:在不同温度(30~60℃)下测定酶活性。将酶液置于不同温度下保温0~60min,按标准方法测定残余酶活性,未处理酶液(0min)的酶活性以100%计。
    (2)酶的最适pH及pH稳定性:用不同pH值(pH2.5~8.0)、100mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制5mg/ml角豆胶溶液,按标准的方法测定reAuMan26A的活性。将酶液在不同pH值(pH2.5~8.0柠檬酸-Na2HPO4缓冲液)、40℃保温60min,测定残余酶活性。酶的pH稳定性定义为残余酶活性在85%以上的pH范围。
    (3)金属离子对酶活性的影响:将酶液与不同金属离子或EDTA溶液(终浓度为2.0mmol/L)混匀后于40℃保温1h后测定残余酶活性。以未加金属离子和EDTA的酶活性计为100%。
    (4)底物谱及动力学参数的测定:用缓冲液分别配制不同底物,测定重组酶对不同底物的活性。以不同浓度角豆胶溶液为底物,测定reAuMan26A的活性,采用Origin8.0软件进行非线性的拟合,计算出reAuMan26A的Km和Vmax值。
    本发明的有益效果:本发明提供了一种来源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii E001的
    β-1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的基因克隆、异源表达、活性测定及酶学性质的分析方法,其相应的基因为Auman26A,重组酶在80℃处理60min后残留酶活性为60%;90℃时的半衰期t1/290为15min,处理60min后残留酶活性为33%,热稳定性极高,为GH26家族β-甘露聚糖酶的深入研究奠定了理论基础,也为其它新酶基因的开发和进一步应用提供了新的策略。
    说明书附图
    图1:重组质粒pPIC9KM-Auman26A的构建示意图
    具体实施方式
    以下结合具体实施例,进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明,而不用于限制本发明的范围。
    实施例1基因Auman26A的克隆及其表达质粒的构建
    以提取的A.usamii总RNA为模板、Oligo dT-Adaptor为引物,逆转录合成cDNA的第一条链。以所合成的链为模板、AuMan26A-F和M13primerM4为引物进行第一轮PCR(94℃预变性2min;94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸90s,30个循环;72℃充分延伸10min)。以第一轮PCR产物为模板、AuMan26A-F和AuMan26A-R为引物进行第二轮PCR(94℃预变性4min;94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸90s,30个循环;72℃充分延伸10min),扩增出AuMan26A成熟肽的编码基因。将上述PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,割胶回收纯化,与pUCm-T连接,热激转化E.coli JM109感受态细胞,后涂布有IPTG和X-gal的平板进行蓝白斑筛选,将阳性转化子,送上海Sangon公司测序,获得重组质粒pUCm-T-Auman26A。测序正确的重组质粒pUCm-T-Auman26A经Xho I和EcoR I双酶切,与经相同双酶切的能够实现天然N端表达的质粒pPIC9KM连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选重组表达质粒pPIC9KM-Auman26A并进行测序鉴定。
    实施例2GS115/Auman26A重组子的构建、表达及酶活的测定
    pPIC9KM-Auman26A质粒经Sal I线性化,按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选,得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Auman26A。该工程菌用1.0%甲醇诱导72h。离心上清液后得重组甘露聚糖酶粗酶液,经SDS-PAGE检测为单一条带,该酶的最适反应温度Topt为40℃;在80℃处理60min后残留酶活性为60%;90℃时的半衰期t1/290为15min,处理60min后残留酶活性为33%;其最适pH为5.5,在pH5.0~7.0的范围内较稳定;Mn2+、Ca2+、Cu2+和Sn2+对其有明显的抑制作用,其它所测金属离子和EDTA对其没有明显的影响;酶的最适底物为角豆胶,其对角豆胶的Km和Vmax值分别为4.48mg/mL和490.1U/mL。


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    一种 新型 甘露 聚糖 AUMAN26A 制备
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