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1、(10)申请公布号 CN 103642826 A (43)申请公布日 2014.03.19 CN 103642826 A (21)申请号 201310666414.3 (22)申请日 2013.12.10 C12N 15/56(2006.01) C12N 9/42(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 李剑芳 赵梅 王春娟 董运海 邬敏辰 (54) 发明名称 一种新型-1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的 制备 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 一 种 来 源 于 宇 佐 。
2、美 曲 霉 Aspergillus usamii E001 的 -1, 4- 甘露聚糖 酶基因的克隆方法, 其核苷酸序列为 SEQ ID NO : 1, 命名为 Auman26A。生物信息学分析表明该 甘露聚糖酶属于糖苷水解酶第 26 家族, 命名为 AuMan26A, 其氨基酸序列为SEQ ID NO : 2。 本发明 还公开了 AuMan26A 基因在毕赤酵母中异源表达、 活性测定及酶学性质的分析方法, 制备的重组酶 热稳定性极好, 具有较大的工业化生产潜力和经 济价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知。
3、识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103642826 A CN 103642826 A 1/1 页 2 1. 一种来源于宇佐美曲霉 Aspergillus usamii E001 的 -1, 4- 甘露聚糖酶基因 Auman26A, 其对应的核苷酸和蛋白质序列分别为 SEQ ID NO : 1 和 SEQ ID NO : 2。 2.Auman26A 基因克隆、 异源表达、 活性测定及分析和酶学性质分析方法 : (1)Auman26A 基因的克隆 : 基于宇佐美曲霉与黑曲霉基因序列的相似性, 参照 NCBI 上公布的 A.。
4、nigerCBS513.88 菌株基因组中推测的 Man26A 的基因序列 ( 登录号 : XM_001397260.1), 结合生物信息学分析的手段, 设计出一对扩增编码 AuMan26A 成熟肽 cDNA 的特异性上下游引物 AuMan26A-F 和 AuMan26A-R : AuMan26A-F : 5 -CTCGAGGCTTCCAACCAGACTCTGTCC-3 AuMan26A-R : 5 -GAATTCTTAAGCCCCCTCCCAGTTCAG-3 以提取的 A.usamii 总 RNA 为模板、 Oligo dT-Adaptor 为引物, 逆转录合成 cDNA 的 第一条链 ; 。
5、以所合成的链为模板、 AuMan26A-F 和 M13primerM4 为引物进行第一轮 PCR, 以第一轮 PCR 产物为模板、 AuMan26A-F 和 AuMan26A-R 为引物进行第二轮 PCR, 扩增出 AuMan26A成熟肽的编码基因, 将上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测、 回收、 与pUCm-T连接 (pUCm-T-Auman26A), 转化 E.coli JM109, 蓝白斑筛选阳性转化子, 送上海生工公司测序 ; (2) 重组表达质粒 pPIC9KM-Auman26A 的构建 : 测序正确的重组质粒 pUCm-T-Auman26A 经 Xho I 和 EcoR I 双酶切。
6、, 将目的基因克隆至能够实现天然 N 端表达的质粒 pPIC9KM, 转化 E.coli DH5, 筛选重组表达质粒 pPIC9KM-Auman26A 并进行测序鉴定 ; (3)GS115 Auman26A 重 组 子 的 构 建、表 达 和 酶 学 特 性 测 定 : 测 序 正 确 的 pPIC9KM-Auman26A 质粒经 Sal I 线性化, 按照毕赤酵母表达手册进行电转、 筛选, 得到高拷贝 的毕赤酵母重组子GS115Auman26A ; 按照手册上的标准流程进行诱导表达, 用1.0甲醇诱 导72h ; 离心上清液为重组甘露聚糖酶粗酶液, 经SDS-PAGE检测为单一条带, 该酶的。
7、最适反应 温度 Topt为 40; 在 80处理 60min 后残留酶活性为 60; 90时的半衰期 t1 290为 15min, 处理 60min 后残留酶活性为 33; 其最适 pH 为 5.5, 在 pH5.0 7.0 的范围内较稳定 ; Mn2+、 Ca2+、 Cu2+和 Sn2+对其有明显的抑制作用, 其它所测金属离子和 EDTA 对其没有明显的影响 ; 酶的最适底物为角豆胶, 其对角豆胶的 Km和 Vmax值分别为 4.48mg mL 和 490.1U mL。 权 利 要 求 书 CN 103642826 A 2 1/3 页 3 一种新型 -1,4- 甘露聚糖酶 (AuMan26A。
8、) 的制备 技术领域 0001 本发明涉及一种来源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii E001的-1, 4-甘露聚 糖酶 (AuMan26A) 的基因的克隆、 异源表达、 活性测定及酶学性质的分析方法, 属于生物工 程技术领域。 背景技术 0002 - 甘露聚糖酶 (EC3.2.1.78) 是内切 -1, 4- 甘露聚糖甘露糖苷水解酶的简称, 能够随机催化甘露聚糖分子主链中 -1,4-D- 甘露糖苷键的水解, 是甘露聚糖降解酶系中 最重要的组分, 属于半纤维素酶类。 它广泛存在于多种生物体内, 在食品、 医药、 饲料、 纺织、 纸浆漂白、 能源开发等众多领域具有重要的应用价值。基。
9、于一级结构的同源性和疏水簇分 析, 绝大多数 - 甘露聚糖酶都属于糖苷水解酶 (GH) 第 5 或 26 家族。而 GH5 和 GH26 家族 的 - 甘露聚糖酶的活性位点作用模式不尽相同, 从而表现出各自特异的生物学性质。近 年来的研究表明 GH26 家族 - 甘露聚糖酶在催化活性和热稳定性方面具有较为优良的特 性, 这为 GH26 家族 - 甘露聚糖酶的深入研究提供了参考。自然界微生物中具有丰富的酶 资源, 利用生物信息学和基因组学相结合的方法从微生物中挖掘具有优良性状的新型酶是 一条获取优良酶的有效途径。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种来源于宇佐美曲霉 Aspergillus。
10、 usamii E001 的 -1, 4- 甘露聚糖酶 (AuMan26A) 的基因克隆、 异源表达及酶学性质的分析方法, 为拓展 - 甘露 聚糖酶的研究领域奠定了理论基础, 同时为其它新型酶的挖掘提供了新的策略。 0004 A.usamii E001 菌株由江南大学筛选和保藏, 已于 2005 年在 食品与发酵工业 杂 志的 Vo1.31, No.4, Pg.50 公开, 本发明人承诺该菌株在 20 年内向公众发放。 0005 本发明的技术方案 : 基于 NCBI 上 AspergillusnigerCBS513.88 菌株的基因组序 列, 参照推测出的黑曲霉GH26家族-甘露聚糖酶序列, 。
11、借助RT-PCR技术从A.usamiiE001 中克隆出 AuMan26A 的编码基因, 通过 pPIC9KM质粒在毕赤酵母 GS115 中实现了天然 N 端异 源表达并检测其酶学性质。 0006 所述的一种源自宇佐美曲霉 A.usamii E001 菌株新型基因 Auman26A 对应的核苷 酸和氨基酸序列分别为 SEQ ID NO : 1 和 SEQ ID NO : 2。 0007 所述的能够实现天然 N 端表达的质粒 pPIC9KM已申请专利 ( 专利申请号 : 201110410391.0)。 0008 所述的重组甘露聚糖酶的活性测定方法 : 0009 采用改良的 DNS 试剂法, 取。
12、 2.4mL5mg ml 角豆胶溶液 (pH5.5 的柠檬酸 -Na2HPO4 缓冲液配制 ) 于 40预热 5min 后加入 0.1mL 适当稀释的酶液, 40下准确反应 10min, 加 入2.5mL DNS试剂, 沸水浴中显色7min, 加入5mL去离子水混匀后测定O0540。 在上述反应条 件下, 每分钟产生 1rnol 还原糖 ( 以甘露糖计 ) 所需的酶量定义为 1 个酶活性单位 (U)。 说 明 书 CN 103642826 A 3 2/3 页 4 0010 所述的 Auman26A 基因克隆、 异源表达 : 0011 (1)AuMan26A 成熟肽的编码基因的克隆 : 基于宇佐。
13、美曲霉与黑曲霉基因序列的相 似性, 参照 NCBI 上公布的 A.niger CBS 513.88 菌株基因组中推测的 Man26A 的基因序列 ( 登录号 : XM_001397260.1), 结合生物信息学分析的手段, 设计出一对扩增编码 AuMan26A 成熟肽 cDNA 的特异性上下游引物。 0012 AuMan26A-F : 5 CTCGAGGCTTCCAACCAGACTCTGTCC-3 0013 AuMan26A-R : 5 -GAATTCTTAAGCCCCCTCCCAGTTCAG-3 0014 以提取的 A.usamii 总 RNA 为模板、 Oligo dT-Adaptor 为。
14、引物, 进行逆转录。以所 合成的链为模板进行两轮 PCR, 扩增出 AuMan26A 成熟肽的编码基因。将上述 PCR 产物经琼 脂糖凝胶电泳检测、 回收、 与 pUCm-T 连接, 转化 E.coli JM109, 蓝白斑筛选阳性转化子, 送 上海生工公司测序, 获得重组质粒 pUCm-T-Auman26A。 0015 (2) 重 组 表 达 质 粒 pPIC9KM-Auman26A 的 构 建 : 测 序 正 确 的 重 组 质 粒 pUCm-T-Auman26A 经 Xho I 和 EcoR I 双酶切, 将目的基因克隆至能够实现天然 N 端表 达的质粒 pPIC9KM, 转化 E.co。
15、li DH5a, 筛选并进行测序鉴定, 获得的重组表达质粒为 pPIC9KM-Auman26A( 图 1)。 0016 (3)GS115 Auman26A 重组子的构建、 表达及酶学特性的测定 : 测序正确的 pPIC9KM-Auman26A 质粒经 Sal I 线性化, 按照毕赤酵母表达手册进行电转、 筛选, 得到高拷 贝的毕赤酵母重组子 GS115 Auman26A ; 按照手册上的标准流程进行诱导表达 ; 发酵液经 初步纯化后使用 SDS-PAGE 检测目的蛋白分子量 ; 测定重组酶的酶学特性。 0017 所述的重组甘露聚糖酶酶学性质分析 : 0018 (1) 酶的最适反应温度及热稳定性。
16、 : 在不同温度 (30 60 ) 下测定酶活性。将 酶液置于不同温度下保温060min, 按标准方法测定残余酶活性, 未处理酶液(0min)的酶 活性以 100计。 0019 (2) 酶的最适 pH 及 pH 稳定性 : 用不同 pH 值 (pH2.5 8.0)、 100mmol L 柠檬 酸 -Na2HPO4缓冲液配制 5mg ml 角豆胶溶液, 按标准的方法测定 reAuMan26A 的活性。将 酶液在不同 pH 值 (pH2.5 8.0 柠檬酸 -Na2HPO4缓冲液 )、 40保温 60min, 测定残余酶活 性。酶的 pH 稳定性定义为残余酶活性在 85以上的 pH 范围。 002。
17、0 (3) 金属离子对酶活性的影响 : 将酶液与不同金属离子或 EDTA 溶液 ( 终浓度为 2.0mmol L) 混匀后于 40保温 1h 后测定残余酶活性。以未加金属离子和 EDTA 的酶活 性计为 100。 0021 (4) 底物谱及动力学参数的测定 : 用缓冲液分别配制不同底物, 测定重组酶对不 同底物的活性。以不同浓度角豆胶溶液为底物, 测定 reAuMan26A 的活性, 采用 Origin8.0 软件进行非线性的拟合, 计算出 reAuMan26A 的 Km和 Vmax值。 0022 本发明的有益效果 : 本发明提供了一种来源于宇佐美曲霉 Aspergillus usamii E。
18、001 的 0023 -1, 4- 甘露聚糖酶 (AuMan26A) 的基因克隆、 异源表达、 活性测定及酶学性质的 分析方法, 其相应的基因为Auman26A, 重组酶在80处理60min后残留酶活性为60; 90 时的半衰期 t1/290为 15min, 处理 60min 后残留酶活性为 33, 热稳定性极高, 为 GH26 家族 - 甘露聚糖酶的深入研究奠定了理论基础, 也为其它新酶基因的开发和进一步应用提供 说 明 书 CN 103642826 A 4 3/3 页 5 了新的策略。 0024 说明书附图 0025 图 1 : 重组质粒 pPIC9KM-Auman26A 的构建示意图 具。
19、体实施方式 0026 以下结合具体实施例, 进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详 细说明本发明, 而不用于限制本发明的范围。 0027 实施例 1 基因 Auman26A 的克隆及其表达质粒的构建 0028 以提取的A.usamii总RNA为模板、 Oligo dT-Adaptor为引物, 逆转录合成cDNA的 第一条链。以所合成的链为模板、 AuMan26A-F 和 M13primerM4 为引物进行第一轮 PCR(94 预变性2min ; 94变性30s, 52退火30s, 72延伸90s, 30个循环 ; 72充分延伸10min)。 以第一轮 PCR 产物为模板、 AuMa。
20、n26A-F 和 AuMan26A-R 为引物进行第二轮 PCR(94预变性 4min ; 94变性30s, 57退火30s, 72延伸90s, 30个循环 ; 72充分延伸10min), 扩增出 AuMan26A 成熟肽的编码基因。将上述 PCR 产物经 1琼脂糖凝胶电泳检测, 割胶回收纯化, 与 pUCm-T 连接, 热激转化 E.coli JM109 感受态细胞, 后涂布有 IPTG 和 X-gal 的平板进行 蓝白斑筛选, 将阳性转化子, 送上海 Sangon 公司测序, 获得重组质粒 pUCm-T-Auman26A。测 序正确的重组质粒 pUCm-T-Auman26A 经 Xho I。
21、 和 EcoR I 双酶切, 与经相同双酶切的能够实 现天然 N 端表达的质粒 pPIC9KM连接, 转化 E.coli DH5 感受态细胞, 筛选重组表达质粒 pPIC9KM-Auman26A 并进行测序鉴定。 0029 实施例 2GS115 Auman26A 重组子的构建、 表达及酶活的测定 0030 pPIC9KM-Auman26A 质粒经 Sal I 线性化, 按照毕赤酵母表达手册进行电转化、 筛 选, 得到高拷贝的毕赤酵母重组子 GS115 Auman26A。该工程菌用 1.0甲醇诱导 72h。离 心上清液后得重组甘露聚糖酶粗酶液, 经 SDS-PAGE 检测为单一条带, 该酶的最适。
22、反应温度 Topt为 40; 在 80处理 60min 后残留酶活性为 60; 90时的半衰期 t1 290为 15min, 处 理 60min 后残留酶活性为 33 ; 其最适 pH 为 5.5, 在 pH5.0 7.0 的范围内较稳定 ; Mn2+、 Ca2+、 Cu2+和 Sn2+对其有明显的抑制作用, 其它所测金属离子和 EDTA 对其没有明显的影响 ; 酶的最适底物为角豆胶, 其对角豆胶的 Km和 Vmax值分别为 4.48mg mL 和 490.1U mL。 说 明 书 CN 103642826 A 5 1/3 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 103642826 A 6 2/3 页 7 0003 序 列 表 CN 103642826 A 7 3/3 页 8 序 列 表 CN 103642826 A 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103642826 A 9 。